分透析后，再用2000 mL蒸懼水透析,最后用3000mL三蒸去离子水透析；然后4°C, 12000r/min离心30min,弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。做SDS-PAGE电泳，鉴定单克隆抗体的纯度。
[0018]2.4兔抗鼠IgG抗体的制备
用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG。
[0019]3、样品预处理方法
3.1苹果前处理方法:用均质器均质样品，称取(2.0±0.lg)均质后的苹果样品到10mL聚苯乙烯离心管中，分别加入4 mL复溶工作液，2 mL甲醇，用涡旋仪涡动5min ;室温下4000r/min离心5 min ;取上清液200 μ L，加入到800 μ L复溶工作液中，充分混匀，取其50 μ L用于分析。
[0020]3.2玉米前处理方法:用均质器均质样品，称取(2.0±0.lg)均质后的玉米样品到10 mL聚苯乙烯离心管中，分别加入4 mL 10%氯化钠,2 mL甲醇,用润旋仪振动5 min ;室温下4000r/min离心5 min ;取上清液100 μ L,加入到900 μ L复溶工作液中，充分混勻，取其50 μ L用于分析。
[0021]3.3蔬菜前处理方法:用均质器均质样品称，取(1.0±0.lg)均质后的蔬菜样品到10 mL聚苯乙烯离心管中，加入2 mL 0.lmol / L硫酸,再加入5 mL甲醇,用润旋仪润动5min ；,室温下室温下4000r/min离心5 min ;取上清液200 μ L,加入到800 μ L复溶工作液中，充分混匀，取其50 μ L用于分析。
[0022]4、制备试剂盒和检测样品
取溶解于50 mmol/L PBS pH7.0的5g/L兔抗鼠抗体l~2mL，经Η)_10柱转换缓冲条件，洗脱液为含 0.155mmol/L NaCl 的 50 mmol/L Na2C03-NaHC03 pH8.5 缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释兔抗鼠抗体至2g/L。取500^1000 μ L稀释后的兔抗鼠抗体加入含0.2~0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30°C磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/LTris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(lX40cm)层析,A2S。监测收集蛋白峰，稀释分装备用。
[0023]4.2包被板固相抗原制备
将MP-0VA用50mmol/LNa2C03-NaHC03 pH9.6缓冲液稀释至lmg/L的包被液，96孔包被板各孔加100 μ L，4°C放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150 μ L含3g/L OVA的上述缓冲液封闭，4°C放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置_20°C冷冻保存。
[0024]4.3试剂的配制
(1)MP标准品溶液配制:将MP标准品，稀释成为Ong/mL，0.01ng/mL, 0.025ng/mL,0.1ng/mL, 0.25ng/mL, Ing/mL, 2.5ng/mL, 1 Ong/mL, 25ng/mL, lOOng/mL 系列浓度，稀释液为0.lmol/L pH7.5磷酸盐缓冲液；
(2)缓冲液:8mmol/LNaCl、0.2% 0VA、50 μ mol/L 二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.lmL/LTweeen-80 和 0.l%NaN3 的 50mmol/L Tris-HCl ρΗ7.8 ；
(3)洗涤液为:14.5mmol/LNaCl、0.2mL/L Tweeen-80 和 0.2%NaN3 的 50mmol/LTris-HCl pH7.8 ；
(4)增强液的配制:由15μηιο1β _萘甲酰三氟丙酮、50 μ mol三正辛基氧化膦和lmL曲拉通X-100加入pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液中，再定容至1L配制而成。
[0025]4.4试剂盒提供的试剂
基于上述制备的试剂，本发明用于检测甲基对硫磷(MP)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒包括如下材料:
(1)96孔酶标板XI块；
(2)MP标准品 lmg/mL/ 瓶；
(3)抗MP抗体冻干品，用时用0.5 mL蒸馏水溶解；
(4)Eu3+-兔抗鼠抗体冻干品，用时用0.5 mL蒸馏水溶解；
(5)增强液:15mL；
(6)10X洗涤液:30mL ；
(7)缓冲液:30mL。
[0026]4.5测定之前注意事项:
A.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30°C)；
B.使用之后立即将所有试剂放回2-8°C；
C.如果样品量大建议使用多通道移液器；
D.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔；
E.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8°C。
[0027]4.6具体检测步骤如下:
取MP-0VA板条，加入50 μ?的ΜΡ到各自的微孔中，加50 μ?以缓冲液稀释的抗ΜΡ抗体，25°C?37°C振荡0.5~1小时，洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗体，25°C?37°C振荡0.5~1小时，洗涤液洗6次，加200 μ?增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的MP含量。
[0028]4.7按下列步骤制备试剂盒和检测苹果、玉米、蔬菜样品:
(1)制备试剂盒同实施例的4；
(2)具体检测步骤如下:
苹果前处理方法:用均质器均质样品，称取(2.0±0.lg)均质后的苹果样品到10 mL聚苯乙烯离心管中，分别加入4 mL复溶工作液，2 mL甲醇，用涡旋仪涡动5min;室温下4000r/min离心5 min ;取上清液200 μ L，加入到800 μ L复溶工作液中，充分混匀，取其50 μ L用于分析；
玉米前处理方法:用均质器均质样品，称取(2.0±0.lg)均质后的玉米样品到10 mL聚苯乙烯离心管中，分别加入4 mL 10%氯化钠，2 mL甲醇，用涡旋仪振动5 min ;室温下4000r/min离心5 min ;取上清液100 μ L，加入到900μ?复溶工作液中，充分混匀，取其50μ?用于分析；
蔬菜前处理方法:用均质器均质样品称，取(1.0±0.lg)均质后的蔬菜样品到10 mL聚苯乙烯离心管中，加入2 mL 0.lmol / L硫酸,再加入5 mL甲醇,用润旋仪润动5 min;,室温下室温下4000r/min离心5 min ;取上清液200 μ L，加入到800 μ L复溶工作液中，充分混匀，取其50μ?用于分析；
取ΜΡ-OVA板条，加入50 μ?的ΜΡ到各自的微孔中，加50 μ?以缓冲液稀释的抗ΜΡ抗体，25°C?37°C振荡0.5~1小时，洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗体，25°C?37°C振荡0.5~1小时，洗涤液洗6次，加200 μ?增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的MP含量。
【主权项】
1.一种检测甲基对硫磷(MP)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于:由多孔包被板，缓冲液，甲基对硫磷标准品，甲基对硫磷的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。2.一种根据权利要求1所述检测甲基对硫磷(MP)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于: (1)将甲基对硫磷(MP)与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原； (2)将甲基对硫磷(MP)与卵血清蛋白偶联，得到包被原； (3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗甲基对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株； (4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗甲基对硫磷的单克隆抗体 (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体； (6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物； (7)将步骤￠)的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的甲基对硫磷(MP)含量。3.根据权利要求1所述检测甲基对硫磷(MP)的时间荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于:所述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多微孔包被板作为固相载体。4.根据权利要求1所述检测甲基对硫磷(MP)的时间荧光分辨免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于:所述的衍生试剂是丁胺。5.根据权利要求1所述检测甲基对硫磷(MP)的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于:所述的催化剂是腈基磷酸二乙酯。6.根据权利要求1所述检测甲基对硫磷(MP)的时间荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于:所述步骤(6)和(7)具体为取包被有MP-0VA的微孔包被板，加入50 μ?处理好的样品到各自的微孔中，加入50 μ?以缓冲液稀释的甲基对硫磷抗体，25~37°C振荡0.5~1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100 μ? Eu3+-羊抗鼠抗体，25~37°C振荡.0.5~1小时，洗涤液洗六次，加200 PL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的甲基对硫磷(MP)含量。
【专利摘要】本发明公开了一种检测甲基对硫磷（MP）的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。所述检测甲基对硫磷的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、甲基对硫磷标准品、甲基对硫磷的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测甲基对硫磷的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105319366
【申请号】CN201410349743
【发明人】洪霞, 杜霞
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年7月22日