一种基于铂纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种新型的胰蛋白酶含量检测方法和检测试剂盒，尤其涉及一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法及其检测试剂盒，属于纳米生物传感
技术领域：
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背景技术：
：胰蛋白酶（trypsin,try）是由胰腺产生一类丝氨酸蛋白酶，主要作用是水解细胞间的蛋白质离散细胞，它广泛存在于脊椎动物的消化系统，在调节胰腺外分泌功能过程中也起着关键作用。研究表明，患有急性胰腺炎或胰腺移植病人的血液中胰蛋白酶的含量（1.4±0.6μg/ml）水平比一般健康人（0.25±0.1μg/ml）的要高，因此，胰蛋白酶在生物体液中的含量水平可作为胰腺功能和病理变化的生物标志物。综上，我们可以通过检测人体血液或者尿液中胰蛋白酶的含量，诊断人体胰腺功能正常与否。目前，检测胰蛋白酶的方法主要有：高效液相色谱技术、凝胶电泳技术、酶联免疫分析技术、化学发光和电化学分析方法等。这些方法相对比较耗时，或者有些需要复杂的修饰步骤，以及精密的仪器设备才能完成。因此，设计构建一种操作简单，无标记，且灵敏的方法对于胰蛋白酶的快速检测十分迫切。近几年来，纳米模拟酶具有较高的催化活性、卓越的生物相容性且稳定性高等特点，得到科研工作者的高度重视。这些特性让纳米模拟酶有望在环境监测、生物分析和疾病诊断等领域大有作为。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法。其中包括利用合成的铂纳米簇模拟氧化酶催化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐偶合产物显色，显色体系的最大吸收波长为590nm，由590nm处吸光度可得出胰蛋白酶的含量。为了实现上述快速检测方法的目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是将胰蛋白酶和鱼精蛋白在tris-hcl缓冲液中37℃下温浴2h，之后加入铂纳米簇溶液，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，目视观察颜色变化或测定紫外-可见吸收；所述的铂纳米簇溶液由以下步骤制得:将1ml浓度为16mmol/l氯铂酸溶液和1ml40mmol/l柠檬酸钠加入到38ml超纯水中，室温下搅拌混匀两分钟，之后滴入200μl浓度为50mmol/l硼氢化钠用于还原氯铂酸；混合物在室温下不断搅拌1小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液，将柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液冷冻干燥得到铂纳米簇模拟氧化酶粉末。所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是将10µl不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和10µl0.2mg/ml鱼精蛋白加入到480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50μl铂纳米簇、250μl3mmol/ln-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200µl0.5mmol/l3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度。所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是显色产物溶液颜色为紫色，随着胰蛋白酶浓度的增大，溶液颜色加深，目视观察溶液颜色的检测限为0.05μg/ml。所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是显色产物最大吸收波长为590nm，根据590nm波长处测得的吸光度作标准曲线，其检测的线性范围为1.0~70.0ng/ml，检测限为0.6ng/ml。本发明的另一个目的在于提供一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测试剂盒。本发明实现胰蛋白酶快速检测试剂盒的目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测试剂盒，其特征是试剂盒中包括a液、b液、标准液和缓冲液，所述a液中含有铂纳米簇溶液，b液中含有3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐。上述a液中含有浓度为0.40mmol/l的铂纳米簇模拟氧化酶溶液;b液中含有3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐溶液;标准液包括浓度为1.0、3.0、10.0、30.0、50.0、70.0ng/ml的胰蛋白酶溶液;缓冲液为10mm、ph8.0的tris-hcl溶液。本发明所述的一种基于铂纳米簇的胰蛋白酶快速检测试剂盒的应用，其特征是作为胰蛋白酶快速检测。所述的一种基于铂纳米簇的胰蛋白酶快速检测试剂盒的应用，其特征是将10µl不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和10µl0.2mg/ml鱼精蛋白加入到480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50μl铂纳米簇、250μl3mmol/ln-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200µl0.5mmol/l3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度，根据标准曲线或回归方程，计算血清样品中胰蛋白酶的含量。具体地说，本发明采用以下技术方案：（一）将1ml浓度为16mmol/l氯铂酸溶液和1ml40mmol/l柠檬酸钠加入到38ml超纯水中，室温下搅拌混匀两分钟，之后滴入200μl浓度为50mmol/l硼氢化钠用于还原氯铂酸；混合物在室温下不断搅拌1小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液，将柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液冷冻干燥得到铂纳米簇模拟氧化酶粉末。制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。（二）本发明的胰蛋白酶快速检测方法：将10µl不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和10µl0.2mg/ml鱼精蛋白加入到480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50μl浓度为0.40mmol/l的铂纳米簇模拟氧化酶、250μl3mmol/ln-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200µl0.5mmol/l3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度。（三）胰蛋白酶快速检测试剂盒：a液包括上述技术方案（一）制备后用双蒸水配制的浓度为0.40mmol/l的铂纳米簇模拟氧化酶溶液；b液包括浓度为3mmol/ln-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和0.5mmol/l3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐；缓冲液为10mm、ph=8.0的tris-hcl溶液。（四）胰蛋白酶快速检测试剂盒使用方法：在10μl不同浓度的标准液和10µl0.2mg/ml鱼精蛋白加入到480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50μl技术方案（三）的a液和450μl技术方案（三）的b液，在40℃下温浴25min后，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度。根据显色体系溶液颜色判断或根据吸光度标准曲线进行定量。本发明的优点：（1）本发明利用铂纳米簇模拟氧化酶催化催化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐偶合产物显色，从而表现出溶液颜色变化和紫外吸收光谱特征的变化，可以用于胰蛋白酶的含量快速检测。（2）本发明对胰蛋白酶的检测特异性高，可用于尿样中胰蛋白酶含量测定。（3）本发明检测胰蛋白酶的灵敏度高，目视观察颜色变化的检测限为0.05μg/ml，分光光度法检测线性范围为1.0~70.0ng/ml，检测限为0.6ng/ml。（4）本发明提供的胰蛋白酶快速检测试剂盒，具有稳定性好，操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。附图说明图1为铂纳米簇材料的zeta电势图。图2为铂纳米簇材料的x射线光电子能谱图。图3为铂纳米簇材料的透射电镜图（插入图为平均粒径分布图）。图4为鱼精蛋白导致铂纳米簇聚集作用的透射电镜图。图5为胰蛋白酶及其抑制剂在铂纳米簇催化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐偶合的氧化产物在590nm处的吸光光谱图。图6为不同浓度胰蛋白酶吸光光谱图。图7为酪氨酸酶、溶菌酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、葡萄糖、尿素、葡糖糖氧化酶、脲酶、碱性磷酸酶和一些常见离子对胰蛋白酶快速检测的干扰图。图8为大豆胰蛋白酶抑制剂的胰蛋白酶活性抑制率曲线图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述。实施例1将1ml浓度为16mmol/l氯铂酸溶液和1ml40mmol/l柠檬酸钠加入到38ml超纯水中，室温下搅拌混匀两分钟，之后滴入200μl浓度为50mmol/l硼氢化钠用于还原氯铂酸；混合物在室温下不断搅拌1小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液，制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗晾干。所制备的铂纳米簇材料的zeta电势为-26.7±1.9mv（见图1）；使用x射线光电子能谱对柠檬酸稳定-铂纳米簇材料进行元素分析，由图谱可知，铂纳米表面含有大量的c、o元素级少量的na元素（见图2），o、c和pt分别占有23.73%,70.24%和3.07%。实施例2将实施例1所得的铂纳米簇材料使用透射电镜进行表征，发现铂纳米簇呈规则均匀分散，大小为2.95±0.53nm（见图3）；在所制备的铂纳米簇材料中加入鱼精蛋白，因鱼精蛋白富含精氨酸，具有较强的正电荷，可与带负电荷的铂纳米簇通过静电作用，使铂纳米簇材料表面状态改变进而破坏铂纳米簇的稳定性，导致铂纳米簇聚集，使用透射电镜表征铂纳米簇表面状态，结果如图4所示，鱼精蛋白导致铂纳米簇表面状态改变引起聚集，从而引起其催化活性的降低。实施例3将10µl0.2mg/ml鱼精蛋白分别加入将10µl10ng/ml胰蛋白酶、30ng/ml的胰蛋白酶溶液中，各加入480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液，在37℃中孵育2小时；之后，加入实施例1制得的50μl浓度为0.40mmol/l的铂纳米簇、n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度，结果如图5所示：曲线(a)空白,(b)10ng/ml胰蛋白酶,(c)30ng/ml胰蛋白酶。当20ng/ml抑制剂加入时，吸光度降低(见图5曲线d)，表明抑制剂起到抑制胰蛋白酶水解鱼精蛋白的作用。实施例4将10µl不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和10µl0.2mg/ml鱼精蛋白加入到480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入实施例1制得的50μl浓度为0.40mmol/l的铂纳米簇、250μl3mmol/ln-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200µl0.5mmol/l3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度。如图6所示，随着胰蛋白酶浓度的加大，吸光度越来越大，通过分光光度法所得检测限为0.6ng/ml。实施例5一种基于铂纳米簇材料的胰蛋白酶快速检测试剂盒。试剂盒中包括铂纳米簇模拟氧化酶溶液（a液），n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐（b液），胰蛋白酶标准溶液（标准液）和缓冲液。a液为实施例1制备后用双蒸水配制的浓度为0.40mmol/l的铂纳米簇溶液；b液包括浓度为3mmol/ln-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和0.5mmol/l3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐；标准液包括浓度为1.0、3.0、10.0、30.0、50.0、70.0ng/ml的胰蛋白酶溶液;缓冲液为10mm、ph8.0的tris-hcl溶液。实施例6分别取10μg/ml的酪氨酸酶(tyr)、溶菌酶(lysozyme)、透明质酸酶(hyaluronidase)、酸性磷酸酶(acp)、黄嘌呤氧化酶(xod)、葡萄糖(glucose)、尿素(urea)、葡糖糖氧化酶(gox)、脲酶(urease)、碱性磷酸酶(alp)、一些常见离子（k+、na+、ca2+）和0.1μgml-1胰蛋白酶溶液分别加入到480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液中，再加入10µl0.2mg/ml鱼精蛋白，在37℃中孵育2小时；之后，加入50μl实施例5的a液、450μl实施例5的b液，在40℃下温浴25min后获得显色产物，在590nm处测定紫外-可见吸收度。结果如图7所示酪氨酸酶(tyr)、溶菌酶(lysozyme)、透明质酸酶(hyaluronidase)、酸性磷酸酶(acp)、黄嘌呤氧化酶(xod)、葡萄糖(glucose)、尿素(urea)、葡糖糖氧化酶(gox)、脲酶(urease)、碱性磷酸酶(alp)和一些常见离子不会对本发明的胰蛋白酶检测产生干扰。实施例7在三个尿样中分别加入高、中、低三种浓度胰蛋白酶溶液，各加入10µl0.2mg/ml鱼精蛋到480μl浓度为10mmol/l、ph8的tris-hcl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50μl实施例5的a液、450μl实施例5的b液，在40℃下温浴25min后获得显色产物，在590nm处测定紫外-可见吸收度。结果如表1所示，结合实施例4计算尿样中胰蛋白酶的含量，样品的测定回收率为94.2%〜106.8%，相对标准偏差为0.85〜2.31%。表1标准加入法测定尿样中胰蛋白酶的回收率尿样编号胰蛋白酶加入量(ngml-1)胰蛋白酶测定值(ngml-1)回收率(%)相对标准偏差(n=3,%)109.6696.60.9613029.5198.40.955048.3996.80.85109.4594.51.2023028.2694.22.085047.3694.71.891010.68106.80.9233031.01103.41.085048.5097.02.31实施例8将10µl100ng/ml的胰蛋白酶溶液和10µl0.2mg/ml鱼精蛋白加入到480μl含有不同浓度大豆胰蛋白酶抑制剂的ph8的tris-hcl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；加入50μl实施例5的a液、450μl实施例5的b液，在40℃下温浴25min后获得显色产物，在590nm处测定紫外-可见吸收度，计算抑制率。结果如图8所示，通过软件拟合得到胰蛋白酶抑制剂的ic50为1.11ngml-1。以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12