TCP1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用、乳腺癌预后评估试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及tcp1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用、乳腺癌预后评估试剂盒及方法。

背景技术：

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在妇女疾病中仅次于子宫癌，乳腺癌的发病常与遗传有关，患者常见于40-60岁的女性之间，绝经期前后的妇女发病率较高，仅约1-2％的乳腺患者是男性。乳腺癌是通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。

乳腺癌的病因尚未完全清楚，研究发现乳腺癌的发病存在一定的规律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。所谓高危因素是指与乳腺癌发病有关的各种危险因素，而大多数乳腺癌患者都具有的危险因素就称为乳腺癌的高危因素。乳腺癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键。

手术治疗仍为乳腺癌的主要治疗手段之一，术式有多种，对其选择尚乏统一意见，总的发展趋势是，尽量减少手术破坏，在设备条件允许下对早期乳腺癌患者尽力保留乳房外形，无论选用何种术式，都必须严格掌握以根治为主，保留功能及外形为辅的原则。

乳腺癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，乳腺癌早期复发转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高乳腺癌术后总体治疗效果。因此，探寻切实有效的乳腺癌乳腺切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与乳腺癌早期复发转移的关系，这对提高乳腺癌术后治疗效果、评估乳腺癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。

蛋白质折叠是生命科学的基本问题之一。蛋白质在细胞内的折叠需要分子伴侣的协助。因此蛋白质折叠过程不是完全自发的,而且是一个需能过程。分子伴侣不仅可以防止蛋白质在折叠过程中形成聚集物或无活性结构,提高正确折叠率,而且还可能影响折叠路径。分子伴侣主要由三个高度保守的蛋白质家族组成,这三个家族的成员广泛分布于原核和真核细胞中。tcp1(t-complexpolypeptide-1)是真核细胞细胞溶质内的伴侣蛋白。tcp1协助肌动蛋白和微管蛋白拆叠。

乳腺癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对乳腺癌的治疗也缺少特异性的分子靶点，而tcp1做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道tcp1蛋白与判断乳腺癌预后或乳腺癌转移相关。而本发明研究发现在乳腺癌中的tcp1表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示tcp1可作为乳腺癌的术后预后的有效预警蛋白。

技术实现要素：

本发明目的在于提供tcp1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，并提供用于乳腺癌术后预后评估的试剂盒及方法。

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测tcp1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量，能够判断乳腺癌患者出现乳腺癌复发转移的风险。基于tcp1蛋白表达量与乳腺癌复发转移的相关性，以tcp1蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导乳腺癌的预后判断。

因此，本发明提供了tcp1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以tcp1蛋白作为分子标记，利用tcp1单克隆抗体或tcp1多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测tcp1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量。

本发明还提供了所述应用中用于乳腺癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：人源tcp1单克隆抗体或tcp1多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。

本发明经过研究发现，tcp1在复发转移乳腺癌组织中表达高于未复发转移乳腺癌组织，可以推测tcp1在乳腺癌术后复发转移中发挥重要作用。查阅国内外文献，tcp1与乳腺癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本研究中，tcp1在乳腺癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常肝组织中则表达下调，且与未复发转移组相比，tcp1在复发转移组中表达也上调，表明tcp1可能作为促进因子参与乳腺癌发生发展过程。通过kaplan-meier生存曲线分析，tcp1表达程度与乳腺癌患者的预后有关，tcp1高表达的患者预后不良(p<0.05)。

综上所述，tcp1在乳腺癌组织中高表达，tcp1的高表达与乳腺癌患者术后复发转移有关。tcp1可以作为乳腺癌预后的一个重要候选分子标记物。

优选的，所述人源tcp1多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的tcp1蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

利用本发明所述试剂盒进行乳腺癌术后预后评估的方法如下：

(1)取乳腺癌患者病理标本，利用人源tcp1单克隆抗体或人源tcp1多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于乳腺癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备乳腺癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：tcp1抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取乳腺癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示tcp1蛋白与乳腺癌的预后具有显著的相关性，为预测乳腺癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对乳腺癌患者的预后有重要作用。当癌组织tcp1免疫组化评分高于0.36时，乳腺癌易出现复发转移，乳腺癌患者术后易死亡。

本发明的有益效果主要体现在：本发明研究发现在乳腺癌中的tcp1表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示tcp1可作为乳腺癌的术后预后的有效预警蛋白。因此，本发明提供了tcp1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断乳腺癌患者预后的蛋白质分子标记，对于乳腺癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

附图说明

图1为tcp1在乳腺癌患者术后1年内无复发转移的组织样本中弱表达；

图2为tcp1在乳腺癌患者术后1年内复发转移的组织样本中强表达；

图3为tcp1在乳腺癌旁组织中弱表达；

图4为乳腺癌组织中tcp1低表达组与高表达组生存曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：

实施例1

用于乳腺癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：用于对乳腺癌组织中的tcp1蛋白的相对表达量进行检测的人源tcp1单克隆抗体或tcp1多克隆抗体、免疫组化实验试剂。其中，免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2、3％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、pbs以及0.01medta修复液。

本发明所述人源tcp1多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的tcp1蛋白免疫兔子获得。可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

实施例2

tcp1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是利用本发明试剂盒进行乳腺癌术后预后评估，方法如下：

(1)取乳腺癌患者病理标本，利用人源tcp1单克隆抗体或人源tcp1多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于乳腺癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备乳腺癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：tcp1抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取乳腺癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。tcp1高低表达标准以326例乳腺癌组织中tcp1表达评分的中位数(0.36)为界。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。

按照上述方法，本发明在326例乳腺癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-3所示：tcp1在1年内未复发转移组中弱表达；在复发转移组中高表达(图2)；在癌旁组织中弱表达(图3)。

tcp1与乳腺癌患者预后的关系：

通过kaplan-meier生存曲线分析，tcp1的表达程度与乳腺癌患者的预后相关，如图4所示，tcp1高表达的患者平均生存期(存活率)低于tcp1低表达的患者。

实施例3

取某乳腺癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的tcp1免疫组化组织评分为0.586。经过术后随访发现，该患者在术后第9个月发生乳腺癌复发转移，术后十五个月死亡。

实施例4

取某乳腺癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的tcp1免疫组化组织评分为0.128。经过术后随访发现，该患者在术后1年均未发现转移复发，健在。

由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测tcp1蛋白分子相对表达量能预测乳腺癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织tcp1的免疫组化评分高于0.36时，乳腺癌易出现复发转移，乳腺癌患者术后易死亡。显然tcp1蛋白与乳腺癌具有相关性，因此，以tcp1蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测乳腺癌手术后复发转移等事件，并判断预后。

序列表

<110>福建师范大学

<120>tcp1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用、乳腺癌预后评估试剂盒及方法

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>556

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

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115120125

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130135140

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435440445

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450455460

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