专利名称：一种鳕鱼免疫活性肽制备的在线监控方法
技术领域：
本发明属于生物技术酶工程技术领域，具体涉及一种鳕鱼免疫活性肽制备的在线监控方法，可在生物活性肽的制备过程中动态监测水解过程，实现水解的可视化，从而最大程度的获取目标活性肽。
背景技术：
近年来已发现一些天然免疫活性肽如胸腺肽，可诱导淋巴细胞分化、增殖与成熟， 提高免疫低下小鼠的免疫活性。然而天然免疫活性肽在生物体中含量较少，制备成本高，价格昂贵。虽然化学方法可以大量合成免疫活性肽，但化学合成的免疫活性肽存在副反应和副产物较多的问题，其应用和发展受到限制。而酶法水解具有成本低、安全性好，并且易于大量制备等优点，因此目前生物活性肽的制备研究主要集中在酶法水解上面。但是蛋白酶解的程度对于活性肽的免疫效果具有重要的影响，其可以用水解度来表示。随着对生物活性肽生理功能认识的不断深入，发现水解度对酶解产物的生物学活性、 活性组分得率、肽段组成和分子量分布均有影响。适当控制酶解条件和水解度可以提高生物活性肽的生成量。例如，对乳铁蛋白水解产物的抑菌活性与水解度进行相关分析发现，在一定水解度范围内(DH小于10% )，随着乳铁蛋白水解度的提高，酶解产物的抑菌活性增强，但是水解度过大时酶解产物的抑菌活性却发生下降。因此，确定水解度就对于蛋白酶解产物的免疫调节活性具有重要作用，而实现蛋白酶的可控水解也就具有重要的意义。目前国内外的可控酶解的理论与方法主要集中在数学动力学模型模拟和酶解进程控制上，这为生物活性肽的制备及工业化应用提供了有益的参考。但目前对蛋白酶促水解反应的动力学研究发展较缓慢，其原因是虽然在方程中引入了产物抑制常数和底物常数，但大多仍停留在用米氏方程描述反应过程阶段。同时，由于酶解过程是一个相当复杂的过程，易受到各种外界条件影响，如温度波动、PH变化、酶活变化、搅拌速率不同、底物多样化等等，使得数学动力学方程十分繁琐复杂、难于真实地描述反应的全过程。因此动力学模型是有局限性的，完全依靠动力学模型难以实现酶解的可控操作，新的可控酶解理论与技术成为生物活性肽制备中亟待解决的重要课题。而生物传感器可以在线直接或间接监测酶解过程中产生的活性肽含量和分子量分布，可以有效实现活性肽的可控制备，显示出巨大优势。生物传感器技术把生物活性物质的检测，巧妙地与传感器技术、计算机辅助控制方法相结合，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等特点。其原理是在传感器的化学电极的敏感面上组装固定化酶膜，当酶膜接触待测物质时，该膜对待测物质作出响应，催化它的固有反应，转化为电极中的电流或电位的变化，由计算机扑捉电信号，转化为测定该物质的数量数据。这样生物传感器就能够快速、可靠地获得酶解过程中某种或几种特定的氨基酸含量来间接反映产物水解度和多肽分布的信息，实现酶解的在线动态监测，为生物免疫活性肽制备的全自动控制提供了可能。所以，基于生物传感器建立的人工神经网络 (Artificial Neural Networks,ANNs)可用来实现生物活性肽制备的可视化。其具有自学习、自组织和自适应功能，可以充分逼近任意复杂的非线性关系，大规模并行处理，使快速进行大量运算成为可能，有很强的鲁棒性和容错性。正是由于BP-ANNs独特优势，构建鳕鱼免疫活性肽制备的动态监控模型具有可行性。因此，在线动态监控模型的建立将为鳕鱼蛋白免疫活性肽制备乃至其他特定功能生物活性肽的开发奠定了理论基础和技术支持。但根据文献调研和国内外查新结果可知，生物传感器在生物活性肽的酶法制备研究中尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鳕鱼免疫活性肽制备的在线监控方法，从而解决目前没有能够及时准确地在线监控鳕鱼免疫活性肽酶解制备的问题，为免疫活性肽制备乃至其他特定功能生物活性肽的开发提供技术支持，为鳕鱼免疫活性肽实现在线控制制备提供了可操作依据。可应用于生产鳕鱼免疫活性肽及其他生物活性肽的在线监控制备。本发明的一个方面确定鳕鱼免疫活性肽，其制备方法是将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，水解度为16 17%时终止水解而制备的。本发明的另一个方面涉及一种鳕鱼免疫活性肽制备的在线监控方法，包括如下的步骤1)建立并训练人工神经网络，包括网络训练样本的制备、参数确定以及网络的训练步骤；A、网络训练样本的制备训练样本是指利用胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白，通过改变初始底物浓度与初始蛋白酶浓度进行水解反应，分别对每一酶解反应的水解度和游离谷氨酸和游离赖氨酸进行测定；B、人工神经网络参数确定包括有网络模型的隐层数、传递函数、训练函数、学习函数、输入层节点、输出层节点、隐层节点数；。C、人工神经网络的训练与建立以训练样本为基础，根据选定的输入层节点的不同，建立并训练了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs网络模型；2)确定酶解系统中初始的底物浓度、初始加酶浓度；3)利用生物传感器监测水解反应中的特定的氨基酸每隔一定时间，将固定体积的酶解液注射到生物传感器内，利用特定氨基酸的氧化酶电极进行检测；4)将初始底物浓度、初始加酶浓度、特定氨基酸浓度等参数输入到训练好的人工神经网络，得出水解产物的水解度，从而实现免疫活性肽的在线监测。本发明确定了鳕鱼蛋白的最佳水解度，从而为获得最佳免疫效果的鳕鱼免疫活性肽奠定了基础。在确定了最佳水解度后，本发明建立了在线监控方法，可以通过生物传感器-人工神经网络模型可以在线监测水解反应程度。即使当水解条件波动时，如温度、pH、 搅拌速率等变化时，其仍可以准确监测水解反应的程度。因此，本发明的方法具有很好的推广应用前景。
图1 本发明的在线监控方法的流程图。
具体实施例方式本发明的一个方面是确定鳕鱼免疫活性肽的制备条件，将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，当水解度在0 16%时，随着水解度的增加，水解产物的免疫活性呈增加趋势；当水解度为16 17%时，水解产物呈现最高的免疫活性；当水解度大于17%时，随着水解度的增加，水解产物的免疫活性呈减小趋势。因此鳕鱼免疫活性肽可以控制水解度为16 17%进行水解制备。鳕鱼免疫活性肽制备条件的确定是通过体外淋巴细胞增殖实验对水解产物进行活性筛选，通过动物实验进行体内免疫活性验证，确定制备鳕鱼免疫活性肽所用的蛋白酶为胰蛋白酶，蛋白浓度25g/L、pH值8. 0、温度(50士 1) °C、时间290min和加酶量24U/mg, DH为16. 87%，其水解产物体外脾淋巴细胞平均增殖率为28. 45%。该条件下的水解产物能显著提高正常小鼠的淋巴细胞转化活性(P < 0. 05)、迟发型变态反应(ρ < 0. 05)和单核巨噬细胞的吞噬能力(P <0.05)。对于免疫功能低下小鼠，该水解产物能显著提高小鼠的免疫器官指数(P < 0. 05)；显著促进小鼠的迟发型变态反应(ρ < 0. 05)，提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P < 0. 05)，提高小鼠的细胞免疫功能；提高血清溶血素含量(P < 0. 05)，促进小鼠的体液免疫功能；显著促进小鼠的碳廓清能力(P < 0. 01)和腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数(P < 0. 05，P < 0. 01)，促进小鼠的非特异性免疫功能。因此该条件下得到的水解产物对增强体内免疫活性效果显著。如图1所示，本发明的另一个方面涉及一种鳕鱼免疫活性肽制备的在线监控方法，包括如下的步骤第一步建立并训练人工神经网络。包括网络训练样本的制备、参数确定以及网络的训练步骤。1)网络训练样本的制备。训练样本是指利用胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白，通过改变初始底物浓度与初始蛋白酶浓度进行水解反应，分别对每一酶解反应的水解度和游离谷氨酸和游离赖氨酸进行测定。酶解反应的水解度根据水合茚三酮法测定；游离谷氨酸和游离赖氨酸通过生物传感器测定。2)人工神经网络参数确定。主要包括网络模型的隐层数、传递函数、训练函数、 学习函数、输入层节点、输出层节点、隐层节点数。<1>隐层数的确定。一个三层的BP网络可以完成任意的N维到M维的映射，即对任何实际问题都可先选用1个隐层。<2>传递函数确定。一个三层前馈网络，当隐层激活函数取非线性函数，输入输出层传递函数取线性激活函数，就能够以任意精度逼近任意连续函数。因此，输入层与隐层之间使用Iogsig传递函数，隐层与输出层之间使用线性purelin函数。<3>网络训练函数采用trainlm。LM法是梯度下降法与高斯-牛顿法的结合和改进，是一种收敛速度快、鲁棒性好的算法，适用于前向神经网络的训练。既具有梯度下降法的全局收敛特性，又具有高斯-牛顿法的局部快速收敛性。适应性学习函数采用LEARNGDM。<4>由于各因素数据的单位不统一，为了加快训练网络的收敛性，改善网络收敛误差，更利于数据处理，数据在输入前可作归一化预处理。归一化处理可以采用如下公式=Xi =(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，χ为训练样本的输入数据，Xi为归一化后的数据，Xfflax与Xmin分别为训练样本X中的最大值与最小值。<5>输入层与输出层节点的确定。输入层节点为初始酶浓度、初始底物浓度&、水解产物的游离谷氨酸浓度[GLU]、终产物的游离赖氨酸浓度[LYS]；输出层节点为DH。<6>隐层节点数的确定。最基本原则在满足精度要求的前提下取尽可能紧凑的结构，即取尽可能少的隐层节点数。隐层节点数N2可取为礼=机+N3 +d(a =1 10)， 其中输入节点为N1，输出节点为N3, α为经验值。合理隐层节点数应综合考虑网络结构复杂程度和误差大小的情况下确定。3)人工神经网络的训练与建立。以训练样本为基础，根据选定的输入层节点的不同，分别建立并训练了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs网络模型；最后对训练样本进行仿真，其拟合误差的绝对值在0 5%。<l>GLU-BP-ANNs的动态监控模型隐层为1层，输入层与隐层之间使用Iogsig传递函数，隐层与输出层之间使用线性purelin函数，网络训练函数采用trainlm，适应性学习函数采用LEARNGDM，输入层节点分别为初始酶浓度、初始底物浓度&、终产物的谷氨酸浓度[Glu]，输出层节点为DH，隐层节点数为10。对样本值与拟合值进行回归分析R2值为 0. 9967，拟合误差范围在0-4. 14%，拟合平均相对误差值为1.06%。<2>LYS-BP-ANNs的动态监控模型隐层为1层，输入层与隐层之间使用Iogsig传递函数，隐层与输出层之间使用线性purelin函数，网络训练函数采用trainlm，适应性学习函数采用LEARNGDM，输入层节点分别为初始酶浓度、初始底物浓度&、终产物的游离赖氨酸浓度[LYS]，输出层节点为DH，隐层节点数为11。对训练样本进行仿真，其拟合误差范围在0 4. 56%，拟合平均相对误差值为0. 94%。第二步确定酶解系统中初始的底物浓度、初始加酶浓度，在一定温度、不断搅拌的条件下进行酶解反应。为了提高酶解效率，温度选用酶的最适反应温度。第三步利用生物传感器监测水解反应中的特定的氨基酸。每隔一定时间，将固定体积的酶解液注射到生物传感器内，利用特定氨基酸的氧化酶电极进行检测。生物传感器进样的固定体积为25 μ L，测定时间为20秒，清洗时间为25秒。监测的特定氨基酸分别为谷氨酸和赖氨酸。第四步将初始底物浓度、初始加酶浓度、特定氨基酸浓度等参数进行归一化处理后，输入到训练好的人工神经网络，得出水解产物的水解度，从而实现免疫活性肽的在线监测。为获得免疫活性肽，将水解产物的目标水解度控制在16 17%范围，若符合要求，沸水浴中灭活酶5min终止水解反应，然后迅速冷却至室温，调pH至中性，离心；若不在此范围， 继续进行酶解反应，直到符合要求，终止酶解反应。实施例1 :GLU-BP-ANNs模型在线监测制备免疫肽第一步建立并训练GLU-BP-ANNs网络模型。1)网络训练样本的制备。训练样本是指利用胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白，通过改变初始底物浓度与初始蛋白酶浓度进行水解反应，分别对每一酶解反应的水解度和游离谷氨酸进行测定。酶解反应的水解度根据水合茚三酮法测定；游离谷氨酸通过生物传感器测定。2)人工神经网络参数确定。隐层为1层，输入层与隐层之间使用Iogsig传递函数， 隐层与输出层之间使用线性purelin函数，网络训练函数采用trainlm，适应性学习函数采用LEARNGDM，输入层节点分别为初始酶浓度、初始底物浓度&、产物的谷氨酸浓度[Glu]， 输出层节点为DH，隐层节点数为10。3)人工神经网络的训练与建立。以训练样本为基础，建立并训练了 GLU-BP-ANNs网络模型；最后对训练样本进行仿真，其拟合误差的绝对值在0 5%。对样本值与拟合值进行回归分析R2值为0. 9967，拟合误差范围在0-4. 14%，拟合平均相对误差值为1. 06%。第二步底物为鳕鱼排高压勻浆，确定酶解系统中初始的底物蛋白浓度为25g/L、 初始胰蛋白酶浓度为600U/mL，在不断搅拌的条件下进行酶解反应。为了提高酶解效率，温度选用酶的最适反应温度50°C。第三步利用生物传感器监测水解反应中的谷氨酸。每隔IOminJf 25 μ L酶解液注射到生物传感器内，利用谷氨酸氧化酶电极进行检测。测定时间为20秒，清洗时间为25秒。第四步将初始底物浓度、初始加酶浓度、谷氨酸浓度等参数进行归一化处理后， 输入到训练好的人工神经网络，通过已建立的GLU-BP-ANNs监控反应体系的水解程度，利用生物传感器监测反应体系中游离[Glu]变化，当网络显示水解度在16-17%范围内时终止水解反应，分别进行5次独立的水解实验，得到DH值试验值与仿真输出值，经归一化处理后见表1。表IGLU-BP-ANNs监测鳕鱼排免疫肽制备
S0E0Glu试验值拟合值相对误差 (%)0.57140.71430.42550.7080.7211.720.57140.71430.43970.7530.751-0.230.57140.71430.43500.7350.7410.820.57140.71430.44440.7440.7612.290.57140.71430.43970.7310.7512.81由表可以看出，试验的相对误差仅在0. 23% 2. 81 %范围，对于特别复杂的水解反应来说，已经在一定程度上实现了仿真监控，对控制水解反应有重要意义。活性实验发现，此法制备的水解产物可以显著的促进免疫细胞增殖活性，具有较好的免疫增强活性。实施例2 第一步建立并训练LYS-BP-ANNs网络模型。1)网络训练样本的制备。训练样本是指利用胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白，通过改变初始底物浓度与初始蛋白酶浓度进行水解反应，分别对每一酶解反应的水解度和游离赖氨酸进行测定。酶解反应的水解度根据水合茚三酮法测定；游离赖氨酸通过生物传感器测定。2)人工神经网络参数确定。一个隐含层，输入层与隐层之间使用Iogsig传递函数，隐层与输出层之间使用线性purelin函数，网络训练函数采用trainlm，适应性学习函数采用LEARNGDM，输入层节点分别为初始酶浓度、初始底物浓度&、终产物的赖氨酸浓度 [LYS]，输出层节点为DH，隐层节点数为11。3)人工神经网络的训练与建立。以训练样本为基础，建立并训练了 LYS-BP-ANNs 网络模型；最后对训练样本进行仿真，其拟合误差的绝对值在0 5%。对训练样本进行仿真，其拟合误差范围在0 4. 56%，拟合平均相对误差值为0. 94%。第二步底物为鳕鱼排高压勻浆，确定酶解系统中初始的底物蛋白浓度为25g/L、初始胰蛋白酶浓度为600U/mL，在不断搅拌的条件下进行酶解反应。为了提高酶解效率，温度选用酶的最适反应温度50°C。第三步利用生物传感器监测水解反应中的赖氨酸。每隔IOminJf 25 μ L酶解液注射到生物传感器内，利用赖氨酸氧化酶电极进行检测。测定时间为20秒，清洗时间为25秒。第四步将初始底物浓度、初始加酶浓度、赖氨酸浓度等参数进行归一化处理后， 输入到训练好的人工神经网络，通过已建立的LYS-BP-ANNs监控反应体系的水解程度，利用生物传感器监测反应体系中游离赖氨酸变化，当网络显示水解度在16-17%范围内时终止水解反应，分别进行5次独立的水解实验，得到DH值试验值与仿真输出值，经归一化处理后见表2。表2LYS-BP-ANNs监测鳕鱼排免疫肽制备
权利要求
1.一种鳕鱼免疫活性肽，其制备方法是将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，水解度为16 17%时终止水解而制备的。
2.制备权利要求1所述的鳕鱼免疫活性肽的在线监控方法，包括如下步骤1)建立并训练人工神经网络，包括网络训练样本的制备、参数确定以及网络的训练步骤；2)确定酶解系统中初始的底物浓度、初始加酶浓度；3)利用生物传感器监测水解反应中的特定的氨基酸每隔一定时间，将固定体积的酶解液注射到生物传感器内，利用特定氨基酸的氧化酶电极进行检测；4)将初始底物浓度、初始加酶浓度、特定氨基酸浓度等参数输入到训练好的人工神经网络，得出水解产物的水解度，从而实现免疫活性肽的在线监测。
3.如权利要求1所述的在线监控方法，其特征在于所述的步骤1)中的网络训练样本的制备，具体如下利用胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白，通过改变初始底物浓度与初始蛋白酶浓度进行水解反应，分别对每一酶解反应的水解度和游离谷氨酸和游离赖氨酸进行测定。
4.如权利要求1所述的在线监控方法，其特征在于所述的步骤1)中的人工神经网络参数确定包括有网络模型的隐层数、传递函数、训练函数、学习函数、输入层节点、输出层节点、隐层节点数。
5.如权利要求1所述的在线监控方法，其特征在于所述的步骤1)中的人工神经网络的训练与建立以训练样本为基础，根据选定的输入层节点的不同，建立并训练了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs 网络模型。
全文摘要
本发明涉及一种鳕鱼免疫活性肽，及其制备的在线监控方法。所述的鳕鱼免疫活性肽，其制备方法是将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，水解度为16～17％时终止水解而制备的。并建立了GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs网络模型，从而对鳕鱼免疫活性肽的制备了在线监控方法。本发明确定了鳕鱼蛋白的最佳水解度，从而为获得最佳免疫效果的鳕鱼免疫活性肽奠定了基础。在确定了最佳水解度后，本发明建立了在线监控方法，可以通过生物传感器-人工神经网络模型可以在线监测水解反应程度。即使当水解条件波动时，如温度、pH、搅拌速率等变化时，其仍可以准确监测水解反应的程度。因此，本发明的方法具有很好的推广应用前景。
文档编号G06N3/02GK102559822SQ20121000361
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月7日 优先权日2012年1月7日
发明者侯虎, 张朝辉, 李八方, 赵雪 申请人:中国海洋大学