分析柱上可以与 杂质分离，但放大到制备柱上很难制备得到纯度较高的杂质。因此我们最终选择GP C18这 个型号的色谱柱。
[0017] 在GP C18 (5 μ m，4. 6X250 mm)进行分离条件优化： 2. 1. 2流动相配比的优化 流动相A (Buffer)的配制：称取12. 974g四丁基氢氧化铵水溶液（10%)，4. 6g磷酸二 氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH7.0。0.45μm滤膜过滤。
[0018] 流动相B:乙腈（ACN)。
[0019] Buffer/ACN在80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰对称性较好。
[0020] 2.1.3pH值的影响 离子对试剂对pH值比较敏感，因为pH值影响溶质的离子化程度，影响溶质的保留。 在某一pH值范围内溶质分子和配对离子都处于离子状态，容易生成离子对，此时保留值 最大。本发明选择pH7.0时，PQQ与杂质能有效分离，而且杂质峰型较好，与文献方法pH 2. 5~3. 0相比，本试验的条件下柱效高，寿命长。色谱图见图1。
[0021] 实施例3制备柱上的分离 由于本试验是要获得含量极低、价值高、难分离的杂质。因此采用小颗粒（5μπι)大内 径的柱子，通过调整分离方程中的有关参数来达到分离的最佳化。由于PQQ分子的特殊性， 在逐步放大的过程中发生分离曲线的变化，我们最终选择柱子：GPC18 (5μπι，21.2Χ250 mm)，流动相稍作调整采用：含10%四丁基氢氧化铵的0.04Μ磷酸二氢铵缓冲溶液（pH 7.0) :ACN= 75 : 25 (v/v);柱温：室温；流速：20mL/min;进样体积：10mL;压力：1756 psi;检测波长：225nm〇
[0022] 3. 1流速的选择 制备产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。由于我们采用的是小颗粒的柱子，过大 的流速会造成柱压过高。最终我们选择流速：20mL/min，压力：1756psi，达到了理想的 分离效果。
[0023] 3. 2上样量 上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液。0. 45μm滤膜过滤。
[0024]制备高效液相色谱的产率和上样载量有关，但样品的容量和柱横截面有关，超过 上样载量后会降低分辨率，影响制备产物的纯度。
[0025] 10mg/mL的PQQ溶液，当进样体积大于10mL时，分辨率下降，所收集的组分含量降 低，最终我们进样量选择10mL。色谱图见图2。
[0026](GPC18 (5ym，2L2X250mm)，含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓 冲溶液（pH7.0) :ACN= 75 : 25 (v/v)，流速：20mL/min，进样体积：10mL) 实施例4.纯度鉴定 收集后的样品组分有机溶剂一般采用热的氮气流吹或者旋转蒸发方式除去，水分采用 冷冻干燥除去。本试验由于PQQ结构的特殊性，普通的有机溶剂方法除流动相很难达到分 离制备的目的，由于流动相采用了特殊的试剂给产品的回收造成了极大的困难。本试验采 用探索了多种回收方法。最终处理方法如下： 4. 1收集液的处理 浓缩：将制备柱得到的收集液在60°C下旋转浓缩5倍左右，得浓缩液； 盐析：在浓缩液中加入1. 5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达 到0· 8-L0M，用HC1调至pH2. 0。将上述溶液在4°C下静置48h; 过滤：用0. 45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出。再次用去离子水洗涤沉淀2次； 干燥：将带沉淀的滤膜置于40°C下真空干燥24h; 将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重。包装。
[0027] 4. 2样品纯度鉴定 分析柱：GPC18 (5ym，4.6X250mm); 流动相：含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液：ACN= 70 : 30 (v/v);柱温：室温；流速：1mL/min;进样体积：20yL;检测波长：225nm。
[0028] 分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备杂质为目标杂质。所制 备产物的纯度大于95% (归一法)。
[0029] 实施例5杂质结构鉴定 所收集的杂质组分采用质谱（MS) /高分辨质谱（HRMS)、红外吸收光谱（IR)、核磁共振 谱（NMR)对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称。
[0030] 确证化学结构的方法 本品为PQQ中间体杂质，按PQQ最后一步的合成方法(在NaOH/NaCl/THF下反应脱酯成 羧酸，再调pH3. 0得到其二钠盐)，其氢谱中除活泼质子外，只观察到1个不饱和质子，结合 其化学位移值，其3-位烯Η消失；碳谱中也只观察到1个不饱和叔C，而总的C数还是14 个；质谱（ESI-)中，得到m/z363的准分子离子峰(不含Na离子)，比PQQ多34,同时观察 到明显的M+2峰，峰强度约为Μ峰的1/3,结合这二点，确定此产物为其3-位质子被氯原子 (C1)取代；高分辨质谱（ESI-)测得其合理的分子式SC14H5N20sC1 (不含Na离子形式)，再 结合其工艺过程，应为其二钠盐形式，即本品的分子式为C14H3N20sClNa2，即为3-氯-1H-吡 咯[2, 3-f]喹啉-2, 7, 9-三羧酸-二钠盐；其结构式如下： y：
详细结果如下： 5.1 质谱（MS)/高分辨质谱（HRMS):仪器：Agilent1260-6230TOFLC-MS质谱仪，溶 剂：甲醇，离子化方式：ESI(-)，120V，质谱数据见表1 表1.PQQ杂质样品的质谱测定结果
5. 2红外吸收光谱（IR) 仪器：BrukerTENSOR27型红外光谱仪，方法：KBr压片法，PQQ杂质样品的红外吸收 光谱测试数据见表2 表2PQQ杂质样品的红外吸收光谱测定结果
5. 3核磁共振谱（NMR)，仪器：BRUKERAV-600型核磁共振仪，溶剂：DMS0-d6,温度： 303K，内标：TMS; 测试数据见表3、表4。
[0031]表3. PQQ杂质样品的氢谱测定结果
表4. PQQ杂质样品的碳谱测定结果
【主权项】
1. 一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，其特征在于步骤为： (1) PQQ溶解性的考察：在含10%四丁基氢氧化铵的0. 04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH 7. 0)作溶剂时PQQ溶解度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求； (2) 优化制备分离条件 选择四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，选用〇. 04M磷酸二氢铵作缓冲体系； 色谱柱的选择：选择GPC18型号的色谱柱； 流动相配比的优化： 流动相A:Buffer的配制：称取12. 974g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，4. 6g磷酸二 氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH7. 0 ;用0. 45μm滤膜过滤； 流动相B:乙腈ACN; 流动相A/流动相B的体积比为80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰 对称性较好； pH值的影响：选择pH7.0 ; (3) 制备柱上的分离 上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液，0. 45μm滤膜过滤； 选择柱子：GPC18 :5μπι，21· 2X250mm; 流动相采用：Buffer:ACN= 80 ~70 : 20 ~30,v/v; 柱温:室温； 流速：20mL/min; 进样体积：10mL; 压力：1756psi; 检测波长：225nm; (4) 收集的杂质纯度鉴定 a、 收集液的处理 浓缩：将制备柱得到的收集液在60°C下旋转浓缩5倍，得浓缩液； 盐析：在浓缩液中加入1. 5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达 至IJ0. 8-1. 0M，用HC1调至pH2. 0 ;将上述溶液在4°C下静置48h; 过滤：用0. 45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出，再次用去离子水洗涤沉淀2次； 干燥：将带沉淀的滤膜置于40°C下真空干燥24h; 将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重；包装； b、 样品纯度鉴定 分析柱：GPC18 :5μπι，4· 6X250mm流动相：Buffer:ACN体积比70 : 30; 柱温:室温； 流速：1mL/min； 进样体积：20μL; 检测波长：225nm; 分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备产物为目标杂质，所制备产 物的纯度大于95% ; (5)杂质结构鉴定 所收集的杂质组分采用质谱MS/高分辨质谱HRMS、红外吸收光谱IR、核磁共振谱NMR对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称，即本杂质的分子式为 C14H3N20sClNa2，化学名称为3-氯-1H-吡咯[2, 3-f]P奎啉-2, 7, 9-三羧酸-二钠盐。
【专利摘要】一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，属于化学药物杂质研究技术领域。PQQ是多种氧化还原酶的辅基，对酒精性脂肪肝的预防和治疗具有显著作用，有望成为新型的肝损伤防治药物，具有良好的临床应用前景。针对药品中的杂质，必须依据其生理活性制定其质控限度，其中包括：药品中的杂质被有效的分离，从而保证药品质量，减少药物的不良反应。杂质的分离制备是药物研究中最为关键的技术之一。本发明将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得100mg的杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS）、红外吸收光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）对杂质的化学结构式进行确证，最终确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。
【IPC分类】G01N33/15, G01N1/34
【公开号】CN105334301
【申请号】CN201510843823
【发明人】胡名扬, 鲁秀强, 朱理伟
【申请人】潍坊盛瑜药业有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月27日