一种氨基酸（酪氨酸）同分异构体的鉴别方法
【专利摘要】一种芳香族氨基酸同分异构体DL?m?酪氨酸（间羟基苯丙氨酸）和L?酪氨酸（对羟基苯丙氨酸）的鉴别方法，其特征在于：应用“H2SO4?NaBrO3?[CuL](ClO4)2?苹果酸”非线性化学振荡体系作为鉴别溶液，根据酪氨酸同分异构体对该体系产生的抑制时间不同，进而实现对酪氨酸同分异构体的鉴别；[CuL](ClO4)2中L为5,7,7,12,14,14?六甲基?1,4,8,11?四氮杂十四?4,11?二烯。本发明所涉及的鉴定方法所提供的振荡图谱具有直观性，可以方便快捷地鉴别出氨基酸同分异构体DL?m?酪氨酸和L?酪氨酸，而且设备简单、准确度高、易于操作和观察。
【专利说明】
-种氨基酸(酪氨酸)同分异构体的鉴别方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种区分鉴别酪氨酸同分异构体的方法。具体地说，是应用巧2S^- 化化化-[CuLKCl化)2 -苹果酸"非线性化学振荡体系作为鉴别溶液，其中[CuLKCl化)2 作为催化剂，L为5, 7, 7，12，14，14-六甲基-1，4, 8，11-四氮杂十四-4，11-二締，苹 果酸为有机底物。将酪氨酸同分异构体分别加入非线性化学振荡体系，根据酪氨酸同分异 构体对该振荡体系产生的抑制时间不同，进而实现对酪氨酸同分异构体的区分鉴别。
【背景技术】
[0002] 酪氨酸(tyrosine;Tyr)是人类成长过程中必不可少的氨基酸，如果体内缺乏酪氨 酸则可能会导致出现智能下降，白化病等症状。当前国内外已普遍开始重视食品中酪氨酸 含量的添加。因此，准确、灵敏的测定酪氨酸在营养学和临床医学上具有重要意义。由于化- m-酪氨酸（间径基苯丙氨酸)和心酪氨酸(对径基苯丙氨酸)分子式相同、结构相近，因此使 得他们的一些物理和化学性质也相似，且两者的外观也极为相似，导致两者难W区分，其结 构如下式。目前虽然已有很多报道关于定量分析酪氨酸浓度的方法，例如HPLCtU、电化学分 析法、化学发光法W、毛细管电泳法W。但是，关于对化-m-酪氨酸（间径基苯丙氨酸)和 k酪氨酸(对径基苯丙氨酸)两种同分异构体的区分鉴别尚无报道。因此，迫切需要一种鉴 定效果好且操作简便快速、结果容易判断的方法来鉴别运两种物质。
[0003]
【发明内容】
[0004] 本发明旨在为芳香族氨基酸同分异构体化-m-酪氨酸和心酪氨酸提供一种新颖且 方便快捷的区分鉴别方法，即应用KuLKCl化)2催化的非线性化学体系对化-m-酪氨酸和心 酪氨酸的鉴别方法，本鉴别方法是基于该配合物催化的非线性化学体系对芳香族氨基酸同 分异构体的敏锐响应而开发的一种电化学振荡体系法。具体地说，是将相同浓度待鉴别样 品（DL-m-酪氨酸或心酪氨酸)分别加入到两组振荡体系中，根据待鉴别样品对振荡体系所 产生的抑制时间（tin)长短，实现对待鉴别样品的定性分析:若振荡体系产生的抑制时间 (tin)较长，则所加待鉴别样品为化-m-酪氨酸;若振荡体系产生的抑制时间（tin)较短，则所 加待鉴别样品为心酪氨酸。且本发明快速处理样品，测定条件简单易控制便于推广和应用。
[0005] 本发明解决技术问题，采用如下技术方案： 本发明为芳香族氨基酸的同分异构体(DL-m-酪氨酸和心酪氨酸)提供了鉴别方法，其 特点在于： W硫酸为溶剂，配制待鉴别样品的溶訂复； 应用巧2S化-化化化-[化L](C104)2-苹果酸"非线性化学振荡体系作为鉴别溶液， 记录振荡体系的振荡图谱。任意一个稳定的电位最低点处，向振荡体系中加入待鉴别样品 的溶液，根据待鉴别样品对振荡体系所产生的抑制时间（tin)不同，实现对待鉴别样品的定 性分析； 所述待鉴别样品为化-m-酪氨酸或心酪氨酸； 向两组鉴别溶液(非线性体系）中，分别加入待鉴别样品（酪氨酸的同分异构体化-m-酪 氨酸或レ酪氨酸）的溶液，可W发现振荡反应会受到抑制，然后经过一段抑制期后振荡恢 复。但化-m-酪氨酸和心酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间不同：Dkm-酪氨酸对体系产生 的抑制时间（tin)较长，而心酪氨酸对体系产生的抑制时间（tin)较短。因此，通过比较抑制 时间的长短即可定性鉴别出其种类:抑制时间长的待鉴别样品为化-m-酪氨酸，抑制时间短 的待鉴别样品为心酪氨酸。另外，实验结果表明，W加入体系中的待测液化-m-酪氨酸的浓 度C(Tyr)为横坐标，振荡体系产生的抑制时间（tin)为纵坐标作图，可得到一条线性直线；W 加入体系中的待测液k酪氨酸的浓度C(Tyr)为横坐标，振荡体系产生的抑制时间（tin)为纵 坐标作图，可得到另一条线性直线;运两条直线的斜率不同，其中，W化-m-酪氨酸浓度为横 坐标得到的直线，其斜率更大。
[0006] 本发明所用的催化剂是四氮杂大环铜[加 LKCl化)2,其中配体L为5,7,7,12,14， 14-六甲基-1，4,8，11-四氮杂十四-4,11-二締;结构式如式(1)所示，
[0007] 本发明中四氮杂大环催化剂起着至关重要的作用，其配置主要分为两个步骤n-w: 1) Cl 姐 32N4.2HC104 (L.2肥 1〇4)的合成；2) [CU(C1抽 32N4)].(C104)2 ( [CuL](C1〇4)2) 的合成。
[000引 1)。姐32抓? 2肥104化? 2肥104)的合成： 按文献的方法，该反应一直在冰浴条件下进行。在500 mL的=颈瓶中加入98.5mL乙二 胺，用滴液漏斗缓慢滴加126 mL70%高氯酸，调节磁力揽拌器的揽拌速度为50化/min。最初 的反应剧烈并伴有白烟产生，所W滴加速度控制在每5秒钟1滴，如果滴加太快溶液在漏斗 底部形成冰柱而造成漏斗堵塞。随着反应进行白烟逐渐减少，反应的剧烈程度也逐渐缓和 可W适当加快滴加速度，直到滴加完为止，得到透明的溶液。向该透明溶液加入224 mL无水 丙酬并剧烈揽拌，溶液很快变浑浊同时形成非常粘稠混合物。此时应当适当提高揽拌速度， 调节揽拌速度为lOOOr/min，仍然在冰水浴的条件下保持2-3小时W便充分反应。最后得到 乳黄色粘稠液，将所得粘稠液转移到布氏漏斗进行抽滤分离，并用丙酬充分洗涂，可得纯白 色固体。将此纯白色固体在热的甲醇-水溶液中重结晶，用硅胶干燥剂真空干燥，得80 g白 色晶体，此白色晶体为L ? 2肥104。
[0009] 2) [Cu(打6出2抓）]? (Cl〇4)2( [CuU(Cl04)2)的合成： 按文献的方法，在1000 mLS颈瓶中，分别加入25.55 g Cu(AC)2*4此0 (0.1 mol)与 等摩尔的L ? 2肥104,再加入800 mL甲醇中。热水浴加热回流3-4小时后，出现红色沉淀。将 红色沉淀过滤，滤液在热水浴上浓缩至原体积1/2，放置过夜。充分结晶后，可W得到红色晶 体。将红色晶体转移至布氏漏斗用乙醇洗涂，在热的乙醇-水溶液中重结晶，真空干燥，可得 约8 g红色[CuL](C1〇4)2晶体。
[0010]本发明设及的检测方法与现有技术的区别是，本发明应用"H2S04 -化化〇3 - [化L](C104)2 -苹果酸"的振荡体系作为鉴别溶液，W酪氨酸同分异构体对该鉴别溶液的 产生的抑制时间长短不同，实现对酪氨酸同分异构体的鉴别。芳香族氨基酸同分异构体化- m-酪氨酸和心酪氨酸，在鉴别溶液(非线性振荡体系）中的可检测的浓度范围为7.5X1(^6- 6.75 X l(T4mol/L。该待鉴别溶液可鉴别浓度范围是经实验确定的最优浓度范围，在该浓度 范围内，DL-m-酪氨酸和レ酪氨酸对振荡体系产生的抑制长短差异十分明显，易于观察分 析，容易实现鉴别。鉴别溶液中各组分的浓度范围如表1所示，经过多次实验得到的最佳溶 液如表2所示： 表1:振荡体系中各组分的浓度范围
击9 . ±臣胜知玄由欠外I A於T县/f丰、沁巧 参考文献：
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[0011] 首先，取一个50 mL小烧杯中并放入大小合适的磁子，放在恒溫磁力加热揽拌器 上，保持揽拌速度在500 r/min。向烧杯中加入振荡体系各组分溶液。把准备好的工作电极 (销电极）和参比电极（双盐桥甘隶电极）插入烧杯中，工作电极和参比电极通过放大器 (Instrument Amplifier)连接到数据采集器化0! LINK)然后再通过USB连接到电脑上。打开 装有logger Iite软件的电脑，利用logger Iite软件对溶液电位（Potential)随时间 (Time)的变化情况进行实时采集(此时尚未加入待测试样），W作空白对照。在振荡产生的 任意一个稳定的电位最低点处，向两组与空白对照实验中的各组分浓度相同的振荡体系 中，分别迅速加入待鉴别样品的溶液，根据待鉴别样品对振荡体系所产生的振荡响应不同 (抑制时间不同），实现对待鉴别样品的定性分析。
[0012] 化学电位振荡图谱的基本参数包括： 振荡振幅:在振荡过程中从一个最低电位到下一个最高电位之间的电位差值。
[0013] 振荡周期:在振荡过程中从一个最低(高）电位到下一个最低(高）电位所需时间。
[0014] 最高电位:稳定振荡时体系出现的电位最高点。
[0015 ]最低电位:稳定振荡时体系出现的电位最低点。
[0016] 抑制时间（tin):从加入待测液到重新恢复振荡所需时间。
【附图说明】
[0017] 图1是实施例1中，未加入待鉴别样品时，鉴别溶液(振荡体系）的振荡图谱。
[001引图2是实施例1中，加入6.00XlO-VoVL化-m-酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡 响应图谱。
[0019]图3是实施例1中，加入6.OOXl(TV)VL心酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡响 应图谱。
[0020] 图4是实施例2中，未加入待鉴别样品时，鉴别溶液(振荡体系）的振荡图谱。
[0021] 图5是实施例帥，加入3.75Xl〇-4mol/L Dkm-酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡 响应图谱。
[0022] 图6是实施例帥，加入3.75X I(TV)VL心酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡响应 图谱。
[0023] 图7是W实例1实例2为基础的化-m-酪氨酸(化-m-TyrWPk酪氨酸a-Tyr)浓度(C (Tyr))与抑制时间（tin)的线性关系图。
[0024] 图8是实施例3中，未加入待鉴别样品时，鉴别溶液(振荡体系）的振荡图谱。
[0025] 图9是实施例3中，加入1.44Xl〇-4mol/L化-m-酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡 响应图谱。
[0026] 图10是实施例3中，加入1.44Xl(T4mol/L心酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡响 应图谱。
[0027] 图11是实施例4中，未加入待鉴别样品时，鉴别溶液(振荡体系）的振荡图谱。
[002引图12是实施例4中，加入2.88 X l0-4mol/LDL-m-酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡 响应图谱。
[0029] 图13是实施例4中，加入2.88 X l(T4mol/L心酪氨酸后，振荡体系所获得的振荡响 应图谱。
[0030] 图14是W实例3实例4为基础的化-m-酪氨酸（化-m-TyrWPk酪氨酸a-Tyr)浓度 (C(Tyr))与抑制时间（tin)的线性关系图。
[0031] 图15是实施例5中，未加入待鉴别样品时，鉴别溶液(振荡体系）的振荡图谱。
[0032] 图16是实施例5中，分别加入1.5 X l〇-4mol/L化-m-酪氨酸后，振荡体系所获得的 振荡响应图谱。
[0033] 图17是实施例5中，分别加入1.5Xl(T4mol/L心酪氨酸后，振荡体系所获得的振 荡响应图谱。
[0034] 图18是实施例6中，未加入待鉴别样品时，鉴别溶液(振荡体系）的振荡图谱。
[0035] 图19是实施例6中，分别加入3.75 X l〇-4mol/L化-m-酪氨酸后，振荡体系所获得的 振荡响应图谱。
[0036] 图20是实施例6中，分别加入3.75X I(TV)VL心酪氨酸后，振荡体系所获得的振 荡响应图谱。
[0037] 图21是W实例5实例6为基础的化-m-酪氨酸（化-m-TyrWPk酪氨酸a-Tyr)浓度 (C(Tyr))与抑制时间（tin)的线性关系图。
【具体实施方式】 [003引实施例1: 本实施例按如下步骤验证本发明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鉴别方法的 可行性。
[0039] (1)配制溶液 首先用98.3%的浓硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用该硫酸溶液作为溶剂来配置 0.6mol/L的漠酸钢溶液、2mol/L的苹果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0040] 同时Wl mol/L硫酸为溶剂，分别配置0.6mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的溶 液。
[0041] (2)振荡图谱 首先将磁力揽拌子置于50 ml烧杯中，用移液管按如下顺序加入不同体积的W下各溶 液：Imol/L出S〇4溶液，29ml; 0.6mol/L的漠酸钢溶液，2ml; 2 mol/L的苹果酸，4ml;然后插入 销电极(工作电极)和甘隶电极(参比电极）。参比电极和销电极与通过放大器（Inshument Amplifier)连接到数据采集器(GO! LINK)然后再通过USB连接到电脑。调节揽拌器的转速 为500 r/min。在室溫下进行测量。打开logger Iite程序，进行如下操作：点击实验^数据 采集一采集长度（时间）设为3000 s。最后加入2.21X10-2mol/L的催化剂[CuL](C104)2， 5ml，使体系的总体积保持在40 ml。迅速点下开始键，电脑开始自动记录体系电位随时间变 化的实验数据，图1是电脑所记录W苹果酸为底物，四氮杂大环二締铜为催化剂的化学振荡 的图形。观察振荡溶液的颜色可W发现溶液的颜色不断的发生周期性变化:紫色-栋黄色- 紫色，且电位也呈现周期性的变化。
[0042] 取一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位最 低点时用移液枪加入40 Ul 0.6mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为6.00 X l(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图2所示。
[0043] 取另一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位 最低点时用移液枪加入40 Ul 0.6mol/L的心酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为6.00 X l(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图3所示。
[0044] (3)区分鉴别 作为芳香族氨基酸的同分异构体化-m-酪氨酸和心酪氨酸，因分子空间结构不同，其对 振荡体系产生的影响也不相同。比较图2图3可知，在第五个振荡电位最低点向两组鉴别溶 液中分别加入40 Ul 0.6mol/L化-m-酪氨酸或レ酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 6.00X10-4mol/L，Dレm-酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间（tin)较长(239.5s)，レ酪氨酸 对振荡体系产生的抑制时间（tin)较短（116s)。
[0045] 取事先配置好的两个0.6mol/L的待测液(其中一个为化-m-酪氨酸，另一个为心酪 氨酸，但两者尚未区分），将其中一个标记为样品1，另一个标为样品2。配置两组上述浓度的 振荡溶液，分别采集其振荡电位随时间的变化图谱，在振荡电位第五个最低点分别加入40 Ul 0.6mol/L的样品1溶液或样品2溶液，使得其在鉴别溶液中的浓度为6.00X l(T4mol/L。 根据logger Iite程序记录的振荡电位谱图分别记算其抑制时间。当加入待测液样品1时， 其对体系产生的抑制时间较长(239s);当加入待测液样品2时，其对体系产生的抑制时间较 短（116.5 S)。所W得出抑制时间较长(239s)的待测液样品1为化-m-酪氨酸，而相对抑制时 间较短（116.5s)的待测液样品2则为L -酪氨酸。
[0046] 实施例2: 本实施例按如下步骤验证本发明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鉴别方法的 可行性。
[0047] (1)配制溶液 首先用98.3%的浓硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用该硫酸溶液作为溶剂来配置 0.6mol/L的漠酸钢溶液、2mol/L的苹果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0048] 同时Wl mol/L硫酸为溶剂，分别配置0.375mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[0049] (2)振荡图谱 首先将磁力揽拌子置于50 ml烧杯中，用移液管按如下顺序加入不同体积的W下各溶 液：Imol/L出S〇4溶液，29ml; 0.6mol/L的漠酸钢溶液，2ml; 2 mol/L的苹果酸，4ml;然后插入 销电极(工作电极)和甘隶电极(参比电极）。参比电极和销电极与通过放大器（Inshument Amplifier)连接到数据采集器(GO! LINK)然后再通过USB连接到电脑。调节揽拌器的转速 为500 r/min。在室溫下进行测量。打开logger Iite程序，进行如下操作：点击实验^数据 采集一采集长度（时间）设为3000 s。最后加入2.21X10-2mol/L的催化剂[CuL](C104)2， 5ml，使体系的总体积保持在40 ml。迅速点下开始键，电脑开始自动记录体系电位随时间变 化的实验数据。图4是电脑所记录W苹果酸为底物，四氮杂大环二締铜为催化剂的化学振荡 的图形。观察振荡溶液的颜色可W发现溶液的颜色不断的发生周期性变化:紫色-栋黄色- 紫色，且电位也呈现周期性的变化。
[0050] 取一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位最 低点时用移液枪加入40 Ul 0.375mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 3.75Xl(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图5所示。
[0051] 取另一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位 最低点时用移液枪加入40 Ul 0.375mol/L的レ酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 3.75Xl(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图6所示。
[0052] (3)区分鉴别 作为芳香族氨基酸同分异构体化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空间结构不同，其对振 荡体系产生的影响也不相同。比较图5图6可知，在第五个振荡电位最低点分别加入40 Ul 0.375mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为3.75 X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间（tin)较长(166s)酪氨酸对振荡体系产生的抑制时 间（tin)较短(89.5s)。
[0053] 取事先配置好的两个0.375mol/L的待测液(其中一个为化-m-酪氨酸，另一个为k 酪氨酸，但两者尚未区分），将其中一个标记为样品1，另一个标为样品2。配置两组上述浓度 的振荡溶液，分别采集其振荡电位随时间的变化图谱，在振荡电位第五个最低点分别加入 40 Ul 0.375mol/L的样品1溶液或样品2溶液，使得其在鉴别溶液中的浓度为3.75 X 10- Vol/L。根据logger Iite程序记录的振荡电位图谱分别记算其抑制时间。当加入待测液 样品1时，其对体系产生的抑制时间较长(164s);当加入待测液样品2时，其对体系产生的抑 制时间较短(88 S)。所W得出抑制时间较长（164s)的待测液样品1的为化-m-酪氨酸，而相 对抑制时间较短(88s)的待测液样品2则为L -酪氨酸。
[0054] 图7是W实例1实例2为基础的化-m-酪氨酸（化-m-Tyr)和心酪氨酸化-Tyr)浓度 (C(Tyr))与抑制时间（tin)的线性关系图。
[0化5] 实施例3: 本实施例按如下步骤验证本发明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鉴别方法的 可行性。
[0056] (1)配制溶液 首先用98.3%的浓硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用该硫酸溶液作为溶剂来配置 0.6mol/L的漠酸钢溶液、2mol/L的苹果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0057] 同时Wl mol/L硫酸为溶剂，分别配置0.144mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[005引（2)振荡图谱 首先将磁力揽拌子置于50 ml烧杯中，用移液管按如下顺序加入不同体积的W下各溶 液：111101/1出504溶液，29.51111;0.611101/1的漠酸钢溶液，1.51111;2 11101/1的苹果酸，4.51111; 然后插入销电极（工作电极）和甘隶电极（参比电极）。参比电极和销电极与通过放大器 (Instrument Amplifier)连接到数据采集器(GO! LINK)然后再通过USB连接到电脑。调节 揽拌器的转速为500 r/min。在室溫下进行测量。打开logger Iite程序，进行如下操作：点 击实验^数据采集^采集长度（时间）设为3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化剂 [化L] (Cl化)2,4.5ml，使体系的总体积保持在40 ml。迅速点下开始键，电脑开始自动记录体 系电位随时间变化的实验数据。观察振荡溶液的颜色可W发现溶液的颜色不断的发生周期 性变化:紫色-栋黄色-紫色，且电位也呈现周期性的变化。
[0059] 图8是在实例3中，未加入待测样品时，鉴别溶液的振荡谱图。
[0060] 取一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位最 低点时用移液枪加入40 Ul 0.144mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 1.44Xl(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图9所示。
[0061] 取另一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位 最低点时用移液枪加入40 Ul 0.144mol/L的レ酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 1.44X l(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图10所示。
[0062] (3)区分鉴别 作为芳香族氨基酸同分异构体化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空间结构不同，其对振 荡体系产生的影响也不相同。比较图9图10可知，在第五个振荡电位最低点分别加入40 Ul 0.144mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为1.44X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间（tin)较长巧4s)酪氨酸对振荡体系产生的抑制时 间（tin)较短(35s)。
[0063] 取事先配置好的两个0.144mol/L的待测液(其中一个为化-m-酪氨酸，另一个为k 酪氨酸，但两者尚未区分），将其中一个标记为样品1，另一个标为样品2。配置两组上述浓度 的振荡溶液，分别采集其振荡电位随时间的变化图谱，在振荡电位第五个最低点分别加入 40 Ul 0.144mol/L的样品1溶液或样品2溶液，使得其在鉴别溶液中的浓度为1.44X10- Vol/L。根据logger Iite程序记录的振荡电位图谱分别记算其抑制时间。当加入待测液 样品1时，其对体系产生的抑制时间较长(53s);当加入待测液样品2时，其对体系产生的抑 制时间较短（34s)。所W得出抑制时间较长巧3s)的待测液样品1的为DL-m-酪氨酸，而相对 抑制时间较短(34s)的待测液样品2则为L -酪氨酸。
[0064] 实施例4: 本实施例按如下步骤验证本发明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鉴别方法的 可行性。
[0065] (1)配制溶液 首先用98.3%的浓硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用该硫酸溶液作为溶剂来配置 0.6mol/L的漠酸钢溶液、2mol/L的苹果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0066] 同时Wl mol/L硫酸为溶剂，分别配置0.288mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[0067] (2)振荡图谱 首先将磁力揽拌子置于50 ml烧杯中，用移液管按如下顺序加入不同体积的W下各溶 液：1111〇1/1出5〇4溶液，29.51111;0.6111〇1/1的漠酸钢溶液，1.51111;2 111〇1/1的苹果酸，4.51111; 然后插入销电极（工作电极）和甘隶电极（参比电极）。参比电极和销电极与通过放大器 (Instrument Amplifier)连接到数据采集器(GO! LINK)然后再通过USB连接到电脑。调节 揽拌器的转速为500 r/min。在室溫下进行测量。打开logger Iite程序，进行如下操作：点 击实验^数据采集^采集长度（时间）设为3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化剂 [化L] (Cl化)2,4.5ml，使体系的总体积保持在40 ml。迅速点下开始键，电脑开始自动记录体 系电位随时间变化的实验数据。观察振荡溶液的颜色可W发现溶液的颜色不断的发生周期 性变化:紫色-栋黄色-紫色，且电位也呈现周期性的变化。
[0068] 图11是在实例4中，未加入待测样品时，鉴别溶液的振荡谱图。
[0069] 取一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位最 低点时用移液枪加入40 Ul 0.288mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 2.88 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图12所示。
[0070] 取另一组鉴别溶液，当振荡反应经过4个稳定的周期后，进入第5个振荡周期电位 最低点时用移液枪加入40 Ul 0.288mol/L的レ酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 2.88 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图13所示。
[0071] (3)区分鉴别 作为芳香族氨基酸同分异构体化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空间结构不同，其对振 荡体系产生的影响也不相同。比较图12图13可知，在第五个振荡电位最低点分别加入40 Ul 0.288mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为2.88 X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间（tin)较长口5.5s)，心酪氨酸对振荡体系产生的抑制 时间（tin)较短巧3s)。
[0072] 取事先配置好的两个0.288mol/L的待测液(其中一个为化-m-酪氨酸，另一个为k 酪氨酸，但两者尚未区分），将其中一个标记为样品1，另一个标为样品2。配置两组上述浓度 的振荡溶液，分别采集其振荡电位随时间的变化图谱，在振荡电位第五个最低点分别加入 40 Ul 0.288mol/L的样品1溶液或样品2溶液，使得其在鉴别溶液中的浓度为2.88X10- Vol/L。根据logger Iite程序记录的振荡电位图谱分别记算其抑制时间。当加入待测液 样品1时，其对体系产生的抑制时间较长(77s);当加入待测液样品2时，其对体系产生的抑 制时间较短巧4 S)。所W得出抑制时间较长口7s)的待测液样品1的为DL-m-酪氨酸，而相对 抑制时间较短巧4s)的待测液样品2则为L -酪氨酸。
[0073] 图14是W实例3实例4为基础的化-m-酪氨酸（化-m-Tyr)和心酪氨酸a-Tyr)浓 度(C(Tyr))与抑制时间（tin)的线性关系图。
[0074] 实施例5: 本实施例按如下步骤验证本发明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鉴别方法的 可行性。
[00对 （1)配制溶液 首先用98.3%的浓硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用该硫酸溶液作为溶剂来配置 0.6mol/L的漠酸钢溶液、2mol/L的苹果酸溶液、2.21 X l0-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0076] 同时Wl mol/L硫酸为溶剂，分别配置0.15mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的溶 液。
[0077] (2)振荡图谱 首先将磁力揽拌子置于50 ml烧杯中，用移液管按如下顺序加入不同体积的W下各溶 液：lmol/L此S〇4溶液，28ml;0.6mol/L的漠酸钢溶液，2ml; 2 mol/L的苹果酸，5ml;然后插 入销电极（工作电极）和甘隶电极（参比电极）。参比电极和销电极与通过放大器 (Instrument Amplifier)连接到数据采集器(GO! LINK)然后再通过USB连接到电脑。调节 揽拌器的转速为500 r/min。在室溫下进行测量。打开logger Iite程序，进行如下操作：点 击实验^数据采集^采集长度（时间）设为3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化剂 [CuL] (Cl化)2，5ml，使体系的总体积保持在40 ml。迅速点下开始键，电脑开始自动记录体 系电位随时间变化的实验数据。观察振荡溶液的颜色可W发现溶液的颜色不断的发生周期 性变化:紫色-栋黄色-紫色，且电位也呈现周期性的变化。
[0078] 图15是在实例5中，未加入待测样品时，鉴别溶液的振荡谱图。
[0079] 取一组鉴别溶液，当振荡反应经过7个稳定的周期后，进入第8个振荡周期电位最 低点时用移液枪加入40 Ul 0.15mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为1.5 X l(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图16所示。
[0080] 取另一组鉴别溶液，当振荡反应经过7个稳定的周期后，进入第8个振荡周期电位 最低点时用移液枪加入40 Ul 0.15mol/L的心酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为1.5 X l(T4mol/L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图17所示。
[0081] (3)区分鉴别 作为芳香族氨基酸同分异构体化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空间结构不同，其对振 荡体系产生的影响也不相同。比较图16图17可知，在第八个振荡电位最低点分别加入40 Ul 0.15mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为1.5 X l〇-4mol/L，化-m- 酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间（tin)较长(45s)酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间 (tin)较短(29s)。
[0082] 取事先配置好的两个0.15mol/L的待测液(其中一个为化-m-酪氨酸，另一个为k 酪氨酸，但两者尚未区分），将其中一个标记为样品1，另一个标为样品2。配置两组上述浓度 的振荡溶液，分别采集其振荡电位随时间的变化图谱，在振荡电位第八个最低点分别加入 40 Ul 0.15mol/L的样品1溶液或样品2溶液，使得其在鉴别溶液中的浓度为1.5Xl(T4mol/ L。根据logger Iite程序记录的振荡电位图谱分别记算其抑制时间。当加入待测液样品1 时，其对体系产生的抑制时间较长(45.5s);当加入待测液样品2时，其对体系产生的抑制时 间较短(31 S)。所W得出抑制时间较长(45.5s)的待测液样品1的为化-m-酪氨酸，而相对抑 制时间较短(31s)的待测液样品2则为L -酪氨酸。
[0083] 实施例6: 本实施例按如下步骤验证本发明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鉴别方法的 可行性。
[0084] (1)配制溶液 首先用98.3%的浓硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用该硫酸溶液作为溶剂来配置 0.6mol/L的漠酸钢溶液、2mol/L的苹果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0085] 同时Wl mol/L硫酸为溶剂，分别配置0.375mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[0086] (2)振荡图谱 首先将磁力揽拌子置于50 ml烧杯中，用移液管按如下顺序加入不同体积的W下各溶 液：lmol/L此S〇4溶液，28ml;0.6mol/L的漠酸钢溶液，2ml; 2 mol/L的苹果酸，5ml;然后插 入销电极（工作电极）和甘隶电极（参比电极）。参比电极和销电极与通过放大器 (Instrument Amplifier)连接到数据采集器(GO! LINK)然后再通过USB连接到电脑。调节 揽拌器的转速为500 r/min。在室溫下进行测量。打开logger Iite程序，进行如下操作：点 击实验^数据采集^采集长度（时间）设为3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化剂 [CuL] (Cl化)2，5ml，使体系的总体积保持在40 ml。迅速点下开始键，电脑开始自动记录体 系电位随时间变化的实验数据。观察振荡溶液的颜色可W发现溶液的颜色不断的发生周期 性变化:紫色-栋黄色-紫色，且电位也呈现周期性的变化。
[0087] 图18是在实例6中，未加入待测样品时，鉴别溶液的振荡谱图。
[0088] 取一组鉴别溶液，当振荡反应经过7个稳定的周期后，进入第8个振荡周期电位最 低点时用移液枪加入40 Ul 0.375mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 3.75 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图19所示。
[0089] 取另一组鉴别溶液，当振荡反应经过7个稳定的周期后，进入第8个振荡周期电位 最低点时用移液枪加入40 Ul 0.375mol/L的レ酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为 3.75 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到体系出现一段抑制时间，振荡响应图谱如图20所示。
[0090] 图21是W实例5实例6为基础的化-m-酪氨酸和心酪氨酸浓度与抑制时间的线性关 系图。
[0091] (3)区分鉴别 作为芳香族氨基酸同分异构体化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空间结构不同，其对振 荡体系产生的影响也不相同。比较图19图20可知，在第八个振荡电位最低点分别加入40 Ul 0.375mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鉴别溶液中的浓度为3.75 X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸对振荡体系产生的抑制时间（tin)较长(115.5s)，心酪氨酸对振荡体系产生的抑制 时间（tin)较短(45s)。
[0092] 取事先配置好的两个0.375mol/L的待测液(其中一个为化-m-酪氨酸，另一个为k 酪氨酸，但两者尚未区分），将其中一个标记为样品1，另一个标为样品2。配置两组上述浓度 的振荡溶液，分别采集其振荡电位随时间的变化图谱，在振荡电位第八个最低点分别加入 40 Ul 0.375mol/L的样品1溶液或样品2溶液，使得其在鉴别溶液中的浓度为3.75 X 10- Vol/L。根据logger Iite程序记录的振荡电位图谱分别记算其抑制时间。当加入待测液 样品1时，其对体系产生的抑制时间较长(117s);当加入待测液样品2时，其对体系产生的抑 制时间较短(43 S)。所W得出抑制时间较长（117s)的待测液样品1的为化-m-酪氨酸，而相 对抑制时间较短(43s)的待测液样品2则为L -酪氨酸。
[0093] 图21是W实例5实例6为基础的化-m-酪氨酸（化-m-Tyr)和心酪氨酸a-Tyr)浓 度(C(Tyr))与抑制时间（tin)的线性关系图。
【主权项】
1. 一种酪氨酸同分异构体DL-m-酪氨酸（间羟基苯丙氨酸)和L-酪氨酸(对羟基苯丙氨 酸)的鉴别方法，其特征在于： 以硫酸为溶剂，配制待鉴别样品的溶液； 应用uH2SO4 - NaBrO3- [CuL](C104)2-苹果酸"非线性化学振荡体系作为鉴别溶液， 记录振荡体系的电位随时间的变化图谱;在振荡产生的任意一个稳定的电位最低点处，向 两组鉴别溶液(非线性振荡体系）中分别加入待鉴别样品的溶液，根据待鉴别样品对振荡体 系所产生的抑制时间不同，实现对待鉴别样品的鉴别； [CuL](C1〇4)2 中L为5,7,7，12，14，14-六甲基-1，4,8，11-四氮杂十四-4，11-二烯； 鉴别溶液中各组分的摩尔浓度为:硫酸〇. 75-1.35mol/L、溴酸钠7.5 X 10_3-5.25 X 10- 2mol/L、[CuL] (Cl〇4)2 1 · 38 X 10-3-4 · 75 X 10-3mol/L、苹果酸 0 · 10-0 · 30mol/L; 所述待鉴别样品为DL-m-酪氨酸或L-酪氨酸。2. 根据权利要求1所述的区分鉴别方法，其特征在于： 向两组鉴别溶液(非线性振荡体系）中分别加入相同浓度的待鉴别样品（DL-m-酪氨酸 或L-酪氨酸)后，若对振荡体系产生的抑制时间较长，则所述待鉴别样品为DL-m-酪氨酸;若 对振荡体系产生的抑制时间较短，则所述待鉴别样品为L-酪氨酸。3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:检测溶液中各组分的摩尔浓度为 溴酸钠 0·03mol/L、苹果酸0·2mol/L、硫酸lmol/L、[CuL](CKk)2 2·76X 10-3mol/L。4. 根据权利要求1或2所述的区分鉴别方法，其特征在于:所述振荡产生的任意一个稳 定的电位最低点是指振荡产生的第2~30个电位最低点中的任意一个。5. 根据权利要求1或2所述的鉴别方法，其特征在于:待鉴别样品在鉴别溶液中的可检 测的浓度范围为7.5 X 10-6-6.75 X 10-4mol/L。
【文档编号】G01N27/26GK105954332SQ201610518839
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】胡刚, 孙璇璇, 宋继梅, 胡林, 吴丁, 张望宁
【申请人】安徽大学