猪o型口蹄疫病毒抗体的elisa检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于兽用疫病检测技术领域，具体涉及一猪〇型口蹄疫病毒抗体的 ELISA检测试剂盒，可用于动物疫病流行病的检测与调查。
【背景技术】
[0002] 猪口蹄疫病（Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒引起的以患病动物 的口、蹄部出现水疱性病症为特征的传染性疫病。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其它动物。 口蹄疫病毒具有多型性、易变性，有7个血清型（A型、0型、C型、亚洲1型、南非1型、南非 2型、南非3型)，型间无交叉保护，每个血清型又分多种亚型。我国主要流行0型口蹄疫与 亚洲1型口蹄疫。口蹄疫起病急、传播极为迅速，发病率可达100%，仔猪常不见症状而猝死， 严重时死亡率可达100%。对我国养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害 养猪业健康发展的重大传染病之一，属于我国A类动物疫病。由此可见，使用猪口蹄疫相关 疫苗进行免疫注射，并对免疫效果进行在线监测以确定其是否产生相应的抗体保护水平具 有非常重大的意义。
[0003] 口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，由VPl，VP2和VP3组成衣壳蛋 白亚单位，其中VPl蛋白为序列依赖性表位，可诱导产生中和抗体。传统的ELISA方法以全 病毒作为抗原检测抗体，而生产全病毒需要昂贵的培养基，且存在散毒的危险。VPl作为口 蹄疫病毒最重要的结构蛋白，具有良好的免疫原性和特异性，可作为理想的血清学检测用 抗原。
【发明内容】
[0004] 本实用新型的目的是为了提供一种快速、有效、批量检测猪0型口蹄疫病毒抗体 的ELISA检测试剂盒。
[0005] 为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：
[0006] -种猪0型口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体，其中，所 述盒体内设有抗原包被反应板、猪〇型口蹄疫病毒抗体阳性对照血清、猪〇型口蹄疫病毒抗 体阴性对照血清、样本稀释液、20 X浓缩洗涤液、酶标记物、显色剂和终止液。
[0007] 具体的，所述的猪0型口蹄疫病毒VPl重组蛋白为利用基因工程技术提取的高纯 度的原核表达蛋白，可按本领域常规技术制备或购买市售产品均可。
[0008] 所述抗原包被反应板的规格为96孔X2(96TX2)，包被有纯化的猪0型口蹄疫病 毒结构蛋白VPl。
[0009] 所述的酶标记结合物为酶标记的羊抗猪IgG。
[0010] 所述的底物液为含有3, 3〃，5, 5〃-四甲基联苯胺（TMB)的单底物显色剂。
[0011] 本实用新型采用酶联免疫间接法，将猪0型口蹄疫病毒VPl蛋白抗原包被到抗原 反应板内，该抗原可与待检样本中的VPl抗体产生特异性结合，形成"抗原-抗体"复合物 被吸附于固相包被反应板上，再加入酶标记物(酶标记的羊抗猪IgG)，形成固相"抗原+抗 体+酶标抗猪IgG抗体"复合物，加入显色剂，通过酶催化反应显色。显色深浅与待检样本 中特异性抗体的量成正相关。当样本反应显色后，经酶标仪检测所得结果超过设定的临界 值结果判为阳性，反之则为阴性。
[0012] 本实用新型以基因表达的重组蛋白为检测抗原，安全性好，特异性好，灵敏度高， 适用于大批量检测；同时试验操作时的试剂的颜色变化，试剂液体与瓶盖的不同颜色，利于 操作人员区分不同液体，降低人为操作失误的可能性，便于试验操作。
【附图说明】
[0013] 图1为本实用新型所述试剂盒的横切面剖视图，包含盒体内所有物品的位置与组 成。其中，2为抗原包被反应板2块；3为样本稀释液50ml ;4为20 X浓缩洗涤液50ml ;5为 酶标记物22ml ;6为阳性对照血清I. 5ml ;7为阴性对照血清I. 5ml ;8为显色剂12ml/瓶X 2 瓶；9为终止液12ml ;10为操作说明书1张；11为盖板膜6张；1为盒体。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图对本实用新型做进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不限于 此。
[0015] -种猪0型口蹄疫病毒抗体ELISA检测试剂盒，如图1所示，该试剂盒有一个盒体 1。其中，所述盒体1内设有抗原包被板2、样本稀释液3、20 X浓缩洗涤液4、酶标记物5、阳 性对照血清6、阴性对照血清7、显色剂8、终止液9、说明书10和盖板膜11。所述抗原包被 板规格为96孔，每个盒体包括2块抗原包被板，其中包被有纯化后的猪0型口蹄疫病毒结 构蛋白VPl。
[0016] 本实用新型所述试剂盒采用酶联免疫间接法制备，具体工艺如下：
[0017] 抗原包被反应板的制备：将纯化的猪0型口蹄疫病毒重组结构蛋白VPl用包被缓 冲液稀释成浓度为〇. 25~lug/ml的抗原包被液，包被缓冲液为0. 05mol/L、pH9. 6的碳酸盐 缓冲液。混合均匀后加入96孔酶标板内，IOOul/孔。放置2~8°C过夜后，甩掉孔内液体，以 洗涤液洗涤1次，洗涤液为20X浓缩洗涤液以纯化水稀释为IX洗涤液。甩干后，加入封 闭液，封闭液含5%。~10%。的鱼明胶溶液，以150ul/孔加入，放置37°C恒温箱中封闭2小时。 取出，甩去孔内液体，干燥。
[0018] 样本稀释液：将1000 ml纯化水中加入2. 8g磷酸二氢钾、118g氯化钠、Iml吐 温-20、0. 2g硫柳汞钠，加入5ml指示剂，定容至1000 ml并调节pH值为5~6,；按50ml/瓶 分装。
[0019] 20 X浓缩洗涤液：将1000 ml纯化水中加入4g磷酸二氢钾、60g磷酸氢二钠、IOml 吐温-20、160g氯化钠、4g氯化钾，调节pH值为7. 0~7. 4,定容至1000 ml ;按50ml/瓶分装
[0020] 酶标记物：将0· 6g Tris、2. 2g氯化钠、0· 4ml浓盐酸、0· 125g吐温-20、(X Ig氨基 比林、0. 5ml Proclin300、2ml红色染色剂加入到纯化水中，最终定容至1000 ml并调节pH为 7. 0~7. 4,加入IOOul羊抗猪酶标记物；按22ml/瓶分装。
[0021] 阳性对照血清：将猪0型口蹄疫病毒抗体阳性血清5ml、