尿唑-金纳米簇复合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一类尿唑-金纳米簇复合物的合成方法，属于荧光金纳米簇的制备与运用方面，特指一种尿唑-金纳米簇复合物及其制备方法，并将其应用于乳腺癌癌细胞成像和定量检测姜黄素。

背景技术：

据报道，乳腺癌是女性中发病率最高的癌症，成为了导致女性发病死亡的重要原因。因此对乳腺癌的早期诊断就得尤为重要，一度成为近几年来的研究热点。出现了具有各种成像特性的纳米材料，用于对恶性肿瘤细胞的早期检测，包括磁共振成像，光热成像，光声成像，荧光成像等，其中荧光成像以其特有的高灵敏性，在早期癌细胞的检测方面发挥了重要作用。但是纳米成像剂的稳定性不足，所以开发一种稳定的荧光纳米成像剂就显得尤为重要。[litt,yangjj,aliz,wangzf,etal.synthesisofaptamer-functionalizedagnanoclustersformcf-7breastcancercellsimaging[j]sci.chinachem.2017,60:370–376.]姜黄素作为一种天然产物，具有巨大的药用价值。已被现代医学证实的药用价值包括：抗癌，抗菌，抗氧化，抗炎，保肝等。[goela,kunnumakkaraab,aggarwalbb.curcuminas“curecumin”:fromkitchentoclinic[j]biochem.pharmacol.2008,75:787–809]另外有研究表明姜黄素对活化血管也起到了不错的效果。[venkatesann.curcuminattenuationofacuteadriamycinmyocardialtoxicityinrats[j]britishjournalofpharmacology1998,124:425–427.]由此开发一种定量快速检测姜黄素的方法，就显得很有价值和意义。

技术实现要素：

我们以有机小分子尿唑(urazole)与氯酸金反应，以聚乙烯吡咯烷酮(pvp)为模版，合成了一种新型荧光尿唑-金纳米簇(标记为urazole-auncs)；纳米簇的大小为1-8nm，呈现树枝状；它的水溶液显示淡黄色，浓度为240μg·ml^-1时，用381nm激发，473nm处荧光发射强度为245，说明该荧光尿唑-金纳米簇(urazole-auncs)是一种灵敏的荧光试剂。进一步将该urazole-auncs运用于mcf-7(乳腺癌)细胞的荧光成像和食品中定量检测姜黄素。

新型荧光尿唑-金纳米簇(urazole-auncs)的合成方法如下：

将尿唑水溶液注入到四氯金酸水溶液中，第一次室温搅拌直至混合液由亮黄色变为黄褐色；再注入聚乙烯吡咯烷酮水溶液得到反应体系，第二次室温搅拌后移至烘箱反应，反应后自然冷却至室温，溶液置于超纯水中透析，再冷冻干燥即可得到稳定的尿唑-金纳米簇。

所述尿唑水溶液与四氯金酸水溶液的体积比为1:3；所述尿唑水溶液的浓度为50mm；四氯金酸水溶液的浓度为16.67mm。

所述聚乙烯吡咯烷酮水溶液与四氯金酸水溶液的体积比为1:3；所述聚乙烯吡咯烷酮水溶液浓度为100mg·ml^-1。

第一次室温搅拌时间为15s。

第二次室温搅拌时间为30s。

所述反应温度为180℃；反应时间为24h。

所述置于超纯水中透析的时间为6h。

所述尿唑水溶液、四氯金酸水溶液和聚乙烯吡咯烷酮水溶液中的溶剂水皆为超纯水。

本发明的优点:

本发明基于有机小分子尿唑(urazole)设计新型尿唑-金纳米簇(urazole-auncs)，结果表明制备的新型尿唑-金纳米簇(urazole-auncs)能够很好地对mcf-7(乳腺癌)细胞进行荧光成像和定量检测姜黄素；本发明是国际上首次基于尿唑小分子中的n与au³⁺配位的原理，并将其用于合成树枝状尿唑-金纳米簇(urazole-auncs)纳米复合物。这种新型的稳定的尿唑-金纳米簇，能够定量检测姜黄素，检测的浓度范围为0.16-60.00μm，是一种灵敏的检测姜黄素的荧光探针；并很好地实现了对mcf-7(乳腺癌)细胞的荧光成像，这是一种方便、快捷、直观、经济的成像方法，该方法也为进一步研究和治疗肿瘤细胞提供了理论上和技术上的支撑。

附图说明

图1为实施案例1制备的urazole-auncs的透射电镜图。由图1可见urazole-auncs粒径为1-8nm。

图2为实施案例1制备的urazole-auncs的扫描电镜图。由图2可见urazole-auncs自组装形成树枝状的纳米结构。

图3为实施案例1制备的urazole-auncs靶向mcf-7(乳腺癌)细胞的荧光成像图。由图3可见urazole-auncs能够用于mcf-7细胞的成像。

图4为实施案例1制备的urazole-auncs用于检测姜黄素的荧光变化图(a)和对应的线性拟合图(b)。由图4(a)可见从a到p随着姜黄素浓度的递增，urazole-auncs的荧光逐渐猝灭，证明urazole-auncs能够用于姜黄素的检测。由图4(b)可见姜黄素浓度在0-60μm内时，urazole-auncs的荧光强度随着姜黄素浓度的递增呈线性的降低，证明urazole-auncs能够用于姜黄素的定量检测。

具体实施方式

试剂和原料

反应中所用的溶剂皆为分析纯，所用试剂未加特殊说明直接应用而未经任何特殊处理；聚乙烯吡咯烷酮购于国药集团化学试剂有限公司，尿唑购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，四氯金酸购于上海泰坦科技股份有限公司。

紫外可见分光光度仪(日本岛津uv-2450型)，190-800nm；carryeclipse荧光分光光度计(美国瓦里安有限公司)；傅里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公司nicoletnexus470)；milli-q系列超纯水系统(millipore)；美国美瑞泰克公司hrc-10便携式近红外光拉曼光谱仪；jem-200cx型透射电镜(日本电子株式会社)；dhg-9140a型电热恒温鼓风干箱(上海—恒科技有限公司)；dzf-6051型真空干燥箱(上海—恒科技有限公司)；toppette手动单道可调式移液枪(10-100μl)和toppette手动单道可调式移液枪(20-200μl)；phs-3c酸度计(上海第二分析仪器厂)。

化合物的合成方法：

实施案例1(最佳合成条件)：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌15s后，溶液渐变为黄褐色，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为10mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至180℃烘箱反应24h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到稳定的尿唑-金纳米簇,6mg。

实施案例2：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌10s后，溶液颜色开始变深，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为10mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至180℃烘箱反应24h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到尿唑-金纳米簇,4.2mg，由于前期urazole和au³⁺作用时间缩短了，导致产率降低。

实施案例3：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌30s后，溶液渐变为深褐色，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为10mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至180℃烘箱反应24h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到尿唑-金纳米簇,2.3mg。由于前期urazole和au³⁺作用时间过长，发生聚集，导致产率明显降低，同时伴有大量副产物生成。

实施案例4：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌15s后，溶液渐变为黄褐色，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为10mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至100℃烘箱反应24h，自然冷却至室温，有明显的黑色固体析出，未得到稳定的荧光尿唑-金纳米簇。由于反应温度过低，不足以提供还原反应所需的能量，未得到稳定的荧光尿唑-金纳米簇。

实施案例5：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌15s后，溶液渐变为黄褐色，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为10mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至200℃烘箱反应24h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到稳定的尿唑-金纳米簇,3.0mg。由于反应温度过高，伴随有副产物生成，产率明显降低。

实施案例6：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌15s后，溶液渐变为黄褐色，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为10mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至180℃烘箱反应12h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到稳定的尿唑-金纳米簇,3.6mg。由于反应时间过短，原料未反应完全，产率明显降低。

实施案例7：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌15s后，溶液渐变为黄褐色，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为10mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至180℃烘箱反应48h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到稳定的尿唑-金纳米簇,5.2mg。反应时间过长，由于反应在48h之内已经达到饱和，所以产率并没有提高。

实施案例8：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于1ml超纯水(100mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取0.5ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌15s后，溶液渐变为黄褐色，此时注入预先准备好1ml聚乙烯吡咯烷酮溶液和0.5ml超纯水(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为5mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至180℃烘箱反应24h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到稳定的尿唑-金纳米簇,2.8mg。由于尿唑的量较少，au³⁺未完全参与反应，产率明显降低。

实施案例9：

取0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于0.5ml超纯水(200mg·ml^-1)，得到一号反应液，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg·ml^-1。取0.0170g四氯金酸溶于3ml超纯水(16.67mm)，得到二号反应液，四氯金酸的浓度为16.67mm，室温搅拌(18±2℃)。取0.0505g尿唑(urazole)溶于10ml超纯水(50mm)，得到三号反应液，尿唑的浓度为50mm。以尿唑作为模板剂，取1.5ml三号反应液，迅速注入二号反应液中，此时混合液为亮黄色，室温搅拌15s后，溶液渐变为黄褐色，此时注入预先准备好0.5ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(反应体系中urazole，haucl4和pvp的浓度分别为15mm,10mm和20mg·ml^-1)，室温下搅拌30s，然后移至180℃烘箱反应24h，自然冷却至室温，置于超纯水中透析6h，冷冻干燥即可得到稳定的尿唑-金纳米簇,4.9mg。由于尿唑过量，伴随有副产物生成，产率明显降低。

实施案例10(肿瘤细胞成像)：

将mcf-7乳腺癌细胞接种到24孔培养板中，每孔接种2.4×10⁴个细胞，并孵育24小时。纳米粒子用半透膜纯化，用dmem培养基稀释至适宜浓度，加入到接种有mcf-7细胞的24孔培养板中，孵箱中孵育4小时。用pbs缓冲液冲洗，以除去游离化合物，然后用nikonti-e2000显微镜在活细胞工作站中观察成像效果。实施案例1制备的urazole-auncs的激发波长为381nm。

实施案例11(urazole-auncs定量检测姜黄素)：

取适量实施案例1制备的urazole-auncs粉末，溶于1ml超纯水，得到浓度为240μg·ml^-1的urazole-auncs测试溶液。在上述urazole-auncs测试溶液中注入不同浓度的姜黄素溶液，摇匀，每次孵育3min，然后用381nm激发，检测记录其对应的荧光强度。