通过耗尽白血细胞富集循环肿瘤细胞的制作方法
【专利说明】通过耗尽白血细胞富集循环肿瘤细胞
[0001] 相关专利申请
[0002] 本专利申请要求待审的临时专利申请美国序列61/787611的优先权，所述临时专 利申请名称为"ImprovedMolecularCharacterizationofCirculatingTumorCells(循 环肿瘤细胞的改善分子表征）"，于2013年3月15日提交。
【背景技术】
[0003] 上皮起源的循环肿瘤细胞（CTC)以极低频率（<10/ml血液）存在于癌患者的血液 中。循环中的肿瘤细胞检测可对于癌症疾病管理具有重要性。低频率细胞的检测需要大量 血液体积用于处理。为了计数且表征来自大量血液体积的CTC，CTC的富集是必要的。
[0004] 几种方法可用于基于大小、密度和抗原来富集CTC。充分建立的用于富集稀有细胞 的商业产品是VeridexCellSearchCTC测定。CellSearchCTC测定使用缀合至抗上皮细 胞粘附分子（EpCAM)的磁性颗粒，以捕获来自7. 5ml血液的CTC。富集的样品用DAPI(核酸 染料）进行染色，以鉴定有核细胞，用缀合至藻红蛋白的抗细胞角蛋白抗体进行染色，以鉴 定上皮起源的细胞，且用缀合至别藻蓝蛋白的抗白细胞抗体进行染色，以鉴定所有白细胞。 样品在CellTracks分析仪II上进行分析，用于CTC计数。
[0005] 在富集后的最终样品含有CTC和少量白血细胞（1000 - 5000个细胞）。富集方法 去除超过99%的白血细胞（WBC)。在稀有细胞计数期间的白血细胞的存在不是问题，不会 对过程有不利影响。。WBC可用白细胞标记物（CD45)进行标记，从而使WBC与CTC区分。然 而，如果希望分子表征所枚举的CTC，以通过扩增此类CTC中存在的核酸来限定其基因型， 贝1J白细胞的存在不利地影响该表征。考虑到所枚举级分中的白细胞比率与CTC数目相比较 很高，并且此类白细胞的核酸与CTC一起扩增，测定核酸的来源，即CTC或白血细胞是困难 的。因此，进一步纯化富集样品以去除白血细胞（减少白血细胞与CTC的比）将是开发可 靠的分子表征工具的主要里程碑。该需要通过以下发明得到满足。
[0006] 不存在CTC富集后可用于去除白血细胞的方法。需要唯一的方法，因为将不使用 用于富集CTC的相同原理。例如，如果第一步中的富集方法使用免疫磁性方法，则必须使用 除免疫磁性方法之外的另一种方法。
【附图说明】
[0007] 图1基于半抗原的白血细胞去除的描绘
[0008] 图2在与抗FITC-起温育前和温育后的白血细胞分析 [0009]图3白血细胞去除百分比
[0010]图4耗尽和非耗尽样品的分子测量
[0011] 图5在⑶45耗尽后的检测
[0012] 图6伴随白血细胞耗尽的掺料的Vcap细胞和培养的Vcap细胞之间的关联
[0013] 图7珠耗尽的效应。
【具体实施方式】
[0014] 本文描述的发明包含下述，基本上由下述组成或由下述组成：从包含富集的稀有 细胞和白血细胞的样品中去除白血细胞的方法，此类方法包括：
[0015] (a)在用缀合至半抗原的此类白细胞标记物标记此类白血细胞的条件下，用缀合 至半抗原的白细胞标记物处理此类样品，
[0016] (b)用附着至此类标记的白血细胞的第二介质处理步骤（a)的组合物，并且使第 二介质及其附着的标记的白血细胞与步骤（b)的组合物分开。
[0017] 如本文所用，"白细胞标记物"指标记白血细胞而不是稀有细胞的物质。白细胞标 记物的例子包括但不限于针对⑶45、⑶19、⑶15、血型糖蛋白A、⑶2、⑶14、⑶16、CE38和CD66b的抗体。优选的白细胞标记物为抗CD45。半抗原包括但不限于荧光素染料（"FITC")、 藻红蛋白（"PE"）、别藻蓝蛋白（"APC"）和生物素。优选的半抗原为FITC。如本文所用， 术语抗体包括单克隆和多克隆两者的完整抗体、与某些半抗原结合的抗体片段、与某些半 抗原结合的双特异性抗体。优选的抗体为单克隆抗体。
[0018] 如本文所用，"第二介质"意指包含除白细胞标记物外的第二标记物的任何表面。 此类第二标记物与缀合至白细胞标记物的半抗原结合。第二标记物的例子包括但不限于针 对FITC、PE、APC的抗体，优选的第二标记物为针对FITC的抗体。可使用的表面的例子是微 量滴定板。
[0019] 如本文所用，"稀有细胞"是在血液中具有低频率的细胞。稀有细胞的例子包括但 不限于循环肿瘤细胞（CTC)、循环内皮细胞（CEC)、循环多发性骨髓瘤细胞（CMMC)和循环黑 素瘤细胞（CMC)。优选的稀有细胞为CTC和CEC，特别优选的稀有细胞为CTC。这些稀有细 胞的富集级分可通过已知方法由全血产生。此类方法包括但不限于下述专利和专利申请 中公开的方法和试剂：美国专利7, 901，950 ;6, 365, 362,美国专利公开US2009/0136946;US 2013/0189675;US2014/0011685,所述专利据此全文以引用方式并入。获得富集的CTC的 优选方法是通过参考文献诸如美国专利6, 365, 362中公开的免疫磁性方法和CELLSEARCH 产品系列的方法。
[0020] 从CTC的富集级分中耗尽白血细胞的原理。如图1中所示，CTC和白血细胞用抗 EpCAM铁磁流体进行标记，并且白血细胞用白细胞缀合的半抗原进行标记。
[0021 ] 此外，本发明包括用于从包含富集的稀有细胞和白血细胞的样品中去除白血细胞 的试剂盒，其中此类试剂盒包含缀合至半抗原的白细胞标记物，以及除白细胞标记物外的 第二标记物，其中所述第二标记物包含针对此类半抗原的抗体。
[0022] 所有限定的术语均具有与上文所述相同的定义和优选例子。
[0023] 再进一步地，本发明包括用于从包含富集的稀有细胞和白血细胞的样品中去除白 血细胞的试剂盒，其中此类试剂盒包含用于免疫磁性标记稀有细胞和白血细胞的试剂，缀 合至半抗原的白细胞标记物，以及除白细胞标记物外的第二标记物，其中所述第二标记物 包含针对此类半抗原的抗体。
[0024] 所有限定的术语均具有与上文所述相同的定义和优选例子。
[0025] 本发明通过下述实例进行举例说明，所述实例不意在限制本发明的范围。
[0026] 实您1
[0027]实例1 :伸用在微量滴宙板h涂布的抗CD45耗尽白血细朐
[0028] 本实例显示了使用抗⑶45耗尽白血细胞。⑶45是白血细胞上存在的共同白细胞 标记物，并且预期所有白血细胞均与抗CD45结合。我们使用抗CD45来结合白血细胞，并且 使用涂布有抗CD45的固相，从白血细胞和CTC的混合物中特异性去除白血细胞。抗CD45 如下涂布至固相：
[0029] 将抗CD45 (Veridex)在50mM碳酸氢钠缓冲液pH8. 5中稀释至50ug/ml。随后将 0. 8ml抗⑶45抗体溶液加入6孔微量滴定板，在室温（RT)下温育3小时，随后在2-8°C下 过夜。在过夜温育后，抽吸抗⑶45抗体，并且将孔用lmlPBS/1 %BSA在RT下封闭4小时。 抽吸缓冲液，并且将孔用2mlPBS冲洗2次。在冲洗后，抽吸整个缓冲液，并且使板干燥1 小时。板在密封的塑料袋中在2-8°C下干燥贮存直至使用。
[0030] 在本实例中，完成两个实验以测试使白血细胞与非白血细胞分开的原理。在一项 研究中，在使用BD裂解试剂裂解红血细胞后，由全血制备纯白血细胞。该样品用作阳性对 照。在另一项研究中，使用CellSearchCTCProfile试剂盒，在CellTracksAutoPrep系统 上处理7. 5ml血液。CTCProfile试剂盒含有缀合至铁磁流体磁性颗粒的抗上皮细胞粘附 分子（EpCAM)，用于捕获循环肿瘤细胞。在靶细胞富集后，将样品重悬浮于900ulPBS/1% BSA缓冲液中。富集