一种贴壁细胞生长融合度自动分析方法与流程

本发明涉及一种贴壁细胞生长融合度自动分析方法，该方法克服了细胞图像前景同背景对比度弱及背景灰度分布不平衡、起伏较大等因素造成的分割难题，可实现对细胞培养过程中生长融合度的自动分析计算，属于图像处理技术领域。

背景技术：

生长融合度是细胞培养过程中的重要规格参数，目前在生物医学行业，通常依靠检验员主观直接做出判断。由于细胞生长速度过快，需要不定时检测生长情况，此识别方法不仅耗散大量的人力与时间，而且不同的检验员经常做出不一致的检测结果，另外由于人眼容易疲劳，长时间的检测任务，很容易令检验员产生主观错误判断。所以创建一种贴壁细胞生长融合度自动分析方法，对生物医学行业生长融合度自动化监测水平有着重要的意义。

图像处理技术在贴壁细胞生长融合度自动分析计算的应用过程中，最为关键一步是实现对细胞的良好分割。图像中存在许多不利于细胞分割的因素，比如前景同背景对比度弱，背景灰度分布不平衡、起伏较大，随着分化过程细胞形状、大小的无规则变化等等。这些因素导致常规方法很难直接实现对细胞的良好分割。因此寻找合适的图像处理方法是难点所在。

目前图像处理技术在生物医学行业应用十分广泛。针对细胞的分割方法也有许多，基本可以分为：阈值法、边缘检测法、活动轮廓模型等。由于图像前景同背景对比度弱，细胞内像素点的灰度值范围较大，导致使用传统的阈值法进行区域检测时，得到的目标不完整、错分割现象严重；其次由于边缘检测算法实际依赖的是梯度信息作为阈值条件，大于阈值的认为是边界，小于阈值的认为是背景，虽然视觉特性上细胞外边缘灰度值较高，同细胞内灰度值区别较大，但是这一特性并不绝对，也并不是所有目标外边缘均呈现这一特性，因此应用边缘检测算法分割效果不佳；而在实际应用活动轮廓模型时，在低融合度情况下，分割效果理想，但是随着融合度增加，分割效果逐渐变差，因此活动轮廓模型只适合在细胞较独立且形状较规则的情况下使用，并不具有普适性。

技术实现要素：

本发明目的是提出一种能够有效克制传统贴壁细胞生长融合度识别方法弊端，实现快速、准确、自动化程度高的融合度自动分析方法。实现本发明目的技术方案，包括下列步骤：

步骤1：判断输入图像类型并做出相应转换；

步骤2：对待处理图像做灰度形态学的高低帽组合变换；

步骤3：差分法结合背景估计降低背景噪声干扰因素；

步骤4：采用改进k-means聚类算法实现对细胞图像前景与背景的粗分；

步骤5：采用面积滤波实现对细胞图像的去噪；

步骤6：将两幅基于面积滤波的细胞结果像素级相加；

步骤7：利用拟合函数实现二值形态学处理系数的自适应分析；

步骤8：用二值形态学的方法对图像进行优化；

步骤9：计算最终融合度；

实际应用表明，本发明可实现对贴壁细胞生长融合度较高精度的自动分析计算，有效提高了生物医学行业融合度自动化检测水平，有着良好的使用价值。本发明技术具有如下优点：

1.本发明操作简便、自动化程度高，同传统培养过程细胞生长融合度分析方式相比，能够减轻检验员工作量，并提高检测精度。

2.本发明针对细胞灰度分布特性，提出采用形态学高低帽组合变换增强前景同背景的对比度，改善图像质量。

3.本发明借助改进k-means聚类算法，可实现对前景同背景的粗略区分，克服传统分割方法的过分割及无效分割缺点。

4.本发明有效借助origin软件数据分析功能，实现对二值形态学系数的自适应判断。

附图说明

图1：本发明的操作流程图。

图2：原始图像经相应类型转换、灰度形态学高低帽组合变换和差分法结合背景估计的处理过程。

(a)原始图像；(b)灰度形态学高低帽组合变换图像；(c)差分法结合背景估计得到背景含部分噪声的细胞内图像；(d)差分法结合背景估计得到背景含部分噪声的细胞外边缘图像。

图3：改进k-means聚类算法实现对细胞图像前景与背景粗分结果。

(a)是图2(c)的分割结果图像；(b)是图2(d)的分割结果图像。

图4：面积滤波及二值形态学的处理过程。

(a)是图3(a)的面积滤波结果图像；(b)是图3(b)的面积滤波结果图像；(c)是图4(a)、(b)的像素点逐点相加结果图像；(d)是图4(c)二值形态学变换图像。

具体实施方式

本发明提出方法的整套操作流程图如附图1所示。下面将结合附图对本发明技术方案的具体实施过程加以说明。

步骤1：判断输入图像类型并做出相应转换；

依据实际应用过程所遇情况分析，本发明首先对输入图像做如下相应类型转换操作。若输入图像为彩色图像，则比较r、g、b通道灰度图像的像素点灰度值是否均相等，是则选择提取r通道灰度图像作为待处理图像，否则将原输入图像转换成灰度图像；若输入图像为灰度图像，不做任何类型转换操作。

步骤2：对待处理图像做灰度形态学的高低帽组合变换；

对图2(a)做灰度形态学的高低帽组合变换操作得到结果图2(b)。

设f(x，y)是待处理灰度图像，b(x，y)是结构元素，定义膨胀、腐蚀运算如下：

(fθb)(s，t)＝min{f(s+x，t+y)+b(x，y)|(s+x，t+y)∈df，(x，y)∈db}

定义为输入图像f在结构元素是b情况下的闭运算。

定义为输入图像f在结构元素是b情况下的开运算。

定义高低、帽运算如下：

top(f，b)＝f-(f·b)

本发明提出的经高低帽组合变换处理后的图像为f(f)，即：

f(f)＝f+top(f，b)-bottom(f，b)

灰度形态学高低帽组合变换能够使图像中灰度值较大点向更高灰度级靠近，使图像中灰度值较小点向更低灰度级靠近。依据细胞图像灰度分布特性，该组合变换能够增强背景同前景的对比度，有效改善图像质量。

步骤3：差分法结合背景估计降低背景噪声干扰因素；

读取图2(b)，求出尺寸大小m×n。对图2(b)进行遍历，将其所有像素点灰度值累加，得到累加结果sum，计算图2(b)灰度均值avg，公式如下：

同时创建尺寸为m×n、灰度值为avg的预估背景图像。

将图2(b)同预估背景图像做差分法，得到图2(c)和图2(d)。

步骤4：采用改进k-means聚类算法实现对细胞图像前景与背景的粗分；

应用arthur和vassilvitskii提出的改进k-means聚类算法分别对图2(c)、图2(d)进行细胞分割，结果分别为图3(a)、图3(b)。

k-means聚类算法，即利用迭代处理过程将输入数据集分类成类间独立、类内紧凑的聚类集合。算法核心是找到使类内方差最小化的聚类中心，即当聚类内数据到聚类中心的平方和距离最小时所对应的聚类中心。本发明采用改进k-means聚类算法，该算法很好的解决了初始种子点的获取问题，提高了运行速度、聚类质量。

步骤5：采用面积滤波实现对细胞图像的去噪；

采用面积滤波分别对图3(a)、图3(b)进行去除噪声处理，结果分别为图4(a)、图4(b)。

步骤6：将两幅基于面积滤波的细胞结果像素级相加；

图4(a)图4(b)相加结果如图4(c)所示。对应像素的值相加，公式如下：

i(x，y)＝ia(x，y)+ib(x，y)

步骤7：利用拟合函数实现二值形态学处理系数的自适应分析；

图4(c)中目标像素点灰度值为1，将图4(c)进行遍历，统计灰度值为1的像素点个数sum，计算初始融合度rate，计算公式如下：

通过origin软件对实验数据分析计算，得到关于形态学处理系数par同初始融合度rate之间的拟合函数关系，如下：

其中，参数par为形态学结构元素的大小。

步骤8：用二值形态学的方法对图像进行优化；

图4(c)分割结果中细胞部分位置产生断点，通过二值图像通用形态学运算中的膨胀处理将其连接，得到结果图4(d)。其中x用b膨胀记作如下公式：

结果集合d是结构元素b平移后与集合x的交集不为空集的那些结构元素参考点x(x1，x2)的集合。

步骤9：计算最终融合度；

图4(d)中细胞像素点灰度级值为1，将图4(d)进行遍历，统计灰度值为1的像素点个数sum，得到最终融合度rate，计算公式如下：

脐带间充质干细胞的原代和前四代由于细胞密度较小，能较好地分割出图像中细胞，而其后代由于细胞密度较大，细胞融合现象很严重而较难分割，因此，本文采用第六代的贴壁细胞图像(放大40倍)来进行图像分割，分析其融合度。

附图4(d)是使用了本发明方法操作的结果图，同原始图像图2(a)相比较，可以明显的看出，细胞得到了很好的分割，融合度误差在10％以内。本发明所提出的一种贴壁细胞生长融合度自动分析方法，有效解决了细胞培养过程中传统生长融合度分析方式带来误差较大的问题。实际应用表明，本发明可以快速、便捷、实时、高精度地实现对培养过程中生长融合度的分析计算，提高了生物医学行业融合度自动化检测水平，具有很好的使用价值。