一种基于一测多评定量法和指纹图谱的舒血宁注射液质量控制方法与流程

本发明涉及一种基于一测多评定量法和指纹图谱的舒血宁注射液质量控制方法。

背景技术：

舒血宁注射液，扩张血管，改善微循环。用于缺血性心脑血管疾病，冠心病，心绞痛，脑栓塞，脑血管痉挛等。原料为银杏叶，辅料为：葡萄糖、乙醇，每2ml舒血宁注射液中含有银杏叶提取物为7.0mg，其中含总黄酮醇苷1.68mg；含银杏叶内酯0.28mg。

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国最近几年也明确把指纹图谱作为混合物群的质量控制方法。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一种成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当的反映中药内在的质量。从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。

《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》要求将指纹图谱检测指标及持续性要求作为质量标准单列项目，是对现行中药质量控制标准的有益补充。

一个理想的指纹谱图不仅能达到定性鉴别的目的，色谱图中大部分药谱理应达到基线分离，对大部分成分应可进行定量分析。在没有对照品的情况下，也可以已知标准品针对其他未知或无标准品的色谱峰进行定量。因此，中药指纹图谱是对现行中药质量标准控制方法的提高。

目前对舒血宁注射液中黄酮醇苷类化合物质量标准的研究，仅停留在采用酸水解，测定槲皮索、山柰素、异鼠李素3个含量，折算成总黄酮醇苷的含量的方法上，对于黄酮醇苷类原型成分的控制为空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种测定舒血宁注射液中黄酮醇苷类化合物含量的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种对舒血宁注射液中黄酮醇苷类化合物含量的测定方法的评价方法。

本发明还有一个目的在于提供一种舒血宁注射液指纹图谱测定方法。

本发明的一个技术方案提供了一种测定舒血宁注射液中黄酮醇苷类化合物含量的方法，该方法使用的对照品包括：芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)。

本发明的测定舒血宁注射液中黄酮醇苷类化合物含量的方法，该方法包括下述步骤：

(1)对照品溶液的制备：分别精密称取芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，作为对照品溶液；

(2)高效液相色谱检测：分别精密吸取舒血宁注射液与对照品溶液各5-25μl，注入高效液相色谱仪；

其中，所述的液相色谱检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸水溶液为流动相b，梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相a、b的比例变化为：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速0.5-1.5ml/min，检测波长为360nm，柱温45-48℃。

优选地，其中所述的分别精密吸取舒血宁注射液与对照品溶液各10μl。

优选地，其中所述的流速1.0ml/min，检测波长为360nm，柱温48℃，理论板数按芦丁峰计算应不低于10000。

优选地，其中所述的色谱柱为inertsilods-3c18，250×4.6mm、5μm柱；phenomenexgeminic18，5μm、110a、4.6×250mm；inertsilods-3，s-5μm、4.6×250mm中的一种。

黄酮醇苷类化合物含量结果：分别计算芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的总量(即计算6个黄酮醇苷的总量)以及山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)3者之和。

本发明的另一个技术方案提供了一种对舒血宁注射液中黄酮醇苷类化合物含量的测定方法的评价方法，该评价方法包括：依据相对保留时间确定黄酮醇苷类化合物的峰位置，结合峰面积与相对校正因子分别计算出各黄酮醇苷类化合物的含量。

本发明中的评价方法包括：相对校正因子重现性的考察和相对保留时间的考察。

本发明中所述的相对校正因子重现性考察包括：不同人员的考察、不同色谱柱的考察、不同仪器的考察。

本发明中相对校正因子的测定：多点相对校正因子的计算，分别精密吸取对照品溶液(含rutin0.1996mg/ml，kgr0.2184mg/ml，igr0.1757mg/ml，krg0.1085mg/ml，qrcg0.2258mg/ml，krcg0.2181mg/ml)2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，注入液相色谱仪，以芦丁为内标物质，计算相对校正因子；

不同人员的考察：不同实验人员，配制相近浓度对照品溶液，比较相对校正因子，结果重现性良好，rsd<5％；

不同仪器的考察：采用方法学研究所用的3台实验仪器测定同一对照品溶液的相对校正因子，并比较相对校正因子，结果重现性良好，rsd<5％。

不同色谱柱的考察：采用方法学研究的3根色谱柱测定同一对照品溶液的相对校正因子，并比较相对校正因子，结果重现性良好，rsd<5％；

对相对校正因子影响较大的是实验人员操作和不同仪器的误差，因此本研究将测得的所有校正因子汇总，rsd<5％，故将平均值其作为相对较正因子的测定值。

本发明中所述的相对保留时间的考察包括：精密度实验、稳定性试验、重复性实验、耐用性试验。

精密度试验：精密吸取同一供试品溶液连续进样6次，kgr、igr、krg、qrcg、krcg保留时间相对rutin保留时间的比值rsd小于2％；

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、16、24小时，按照上述方法测定，结果表明，供试品溶液kgr、igr、krg、qrcg、krcg保留时间相对rutin保留时间的比值在24小时内基本稳定，rsd小于2％；

重复性试验：按本发明提供的测定方法，对同一批号样品，6份进行测定，结果kgr、igr、krg、qrcg、krcg保留时间相对rutin保留时间的比值rsd小于2％；

耐用性试验：将同一对照品溶液采用3根色谱柱、3台仪器测定相对保留时间，测定方法相对保留时间稳定，不同仪器、色谱柱比较rsd小于5％。

本发明中所述的相对保留时间的测试以芦丁(rutin)对照品为参照，以其相应的峰为s峰，计算山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内。

本发明再有一个技术方案提供了一种舒血宁注射液指纹图谱测定方法，该方法采用高效液相色谱法，所述的液相色谱检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸水溶液为流动相b，梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相a、b的比例变化为：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速0.5-1.5ml/min，检测波长为360nm，柱温45-48℃。

其中，所述的指纹图谱测定方法，其特征在于各色谱谱相似度不低于0.90，各峰峰面积的rsd均<2％。

与传统测定方法相比一测多评法解决了中药多成分定量和多指标质量控制中存在的对照品缺乏问题，在降低检测成本的同时实现了多指标同步质量控制反映中药产品质量。而基于指纹图谱的一测多评法优势在于只有既符合指纹图谱相似度要求又符合含量要求双重标准的产品才是合格产品，对于控制不同批次产品间的质量一致性具有重要意义。

本发明该方法以芦丁为对照品通过一测多评法定量舒血宁注射液中黄酮醇苷类化合物山柰酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-芸香糖苷、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)葡萄糖苷、山柰酚-3-o-鼠李糖9-o-6-o-(对羟基反式桂皮酰)葡萄糖苷，并通过指纹图谱控制舒血宁注射液批间质量稳定性。本发明解决了舒血宁注射液多成分定量和多指标质量控制中存在的对照品缺乏问题，同时通过指纹图谱控制产品批间质量稳定性保障了舒血宁注射液的质量。本发明所提供的黄酮醇苷类化合物含量测定方法快速、简单、灵敏度高、精密度高，稳定性好。

附图说明

图1为本发明实施例1中的混合对照品液相色谱图；

图2为本发明实施例1中的样品液相色谱图；

图3为本发明实验例1的样品指纹图谱自身比较(样品1-10)。

具体实施方式

下述为实施例和实验例中使用的仪器与试剂、试药：

(1)仪器

高效液相色谱仪：waters2689高效液相色谱仪

(2)色谱柱

inertsilods-3，5μm、4.6×250mm

(3)对照品

①芦丁(rutin)使用前不需干燥处理，供hplc法测定，含量为90.5％，由中国药品生物制品检定所提供(供含量测定用批号100080-200707)。

②山柰酚芸香糖苷(kaempferolrutinoside，kgr)的纯度为98.09％。

③异鼠李素芸香糖苷(isorhmnetinrutinoside，igr)的纯度为98.05％。

④山柰酚葡萄糖鼠李糖苷(kaempfero3-o-2″-glucosylrhamnoside，krg，0.0336mg/ml)的纯度为96.97％。

⑤槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷(quercetin3-o-2″-(6″-p-courrlaroyl)glucosylrhamnoside，qrcg)的纯度为98.01％。

⑥山柰酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷(kaempfero13-o-2″-(6″-p-coumaroyl)glucosylrhamnosidc，krcg)的纯度为89.41％。

(4)样品

舒血宁注射液样品编号依次为样品1-13。

(5)试剂与试药

乙腈为色谱纯；磷酸为优级纯；其它试剂均为分析纯；水为超纯水。

实施例1

舒血宁注射液黄酮醇苷类化合物的含量检测方法

(1)对照品溶液的制备：分别精密称取芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，作为对照品溶液；

(2)高效液相色谱检测：分别精密吸取舒血宁注射液与对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪；

其中，所述的液相色谱检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸水溶液为流动相b，梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相a、b的比例变化为：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速1.0ml/min，检测波长为360nm，柱温48℃，见图1、2。

实施例2

舒血宁注射液黄酮醇苷类化合物的含量检测方法

(1)对照品溶液的制备：分别精密称取芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，作为对照品溶液；

(2)高效液相色谱检测：分别精密吸取舒血宁注射液与对照品溶液各25μl，注入高效液相色谱仪；

其中，所述的液相色谱检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸水溶液为流动相b，梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相a、b的比例变化为：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速0.5ml/min，检测波长为360nm，柱温45℃。

实验例1

舒血宁注射液指纹图谱检测方法测试结果

使用实施例2中的检测方法，测定了13批次样品的相似度，结果均符合现行标准规定的限度相似度不低于0.90，说明该厂家生产的舒血宁注射液样品较为稳定，测定结果见表1，指纹图谱见图3。

表1指纹图谱测定结果

实验例2

舒血宁注射液中六种黄酮醇苷的线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液含rutin0.1996mg/ml，kgr0.2184mg/ml，igr0.1757mg/ml，krg0.1085mg/ml，qrgg0.2258mg/ml，krcg0.2181mg/ml各2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，注入液相色谱仪，色谱测试条件按照实施例1中的测试条件，记录色谱图，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程。结果见表2～8。

表2rutin线性关系考察

表3kgr线性关系考察

表4igr线性关系考察

表5krg线性关系考察

表6qrcg线性关系考察

表7krcg线性关系考察

表86种黄酮成分线性关系考察

实验例3

精密度试验

精密吸取同一样品3，连续进样6次，rutin、kgr、kgr、krg、qrcg、krcg峰面积的rsd小于2％，按实施例1方法测定，结果表明该方法精密度良好，见表9。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99，结果表明该方法精密度良好。

表9精密度试验

实验例4

稳定性试验

精密吸取同一样品3，分别于配制后0h、2h、4h、8h、16h、24h，按实施例1方法测定，结果表明，供试品溶液在24h内基本稳定，峰面积的rsd小于2％，结果见表10，又以第0h进样所得指纹图谱做为对照计算之后进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99，结果表明该方法稳定性良好。

表10稳定性试验

实验例5

重复性试验

精密吸取同一样品3，连续进样6次，按实施例1方法测定，结果表明该方法测试血宁注射液中黄酮醇苷类化合物含量，见表11。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99，结果表明该方法重复性良好。

表11重复性试验

实验例6

准确度及范围试验

采用加样回收法，①精密称吸取已知含量的同一批样品3(rutin含量为0.06251mg/ml，kgr含量为0.05612mg/ml，igr含量为0.05628mg/ml，krg含量为0.03717mg/ml，qrcg含量为0.08003mg/ml，krcg含量为0.07129mg/ml)0.5ml及混合对照品溶液(含rutin0.07760mg/ml，kgr0.07153mg/ml，igr0.05992mg/ml，krg0.03547mg/ml，qrcg0.07824mg/ml，qrcg0.07871mg/ml0.5ml，置同一2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；②精密称吸取已知含量的同一批样品1.0ml及上述混合对照品1.0ml，混匀；③精密称吸取上述混合对照品2.0ml，蒸干，精密加入同一批样品2ml，使溶解，平行制备3份，依法测定，结果表明本方法具有良好的准确度。

实验例7

耐用性考察

采用3批次样品(样品1、2、3)分别用3种色谱柱(①inertsilods-3，5μm、4.6×250mm，②phenomenexgeminic18，5μm、110a、4.6×250mm，③inertsilods-3，s-5μm、4.6×250mm)对其6种黄酮醇苷类化合物的含量进行了测定，结果见表12。

表12分别用3种液相色谱柱测定样品1中黄酮醇苷类化合物含量的测定结果(mg/ml)

结果表明，上述6种成分使用不同品牌色谱柱，均能获得较好的分离，且测定结果基本一致，说明本发明提供的测定方法有较好的耐用性。