一种吡咯并喹啉醌pqq二钠盐杂质的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] -种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，属于化学药物杂质研究的技 术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于环境等因素的影响，化学性肝损伤越来越多。而化学性肝损伤极易发 展为肝硬化。目前在国际上尚未有明确的治疗药物，因此，急需安全有效的化学性肝损伤防 治药物。
[0003] PQQ(吡略并喹啉醌，pyrroloquinolinequinone)是多种氧化还原酶的辅基，广泛 存在于动植物体内，因具有强大的清除自由基功能而在体内发挥重要作用。它能有效预防 和治疗四氯化碳引起的肝损伤，对酒精性脂肪肝的预防和治疗具有显著作用，有望成为新 型的肝损伤防治药物，具有良好的临床应用前景。
[0004] PQQ可以通过生物生产方法进行制备，但生物法生产及分离纯化困难且成本奇高。 本公司经过优化工艺路线和工艺条件，通过化学合成的方法直接制备得到水溶性更好的 PQQ二钠盐。
[0005] 药品在临床使用中会产生一些不良反应，这个不良反应除了与药品本身的药理活 性有关外，与药品中存在的杂质也有很大的关系。因此，对于化学药品各个国家药典均在附 录中设有专门的杂质检查通则，中国药典（ChP)二部从（2005)开始附录中设有药物杂质研 究指导原则，国家食品药品监督管理局也发布了《化学药物杂质研究的技术指导原则》。针 对药品中的杂质，必须依据其生理活性制定其质控限度，其中包括：药品中的杂质被有效的 分离，从而保证药品质量，减少药物的不良反应。
[0006] 杂质的分离制备是药物研究中最为关键的技术之一。由于PQQ分子结构的特殊 性，在化学合成中易引入类似结构副产物，由于其化学结构的相似性，传统的分离方法如萃 取、重结晶、蒸馏和TLC都很难将其分离。分析型的HPLC只能获得μg级的产物，为了获得 高纯度的PQQ二钠盐，需提取其主要杂质并进行结构确证。我们首次采用制备高效液相色 谱经过优化制备分离条件、优化分析条件、考察上样载量；后处理中，由于PQQ结构的复杂 性，普通的有机溶剂体系很难将其与杂质分离，由于流动相采用了特殊的试剂，使后处理也 非常困难。我们通过考察样品的稳定性，如耐高温，所加盐浓度、所调pH值、并尝试用冷藏 洗出办法，最终将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得l〇〇mg的杂质产物，并采用高分 辨质谱（HRMS)、红外吸收光谱（IR)、核磁共振谱（NMR)对杂质的化学结构式进行确证，最终 确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。 相关研究国内外未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，最终将 PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得l〇〇mg的杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS)、红 外吸收光谱（IR)、核磁共振谱（NMR)对杂质的化学结构式进行确证，最终确证其分子式及 化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。
[0008] 本发明的技术方案：一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，步骤为： (1) PQQ溶解性的考察：在含10%四丁基氢氧化铵的0. 04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH 7. 0)作溶剂时PQQ溶解度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求； (2) 优化制备分离条件 选择四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，选用〇. 04M磷酸二氢铵作缓冲体系； 色谱柱的选择：选择GPC18型号的色谱柱； 流动相配比的优化： 流动相A:Buffer的配制：称取12. 974g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，4. 6g磷酸二 氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH7. 0 ;用0. 45μm滤膜过滤； 流动相B:乙腈ACN; 流动相A/流动相B的体积比为80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰 对称性较好； pH值的影响：选择pH7.0 ; (3) 制备柱上的分离 上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液，0. 45μm滤膜过滤； 选择柱子：GPC18 :5μπι，21· 2X250mm; 流动相采用：Buffer:ACN= 80 ~70 : 20 ~30,v/v; 柱温:室温； 流速：20mL/min; 进样体积：10mL; 压力：1756psi; 检测波长：225nm; (4) 收集的杂质纯度鉴定 a、 收集液的处理 浓缩：将制备柱得到的收集液在60°C下旋转浓缩5倍，得浓缩液； 盐析：在浓缩液中加入1. 5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达 至IJ0. 8-1. 0M，用HC1调至pH2. 0 ;将上述溶液在4°C下静置48h; 过滤：用0. 45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出，再次用去离子水洗涤沉淀2次； 干燥：将带沉淀的滤膜置于40°C下真空干燥24h; 将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重；包装； b、 样品纯度鉴定 分析柱：GPC18 :5μπι，4· 6X250mm; 流动相：Buffer:ACN体积比70 : 30; 柱温:室温； 流速：1mL/min; 进样体积：20μL; 检测波长：225nm; 分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备产物为目标杂质，所制备产 物的纯度大于95% ; (5)杂质结构鉴定 所收集的杂质组分采用质谱MS/高分辨质谱HRMS、红外吸收光谱IR、核磁共振谱NMR对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称，即本杂质的分子式为 C14H3N20sClNa2，化学名称为3-氯-1H-吡咯[2, 3-f]P奎啉-2, 7, 9-三羧酸-二钠盐。
[0009] 本发明的有益效果：本发明将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得100mg的 杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS)、红外吸收光谱（IR)、核磁共振谱（NMR)对杂质的化学 结构式进行确证，最终确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂 质限量提供可靠依据。
【附图说明】
[0010]图 1 分析柱高效液相色谱图（GPC18 (5μL?，4. 6X250mm，Buffer/ACN在 80/20，lmg/mLPQQ，进样体积：10yL，流速：1mL/min，检测波长：225nm) 图2制备高效液相色谱图，（GPC18 (5μπι，21.2X250mm)，0. 04M磷酸二氢铵缓冲 溶液含 10% 四丁基氢氧化铵（pH7.0) :ACN= 75 : 25 (v/v)，10mg/mLPQQ，流速：20 mL/min，进样体积：10mL，检测波长：225nm) 图3?00杂质纯度鉴定色谱图，间（：18(54111，4.6\250臟），流动相：含10%四丁基 氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液：ACN= 70 : 30 (V/v)，lmg/mLPQQ杂质，流速： 1mL/min，进样体积：20yL，检测波长：225nm] 图4PQQ杂质红外光谱图 图5PQQ杂质质谱图 图6PQQ杂质核磁氢谱图 图7PQQ杂质核磁碳谱图。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1.样品溶解性的考察 由于制备型液相色谱要求进样量大，样品浓度过低引起进样体积太大，高浓度的溶质 超载，在分离过程中可以避免大体积引起的峰的扩张。因此，必须找到合适的溶剂达到一定 的溶解度才能在制备色谱柱上有效分离，并获得一定的制备量。
[0012] 分别用去离子水、甲醇、乙腈（CAN)、含10%四丁基氢氧化铵的0. 04M磷酸二氢铵缓 冲溶液（pH7.0)(Buffer)，Buffer/ACN(7:3)、考察PQQ在不同溶剂中的溶解度。结果见 下表：
在含10%四丁基氢氧化铵的0. 04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7. 0)作溶剂时，PQQ溶解 度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求。
[0013] 实施例2.优化制备分离条件 化学合成中的制备色谱条件一般选择参考分析柱色谱条件，再扩大到同类型的制备柱 分离。对未知样品的提取和纯化，通常采用分析柱探索分离条件，然后按规模放大分离。一 般情况下，制备色谱的分离度应该大于1. 25,根据制备规模选择制备色谱柱、放大进样量、 流速等，最后在制备色谱中再进行适当调整。
[0014] 制备色谱是在非线性范围内运行，属于非线性色谱，分析色谱是线性色谱。因此许 多用于分析型液相色谱的概念或参数在制备色谱中不太适用，使用这分析色谱的一些方法 很容易引入歧途。常见问题是在制备色谱中很少考虑分离度、柱效和杂质峰型的对称性，在 分析柱上能够与杂质分离，但放大到制备柱上，峰会产生漂移，很难达到理想的效果。
[0015] 2. 1分析柱分离条件优化 文献报道PQQ的分析方法有采用乙腈/水进行梯度洗脱，主峰与杂质峰不能达到有效 分离，这种体系根本无法用于杂质制备。最新分析方法采用离子对色谱乙腈-四丁基溴化 铵-磷酸二氢钾体系能在分析柱上将PQQ与杂质有效分离，但考虑到最终我们要进行杂质 组分回收，流动相首先应使制备组分有较大的溶解度，且容易从纯化后的组分中除去，最终 制备的组分必须进行质谱核磁等分析，因此流动相应尽少带入其他离子。因此我们进行了 改进，选择四丁基氢氧化铵（10%水溶液）(水溶性好于四丁基溴化铵，而且少引入溴离子)作 为离子对试剂，相对应的我们选用磷酸二氢铵作缓冲体系（少引入钾离子)。在此条件下我 们在分析柱上探索最佳分离条件。与文献方法相比，我们的目的是要制备得到杂质，因此更 要关注杂质峰的峰型和对称性，这是一个重大的挑战。
[0016] 2. 1. 1色谱柱的选择 我们选择不同基质键合的C18柱（SepaxHP、Amethyst_P、GP C18等)试验。与SepaxHP、Amethyst-P柱相比，经优化键合的GP C18填料硅羟基表面覆盖度更高而使色谱保留更强， 分离度更佳，杂质峰的对称性更好。采用文献方法的Amethyst-P柱虽然在