的样品将含有靶细胞以及白血细胞。在样品加入微量滴定板中的孔后， 使板达到室温（最少30分钟），将孔用2mlPBS/5%BSA洗涤两次。随后在加入样品前， 抽吸来自孔的缓冲液。将900ulCTC测定样品和来自全血的纯白血细胞加入板的两个分 开孔中。在伴随每15分钟的轻轻混合的1小时温育后，取出300ul上清液以测定白血细胞 的数目。使用前向散射作为阈值，通过FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司（Beckton Dickinson))，测定样品中存在的白血细胞数目。如果白血细胞与孔中的抗CD45结合，贝lj当 与温育步骤前的样品相比较时，上清液中的白血细胞数目应是减少的。未结合的细胞应在 上清液中。结果显示于
[0031]表la中。
[0032]表la:在与涂布到微量滴宙板h的抗⑶45 -起淵育前和淵育后的白血细朐数目
[0033]
[0035] 上文结果显示纯白血细胞可通过将其加入涂布有抗⑶45的微量滴定板进行去 除。然而，白血细胞在CTC测定样品的上清液中发现。这提出来自CTC测定样品的白血细 胞不与孔中涂布的抗CD45结合。两种样品之间的差异在于CTC测定样品中的白血细胞用 铁磁流体磁性颗粒进行标记。由于立体位阻，白血细胞上存在的铁磁流体磁性颗粒阻止与 板上的抗CD45结合是可能的。为了克服这个问题，来自CTC测定的样品首先用通过接头缀 合至半抗原的抗CD45进行标记（参见实例）。随后将含有用抗CD45标签预标记的白血细 胞的样品加入涂布有抗半抗原的微量滴定板。
[0036]实例2 :抗异硫氰酸荧光素（FITC)涂布至微量滴宙板
[0037] 抗？11^购自80生物科学出0 81〇8(^61?^8)，并且在5011114118.5碳酸氢钠中稀 释至50ug/ml。将800ul抗FITC加入6孔微量滴定板，在RT下温育3小时，随后在2-8°C 下过夜。在过夜温育后，使板达到RT。抽吸上清液，并且将板用PBS冲洗两次。随后将孔用 lmlPBS/1 %BSA在RT下封闭4小时。抽吸缓冲液，并且将孔用2mlPBS冲洗2次。在冲 洗后，抽吸整个缓冲液，并且使板干燥1小时。板在密封的塑料袋中在2-8°C下干燥贮存直 至使用。在使用当天，使板达到RT(最少30分钟）。将2mlPBS/1 %BSA加入孔中，并且温 育15分钟。在抽吸后，将板再一次用2mlPBS/1%BSA冲洗。在将样品加入孔之前，抽吸缓 冲液。
[0038]实例3 :从CTC测宙样品中去除白血细朐，其中白血细朐用缀合至FITC的抗⑶45 讲行标记，并冃.微量滴定板涂布有抗FITC
[0039] 使用CellSeachCTC试剂盒，在AutoPr印上处理掺杂SKBR3细胞的7. 5mlEDTA 血液。来自CTC测定的该富集样品用最终浓度为2ug/ml的抗⑶45-FITC进行染色。通过 磁性分离15分钟，通过用2mlPBS/1 %BSA将样品洗涤2次，去除过量⑶45-FITC。将最终 样品重悬浮于900ulPBS/5%BSA中，并且随后施加于涂布有抗FITC的孔。样品伴随每15 分钟的轻轻混合温育1小时。在一小时后，从孔中取出300ul上清液，并且通过流式血细胞 计数器测定白血细胞和SKBR3细胞数目。为了通过流式细胞术检测SKBR3细胞，将细胞用 缀合至别藻蓝蛋白染料（APC)的抗Her2neu进行标记。白血细胞在FITC通道中进行检查， 因为它们用抗CD45-FITC进行标记。在耗尽前和耗尽后检测的细胞显示于图2中。
[0040] 图2显示了在白血细胞耗尽前和耗尽后的肿瘤细胞和白血细胞数目。在耗尽前 和耗尽后的白血细胞数目分别为3594和354,其指示大约90%的白血细胞从样品中耗尽。 另一方面，在耗尽前和耗尽后的肿瘤细胞数目分别为2094和1924,这指示所有肿瘤细胞 (>90%)均存在于上清液中。本实例显示在肿瘤细胞富集后，存在于CTC测定样品中的白 血细胞可使用本发明去除。
[0041] 这用6份样品进行测试，并且结果显示于图3中。结果显示超过90%的WBC可被 去除，伴随肿瘤细胞（SKBR3)的最小丧失（〈15% )。
[0042]实例4:循环内皮细朐（CEC)测宙中的白血细朐耗尽
[0043] 本实例显示WBC耗尽的原理可应用于其他稀有细胞测定。CellSearchCEC测定 使用CellSearchCEC试剂盒富集来自血液的CEC。该试剂盒含有缀合至铁磁流体磁性颗 粒的抗⑶146,用于捕获CEC。该测定使用CellTracksAutoPrep系统用于样品制备，很像 CTC测定。虽然CEC以低频率存在于正常健康血样中，但它们通过各种条件诸如癌症、心血 管问题和感染而升高。
[0044] 除WBC耗尽效率之外，该测定还用于测试耗尽原理对以低频率（1-20个细胞/测 试）存在的CEC的作用。
[0045]使用CellSearchCEC测定，在CellTracksAutoPrep系统上处理 4mlEDTA血液。 富集的细胞分别用核酸染料（DAPI)和缀合至藻红蛋白染料（PE)的抗CD105进行染色，以 鉴定所有细胞和CEC。在本实例中，抗⑶45-FITC用于标记白血细胞。在染色步骤后，将样 品重悬浮于320ul缓冲液中，并且转移至CellSearch分析药液筒，用于在CellTracks分析 仪II上分析。CellTracks分析仪II是4色荧光显微镜，其以4种不同颜色扫描，分析图像 且呈现在DAPI和⑶105-PE中阳性的图像。对于DAPI和⑶105阳性且对于⑶45阴性的细 胞作为CEC进行计数。样品中存在的WBC总数目基于DAPI阳性进行计数。
[0046] 对于耗尽步骤，在富集和染色后，将样品重悬浮于900ulPBS/1%BSA中。随后如 实例4中所述，将样品加入涂布有抗FITC的微量滴定板。在一小时后，抽吸样品，并且使用 磁性分离器浓缩至320ul。随后将样品（320ul)转移至药液筒，用于在CellTracks分析仪 II上分析。如上所述测定CEC和WBC的数目。CEC和WBC的数目在WBC耗尽前和耗尽后进 行比较。来自该研究的结果显示于表4a中。
[0047] 表4a:在WBC耗尽前和耗尽后的CEC和WBC数目
[0048]
[0049] 结果明确显示在CEC测定中富集后，WBC也可从CEC中去除（>75% )。另外，在耗 尽前和耗尽后的CEC数目中不存在差异（8. 6相对于8)。数据指示靶细胞即使以极低频率 (〈20个细胞）存在时，它们也未被去除。
[0050] 实例5 :在CellSearchProfile试剂盒富集的样品中的WBC耗尽的分子测量
[0051] 使用经修饰的CellSeachCTCProfile试剂盒，在AutoPrep上处理来自6个健康 供体的一式两份的7. 5mlEDTA血液。Profile试剂盒中的PBS/生物素试剂补充有最终试 剂浓度为2ug/ml的抗CD45-FITC，使得WBC的标记在AutoPr印上发生。在AutoPr印富集 后，对来自每个供体的一个管实施"耗尽"方案，其去除来自样品的WBC，或实施"非耗尽"方 案，其充当对照以测量不含耗尽过程的情况下在样品中的WBC污染。
[0052] 非耗尽方案
[0053] 样品从AutoPrep中取出且置于磁体上15分钟。抽吸缓冲液，并且使细胞在RLT 缓冲液（Qiagen)中裂解。
[0054] 耗尽方案
[0055] 在AutoPre富集后，通过磁性分离15分钟，通过用2mlPBS/1 %BSA将样品洗涤 2次，去除过量⑶45-FITC。将最终样品重悬浮于900ulPBS/5%BSA中，并且随后施加于 涂布有抗FITC的孔。样品伴随每15分钟的轻轻混合温育1小时。在一小时后，从孔中取 出300ul上清液，且将细胞置于磁体上15分钟。去除上清液，并且使细胞在RLT缓冲液 (Qiagen)中裂解。
[0056] 对于耗尽和非耗尽样品两者，使用QiagenAllPrep试剂