含有超顺磁晶体的涂覆聚合物颗粒的制备方法

专利名称：含有超顺磁晶体的涂覆聚合物颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及涂覆磁性聚合物颗粒的制备方法。
背景技术：
磁性聚合物颗粒在多个医疗和生物化学领域中具有通常的用途，例如，作为递送药 物产品、用于诊断目的、用于分离和合成目的的运输载体。为了执行这些功能，此类颗 粒依靠它们的磁性。例如，在诊断测定应用中，将磁场施用于含有与磁性聚合物颗粒结 合的分析物的样品，使得无需使用离心或过滤即可分离所述分析物，以及例如，在治疗 应用中，对患者施用磁场可以用来将携带药物的磁性聚合物颗粒靶向期望的身体部位。
磁性在本文中是指聚合物颗粒含有超顺磁晶体。因此，所述磁性聚合物颗粒是磁性 可置换的，但并非可永久磁化的。许多制备磁性聚合物颗粒的方法是已知的，大量这些 方法包括从预先形成的磁性氧化铁例如磁铁矿制备含磁赤铁矿或磁铁矿的聚合物颗粒。 一些所涉及的方法被描述于US-A-4，654,267 (Ugelstad)，其内容被并入本文作为参考。
随着能够测量非常小的磁性变化的装置的开发以及纳米技术的成长，可以预见，在 将来，磁性颗粒使用者将需要更小的颗粒，用其来进行它们的测定等等。而且，所述磁 性颗粒将需要被操纵，以携带能够容易与标记偶联的活性基团，以提供生化方法的理想 固相。

发明内容
我们已经惊奇地发现，通过使表面官能化的、磁性聚合物颗粒与聚异氰酸酯/二醇单 体的组合反应，以产生"涂覆"磁性聚合物颗粒，可以产生具有特别有用的表面特性的 磁性颗粒。这些颗粒容易与标记进一步偶联，以提供用于各种领域的固相载体。
因此，从第一方面看，本发明提供含有超顺磁晶体的涂覆聚合物颗粒的制备方法， 所述方法包括使表面官能化的、含有超顺磁晶体的、直径在0.5pm以下的聚合物颗粒与 至少一种聚异氰酸酯如二异氰酸酯和至少一种、优选两种二醇反应。
优选的二醇是聚乙二醇或是分子式为HO((CH2)mO)nH的二醇(其中n是1到15的 整数，例如2到10,优选2到4，并且m是2到6的整数，优选2到3，最优选2)。 在仅使用一种二醇的情况下，优选聚乙二醇，例如聚乙二醇300、 400、 500或600。
用在本发明的方法中的聚合物颗粒可以是任何适宜大小的、任选多孔的聚合物颗粒， 其具有官能化表面，例如在US-A-4,654，267中一般性描述的Ugelstad颗粒。合适的颗粒
还可以从Admtech获得，例如Carboxyl-Admtech 0212颗粒，其含有羧酸表面涂层。
在聚合物颗粒上的表面官能度优选是能够一一任选伴随着活化一一与聚异氰酸酯反 应的基团，以将所述异氰酸酯共价结合到所述表面。最优选地，所述表面是胺或羧基官 能化的。
所述聚合物颗粒优选由乙烯的聚合物例如苯乙烯、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯的组 合制备。该高分子材料可以任选地交联，例如通过引入交联剂，例如诸如共聚单体如二 乙烯基苯(DVB)或乙二醇二甲基丙烯酸酯。包含DVB的颗粒被优选。
所需的交联剂(例如共聚单体)的适当量对于普通技术人员将是熟知的。优选地， 所述聚合物是交联的苯乙烯聚合物(例如苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，其通过使用含硝基 共聚单体例如硝基苯乙烯和随后的还原被表面官能化)或通过使用含环氧基的共聚单体
(例如甲基丙烯酸缩水甘油酯)和随后的胺化(例如，通过与乙二胺反应)而官能化的 交联的(甲基)丙烯酸酯聚合物。
在本发明的方法中使用的聚合物颗粒中的超顺磁晶体可以具有能够以超顺磁晶体形 式沉积在聚合物颗粒上或者如果所述颗粒是多孔的沉积在其孔内的任何材料。磁性氧化 铁例如磁铁矿或磁赤铁矿是优选的；然而，如果需要，所述晶体可以具有混合的金属氧 化物或者其它磁性材料。结晶磁性材料存在的总量一般在20%以上，优选在25%以上， 期望大于或等于30% (按重量计，例如高达85 wt呢或至少50 wt%，例如30 wt免到80 wt%)。在涂覆颗粒的总干重的基础上，基于Fe (或者在非氧化铁磁性材料的情况下的 等价金属)重量，计算百分比。
在所述聚合物颗粒中磁性晶体的较高浓度对于本文中所要求保护的小颗粒是必需 的，以便它们在分离步骤期间可以被磁体成功地吸引。使珠粒容易移向磁体的另一种方 法是使它们的一部分剩磁。
通过运行磁滞曲线，由振动样品磁强计，可以测量剩磁的程度。通过测量在从例如 -1.5特斯拉达到+ 1.5特斯拉并返回的不同场强下所述颗粒的磁化强度，可以得到该曲线。 如果最大磁化强度被称为Ms并且横截Y轴的绝对值(零场强)被称为Mr，则比率Mr/Ms 将表明所述颗粒的剩磁程度。
Mr/Ms比率低于0.15的颗粒对于大多数应用可以被认为是超顺磁的。对于从-1.5到 + 1.5特斯拉，时间间隔应该是IO分钟。具有低剩磁值的颗粒通常具有增加的向磁体的曳 力，原因在于聚集，但它们之间的力很小，以至于这并不影响样品洗涤。
多孔聚合物颗粒可以通过标准技术在它们的孔中沉积磁性颗粒。作为进一步的可能 性，多孔聚合物颗粒可以从硝基苯乙烯和DVB制备，并且磁性材料被引入。氨基苯乙烯， 尤其是4-氨基苯乙烯用作携带氨基的高分子材料的制备中的单体或共聚单体是优选的。 该单体或共聚单体的使用消除了聚合后硝化和还原反应的必要。而且，通过该方法提供 的涂层的可预测性质(均一性)越多，将被应用的可靠涂层越多。
聚合物颗粒可以被形成，其携带表面官能化，或者可选地，聚合物材料的官能化可 以在聚合之后发生，例如通过所形成的硝基基团的硝化和随后还原成侧链胺基；或者直
接胺化，例如通过用氨基乙醇处理。
根据本发明的聚合物颗粒将具有500nm以下的尺寸(即直径)，例如通常在100 nm 到400 nm之间，例如150 nm至U 250 nm。
通常，当被修正到2.7pm的平均颗粒直径时(即，表面积乘以2.7/MD，其中MD 是按微米计的平均直径)，所使用的颗粒将具有至少15m々g的表面积(通过BET氮吸 附法测量)，并且更优选至少30m2/g，例如高达700mVg。以类似比例衡量，颗粒孔体 积优选为至少0.1 mL/g。
典型地，所述聚合物颗粒在它们被涂覆之前是球形的并且基本上是单分散性的，并 且特别优选地，在它们被涂覆后保持球形和基本上单分散性。
基本上单分散性是指，对于众多颗粒(例如至少100，更优选至少1000，例如全部)， 所述颗粒具有20%以下的变异系数(CV)，例如15%以下，优选12%以下，更优选11% 以下，还更优选10%以下，以及最优选不大于约8%，例如2到5%。 CV按百分比确定 如下
100x标准偏差 LV - 平灼值
其中平均值是平均颗粒直径，而标准偏差ii藉直径的标准偏差。CV优选在主要众
数上计算，即通过将单峰分布曲线拟合到检测的粒度分布而计算。因此，在计算时，在 众数大小之下或之上的一些颗粒可以被打折扣，所述计算可以例如基于总颗粒数(可检 测颗粒数)的约90%。这样的CV确定在Coulter LS 130粒度分析器上可进行。
磁性聚合物颗粒与聚异氰酸酯的反应产生聚合物涂层。当颗粒是多孔时，则所得到 的"涂覆"颗粒具有相对于多孔原材料而言降低的孔隙率。令人惊奇地，我们发现，超 顺磁晶体似乎催化聚合反应，使得涂层优先在它们的附近形成。
在另一种优选的实施方式中，通过一种或多种(例如l、 2或3种)聚异氰酸酯和一 种或多种(例如2、 3或4种)二醇形成涂覆聚合物。优选地， 一种聚异氰酸酯应当被使 用，例如一种二异氰酸酯。可选地，紧密相关的聚异氰酸酯的混合物可以被使用(例如 Desmodur)。
典型的可被使用的聚异氰酸酯包括亚甲基二异氰酸酯、1，6-己二异氰酸酯、2，4-二异 氰酸酯甲苯(2,4-TDI)(和它们的异构体或混合物)、异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)、 4,4'-氧代 双(异氰酸苯酯)、4，4'-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、 MDI和基于MDI的低聚物的混合物 (例如DesmodurVL)、 2,4-二苯基二异氰酸酯、亚甲基双环己基二异氰酸酯(H,2MDI)、苯 撑二异氰酸酯(p-PDI)、反式-环己垸-1,4-二异氰酸酯(CHDI)、 1,6-己烷二异氰酸酯 (D1CH)、 1，5-萘二异氰酸酯(NDI)、对四甲代苯二甲撑二异氰酸酯(p-TMXDI)或间四甲代 苯二甲撑二异氰酸酯(m-TMXDl)。
特别优选的异氰酸酯是MDI或基于它的聚异氰酸酯(例如，Desmodur) 。 Desmodur 包含MDI，以及其含有具有CH2-异氰酸苯酯残基的MDI的低聚物。Desmodur因此是多 种衍生自MDI的聚异氰酸酯的混合物。样品构成可以是
4，4-亚甲基双(异氰酸苯酯)40-50%
4，4-亚甲基双(异氰酸苯酯)+异氰酸苄酯20-25%
4,4-亚甲基双(异氰酸苯酯)+2异氰酸苄酯10%
4,4-亚甲基双(异氰酸苯酯)+3异氰酸苄酯2%。 (在类似这个的反应中，产物还可以含有一些2-异构体)。该化合物由Shell以商标 名Caradate禾口由Huntsman以商标名Hylene禾口 Rubinate出售。
优选地，应使用两种二醇。当使用两种二醇时，所述二醇优选地以0.5:1到1:0.5的 比例被使用，更优选地，0.8:1到l:0.8。优选地，没有一种二醇以超过二醇混合物的90 mol% 的量被使用。
优选的二醇包括二甘醇、四甘醇和聚乙二醇例如PEG300、 400或600。优选的二醇 组合是二甘醇和四甘醇。
在涉及聚异氰酸酯的涂布反应期间，如果在第一阶段所述聚异氰酸酯过量(例如相 对于任何二醇)，这是优选的。在该涂布过程步骤中仅使用聚异氰酸酯在本发明的范围 之内。这被认为最小化在反应期间胶凝发生的可能性。在初始涂布反应中使用大量过量 聚异氰酸酯的情况下，在第二阶段中使涂覆颗粒与进一步的二醇(一种或多种)(例如 上面所述的二醇)反应则可能是必需的，以与任何未反应的异氰酸酯基团反应。在初始 涂布反应仅使用聚异氰酸酯的情况下，其后所得到的颗粒与至少一种二醇反应是需要的。
在这样的实施方式中，这样的二醇优选是聚乙二醇。PEG二醇的长链允许在颗粒涂 覆表面之间形成大小相当的连接体，并因此使得与亲合配体例如链霉抗生物素蛋白更容 易地反应。
因此，使所述颗粒与聚异氰酸酯随后是二醇反应——即逐步法一一以实现涂布也在 本发明的范围之内。
因此，通常，所述涂布反应可以通过用聚异氰酸酯和二醇(一种或多种)浸渍多孔 磁性聚合物颗粒实现，例如通过使用这些的溶液(例如在有机溶剂例如甲醇或二甘醇二 甲醚中)或通过混合颗粒在有机溶剂中的分散体和液体二醇/聚异氰酸酯混合物。声波处 理可被用于改善浸渍，并且所述反应可以通过升高温度例如到50-100'C而被加速。通过 应用低压，所使用的任何溶剂可以被抽提。
通常，磁性聚合物颗粒的用途例如它们用作诊断工具，要求适当程度的亲电性，以 便它们可以充分参与偶联以及在生物介质中普遍的含水系统中的其它反应。
当所述涂层的总体极性是期望的亲电性时，含有疏水部分的一些涂层可以被掺入， 以将亲电性程度调整到期望水平。通过这种方式，本发明允许供应具有广泛极性的有用 的诊断工具和其它工具。
如果需要，所述涂覆磁性聚合物颗粒的表面可以被进一步官能化，例如通过偶联药 物分子、报告标记(例如发色团、荧光团、酶或放射性标记)、或配体(例如抗体或抗 体片段、金属离子配合剂、特异性结合配对的成员(例如生物素或链霉抗生物素蛋白)、 寡肽、寡核苷酸或寡糖)。
此类偶联可以是直接或间接的(并因此可以包括或可以不包括偶联剂的使用，以在
颗粒和偶联到其上的物质之间形成连接体)，并且可以是生物可降解的或非生物可降解 的。如果磁性聚合物颗粒将被用于活性化合物的耙向释放，则生物可降解偶联可以是期 望的。因此，在涂布被实现之后，所述涂层的侧链基团可以被操纵，以提供合适的官能 度(例如环氧基、羟基、氨基等官能度)，用于此类物质的附着。
官能化的涂覆磁性聚合物颗粒可被结合于亲合配体，该亲合配体的性质将基于其对 特定分析物的亲合性而选择，所述分析物在样品中存在或不存在有待确定。亲合分子因 此可以包括任何能够被连接到磁性探针的分子，所述磁性探针也能够特异识别特定分析 物。亲合配体从而包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、核酸、寡核苷酸、蛋白质、 寡肽、多糖、糖、肽、编码肽的核酸分子、抗原、药物和其它配体。合适的亲合配体的 例子在公开的文献中是可得的并且是熟知的。进一步的结合对、二级亲合配体以及本领 域中常规的连接基团的使用在本文中不再进一步讨论，尽管应该理解，如果需要，此类 物质与本发明的颗粒一起使用是可能的。
从进一步的方面看，本发明提供了本发明的颗粒在合成、提取或测定中的应用，特 别是在核酸检测中的应用。
通过使涂层表面与化合物例如甲基丙烯酸酐反应，也可以实现引入可与例如丙烯酸 聚合的乙烯基。例如，已经与二醇反应过的涂覆颗粒可能携带羟基官能度，其将容易与 甲基丙烯酸酐反应，使得将乙烯基引入到聚合物表面。
如上所述，偶联到所述颗粒的外部物质的性质可以根据其结合特定目标材料的能力 而选择。核酸检测通常包括使用核酸探针探测被认为含有目标核酸的样品，所述核酸探 针含有特异识别例如与目标核酸序列杂交的核酸序列，以便核酸亲合配体和目标核酸组 合产生杂交层。本发明的适当官能化的颗粒，例如携带链霉抗生物素蛋白的颗粒，非常 适合核酸检测。
结合到链霉抗生物素蛋白颗粒的生物素化单链寡核苷酸探针可被用于分离序列特异 性DNA。通过将合适量的颗粒与过量的生物素化探针混合，生物素化探针被结合到所述 颗粒上。然后，颗粒/探针在杂交缓冲液例如SSPE或SSC中，在适于探针和DNA的长 度和序列的条件下与DNA样品温育。利用所述颗粒的磁性，将过量和不需要的DNA洗 掉。通过PCR等，可以检测/定量所捕获的DNA。
结合到链霉抗生物素蛋白颗粒的生物素化双链DNA片段可被用于分离序列特异性 结合蛋白质。通过将合适量的颗粒与过量的生物素化DNA片段混合，生物素化探针被结 合到所述颗粒上。然后，颗粒/DNA在杂交缓冲液中，在适于所研究蛋白的条件下与蛋白 样品温育。利用所述颗粒的磁性，将过量和不需要的蛋白洗掉。捕获的蛋白可以从探针 洗脱(通过高盐、低盐、热、低pH等)，用于下游应用和检测。
目标材料可以任选是生物或合成来源的材料，例如，它可以是分子或一组分子，包 括例如抗体、氨基酸、蛋白质、肽、多肽、酶、酶底物、激素、淋巴因子、代谢物、抗 原、半抗原、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、毒素、毒物、环境污染物、 碳水化合物、寡糖、多糖、糖蛋白、糖脂、核苷酸、寡核苷酸、核酸和衍生核酸、DNA、
RNA、天然或合成药物、受体、病毒颗粒、细菌颗粒病毒成分、细胞、细胞成分、天然 或合成脂囊泡、聚合物膜、聚合物用品(polymer services)和颗粒以及玻璃和塑料表面。 在本发明的颗粒被用在免疫测定的情况下，令人惊奇地发现在涂布后颗粒的甲苯磺 酰化产生在免疫测定中表现出改善的性能的颗粒。因此，在优选的实施方式中，携带涂 层的颗粒可以被甲苯磺酰化，例如通过在碱存在下所述颗粒与甲苯磺酰氯的反应。所得 到的甲苯磺酰化涂覆颗粒是新的并且形成本发明的又一方面。甲苯磺酰基是指甲苯-4-磺 酰基团。
而且，此类甲苯磺酰化物质可以容易与亲合配体反应，例如链霉抗生物素蛋白，以 形成进一步的新颗粒。
因此，从进一步的方面看，本发明提供了涂覆聚合物颗粒，其携带有超顺磁晶体， 具有从至少一种聚异氰酸酯和至少一种二醇形成的涂层，其随后被甲苯磺酰化，例如通 过与甲苯磺酰氯反应，然后任选与亲合配体例如链霉抗生物素蛋白反应。
而且，令人惊奇地发现，相比于更大尺寸的颗粒例如3pm颗粒，本文所要求保护的 直径的颗粒具有大大增加的结合能力。可以预见，所要求保护的颗粒的结合能力比更大 的颗粒高200%以上，这允许在测定步骤中使用相当更低的量的颗粒。
因此，本发明的颗粒在吸附/脱附法中具有应用，这类似于在反相色谱法(RPC)或 疏水作用色谱法中的机制。反相色谱法是利用溶质分子(例如蛋白质)和固定化疏水配 体(例如颗粒表面)之间的疏水吸附相互作用的分离技术。该相互作用通常很强，以至 它可以在低离子强度的溶液中发生并利用有机溶剂(例如乙腈)破坏。反相色谱法可被 用于分馏复杂蛋白样品，以及对蛋白样品进行脱盐。通常，使用装入柱子中的固相进行 RPC。本发明的颗粒能够进行该技术而无需柱子、无需样品稀释并可以高通量自动化。
疏水作用色谱法(HIC)是利用溶质分子(例如蛋白质)和固定化疏水配体(例如颗 粒表面)之间的疏水吸附相互作用的分离技术。该相互作用比PRC所利用的相互作用弱， 并需要高盐浓度促进。因此，降低盐浓度可用于破坏这些吸附作用。HIC可用于分馏复 杂蛋白样品，以及对蛋白样品进行脱盐。通常，使用装入柱子中的固相进行HIC。本发 明的颗粒能够进行该技术而无需柱子、无需样品稀释并可以高通量自动化。
参考下面的实施例，本发明将进一步被描述。


无
具体实施例方式
实施例1
0.3 um磁性羧酸颗粒的聚氨酯涂层
干含量为按重量计3.1%的6.5克磁性颗粒分散体(Ademtech的0212x)被加入反应 容器中并放在磁体上。从所述颗粒除去水相，并用5mL0.01M氢化化钠洗涤所述颗粒 三次，用5mL0.01 M盐酸洗涤两次，再次用0.01 M氢化化钠洗涤，然后用纯水洗涤。 进一步，所述颗粒用甲醇洗涤，并被转移到二甘醇二甲醚。颗粒在二甘醇二甲醚的浓度 被调整到原始值3.1 wt%。
0.5克二苯基甲垸二异氰酸酯(Desmodurvl， Bayer)被加入，并且反应容器被置于具 有加热块的旋涡搅拌器(vortex)上。温度被设定在80'C下20小时。红外光谱显示，所 述颗粒己经结合了氨基甲酸乙酯基团和异氰酸酯基团(C二O伸缩的波数1717 cm"和 N二C二0伸縮的波数2278 cm-1)。
来自上述的颗粒分散体被加入0.6克的聚乙二醇300中并加热到80°C 1小时。用20 mL二甘醇二甲醚洗涤所述颗粒两次，进一步用20mL甲醇洗涤六次，然后转移到水中 (3x20mL)。红外光谱显示，所述聚乙二醇被共价结合到所述颗粒，依据在2278 cm—1 处N-C-O伸縮的减少以及在1112 cm—1和1071 cm"处醚基团的增加。
权利要求
1.含有超顺磁晶体的涂覆聚合物颗粒的制备方法，所述方法包括使直径在0.5μm以下、表面官能化的、含超顺磁晶体的聚合物颗粒与至少一种聚异氰酸酯和至少一种二醇反应。
2. 如权利要求l所述的方法，其中至少两种二醇被使用。
3. 如权利要求l所述的方法，其中所述二醇选自聚乙二醇或是分子式为 HO((CH上O)nH的二醇(其中n是1到15的整数，以及ra是2到6的整数)。
4. 如权利要求2所述的方法，其中所述二醇是二甘醇和四甘醇。
5. 如权利要求2所述的方法，其中所述二醇之一是聚乙二醇。
6. 如权利要求l所述的方法，其中所述聚异氰酸酯是4,4-亚甲基双(异氰酸苯酯) 或含有具有CH2-异氰酸苯酯残基的4， 4-亚甲基双(异氰酸苯酯)的聚异氰酸酯。
7. 如权利要求l所述的方法，其中所述聚异氰酸酯是二异氰酸酯。
8. 如权利要求l所述的方法，其中所述颗粒在第一阶段与聚异氰酸酯的混合物和至 少一种二醇反应，其中所述聚异氰酸酯的摩尔浓度相对于所述二醇(一种或多种)过量， 并且在第二阶段中，随后与至少一种二醇反应。
9. 如权利要求8所述的方法，其中两种二醇在所述反应的所述第一阶段中被使用， 并且在所述第二阶段中一种或两种二醇被使用。
10. 如权利要求9所述的方法，其中二甘醇和四甘醇在所述反应的两个阶段被使用。
11. 如权利要求l所述的方法，其中所述颗粒在第一阶段在不存在二醇下与聚异氰 酸酯反应，并且在第二阶段与至少一种二醇反应。
12. 如权利要求ll所述的方法，其中一种二醇被使用，并且所述二醇是聚乙二醇。
13. 如权利要求l所述的方法，其中所述颗粒是胺官能化的。
14. 如权利要求l所述的方法，其中所述表面官能化聚合物颗粒是经硝化和还原的 苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒。
15. 如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物颗粒的直径在150到250 nm之间。
16. 如权利要求l所述的方法，其中所述涂覆颗粒随后被甲苯磺酰化。
17. 如权利要求l所述的方法，其中在所述涂布反应之后，所述颗粒被偶联到药物 分子、报告部分或配体。
18. 如权利要求17所述的方法，其中所述配体是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片 段、核酸、寡核苷酸、蛋白质、寡肽、多糖、糖、肽、编码肽的核酸分子、抗原或药物。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述配体是链霉抗生物素蛋白。
20. —种颗粒，其通过权利要求l所述的方法可得到。
21. 如权利要求20所述的颗粒在测定中的用途。
22. 如权利要求21所述的用途，其中所述测定是核酸检测或是免疫测定。
23. 如权利要求21所述的颗粒在疏水作用色谱法或反相色谱法中的用途。
全文摘要
含有超顺磁晶体的涂覆聚合物颗粒的制备方法，所述方法包括使直径在0.5μm以下、表面官能化的、含超顺磁晶体的聚合物颗粒与至少一种聚异氰酸酯和至少一种二醇反应。
文档编号H01F1/00GK101107525SQ200680002458
公开日2008年1月16日 申请日期2006年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者拉尔斯·基拉斯, 汤姆-尼尔斯·尼尔森, 盖尔·弗纳姆, 莫达尔·格雷特, 阿尔维德·特吕格弗·贝格, 露特·施密德 申请人:因维特罗根戴诺公司