专利名称：一种西洋参不定根组织培养方法
技术领域：
本发明涉及一种西洋参组织培养方法，属于中药西洋参组织培养领域。
背景技术：
西洋参(Panaxquinquefolium L.)，又称美国人参(American ginseng),原产于美国东部和加拿大，是五加科(Araliaceae)人参属植物，以根入药最为常见。现代药理学研究表明，西洋参具有调节糖代谢、增强免疫力、延缓衰老、抗肿瘤、降血压、预防及治疗心血管疾病、保肝护肝、增强学习能力和记忆能力、益智等作用。由于多年来的过度采挖，西洋参赖以生存的森林生态环境遭到严重破坏，野生西洋参资源枯竭，目前用于药用的多为栽培西洋参。然而西洋参的栽培生产周期长，占地面积大，且其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，供应难以满足市场的需求；农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培西洋参的发展。西洋参组织培养方法具有不受生长季节限制、不携带病毒、培养周期短等优点，且易于进行工业化大规模生产，因此具有很大的发展前途。目前我国关于西洋参组织培养的报道很多，但主要集中于愈伤组织以及悬浮细胞的培养。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种西洋参不定根组织培养方法。本发明的技术方案概述如下:一种西洋参不定根组织培养方法，包括如下步骤:( I)西洋参愈伤组织的诱导:取灭菌后的西洋参新鲜根除去根皮的组织，切成0.5 Icm2的小块接种到第一种固体培养基上，在无菌、23 25°C及避光条件下培养3 4周，形成愈伤组织；( 2)西洋参愈伤组织的继代培养:
将愈伤组织接种到第二种固体培养基上，在无菌、23 25°C及避光条件下培养3 4周；(3)西洋参不定根的诱导:将步骤(2)获得的继代培养出的愈伤组织接种到第三种固体培养基上，在无菌、23 25°C及避光条件下培养3 5周，培养出西洋参不定根；(4)西洋参不定根的继代培养:挑选出生长良好的步骤(3)获得的西洋参不定根接种到液体培养基内，在摇床上，在无菌、23-25°C及避光条件下培养4 5周，获得西洋参不定根；(5)西洋参不定根的反应器培养:将步骤(4)获得的西洋参不定根接种到含有2L液体培养基的3L球形鼓泡式反应器中，在无菌、20-25°C及避光条件下培养4 5周，收获，干燥；所述第一种固体培养基为:含有1.0-2.0mg/L(2, 4_ 二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)、0.1-0.5mg/L 激动素(KT)、30_40g/L 蔗糖的 pH=5.8-6.0 的 MS 固体培养基；
所述第二种固体培养基为:含有1.0-2.0mg/L (2, 4_ 二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)、0.1-0.5mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)、30_40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固体培养基；所述第三种固体培养基为:含有1.0-5.0mg/L吲哚丁酸(IBA)、30_40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固体培养基；所述液体培养基为含有3.0-5.0mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.5-1.0mg/L萘乙酸(NAA)、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS液体培养基。本发明的优点:本发明利用组织培养方法培养西洋参不定根，比培养西洋参细胞更具有实际意义，其生长速率要比原根快很多，(反应器培养时一个培养周期后可增殖21.76倍)并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定，培养物均一，同时又不受天灾等自然环境的影响。本发明具有工艺过程简单，成本低廉，诱导率高，重复性好，不定根增殖快等特点。提供一种西洋参不定根组织培养及的产品开发的方法。
图1为不同激素及配比对不定根诱导的影响。图2为西洋参不定根液体培养体系的建立；图中:A.西洋参愈伤组织B.不定根的诱导C.不定根接种于液态培养基D.西洋参不定根培养体系。图3为不同激素对不定根生长的影响。图4为西 洋参不定根反应器培养及收获的不定根；图中:A西洋参不定根反应器培养西洋参不定根反应器培养收获的不定根。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种西洋参不定根组织培养方法，包括如下步骤:( I)西洋参愈伤组织的诱导:将栽培西洋参的新鲜根用自来水冲洗干净，至于45°C烘箱中烘干表面，然后在超净台中用75%的乙醇喷洒表面，用酒精灯火焰灼烧至干以消毒灭菌，之后用灭过菌的解剖刀在根表面割一个Icm的切口，并从两边掰开，再把内部的组织切成0.5 Icm2的小块接到事先准备好的第一种固体培养基上，在无菌、23°C及避光条件下培养4周，形成愈伤组织；(2)西洋参愈伤组织的继代培养:选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的第二种固体培养基上，在无菌、23°C及避光条件下培养4周；(3)西洋参不定根的诱导:选择生长良好步骤(2)获得的继代培养出的愈伤组织用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于第三种固体培养基上，在无菌、23°C及避光条件下培养4周，培养出西洋参不定根；(4)西洋参不定根的继代培养:挑选出生长良好的步骤(3)获得的西洋参不定根用事先灭菌的解剖刀和镊子接种到液体培养基内，在IOOrpm速度的摇床上，在无菌、23°C及避光条件下培养4周，获得西洋参不定根；即可建立西洋参不定根液体培养体系(见图2)，培养过程中不同激素对不定根生长的影响见图3。(5)西洋参不定根的反应器培养:选取生长良好的步骤(4)获得的西洋参不定根用事先灭菌的解剖刀和镊子接种到含有2L液体培养基的3L球形鼓泡式反应器中，在无菌、23 °C及避光条件下培养5周，收获西洋参不定根，见图4，干燥；第一种固体培养基的配制为:将IOOmL含有2.0mg/L2, 4_D、0.5mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.8，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟；第二种固体培养基配制为:将IOOmL含有2.0mg/L2, 4_D、0.5mg/L6_BA、30g/L蔗糖的MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.8，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备；第三种固体培养基配制为:将IOOmL含有3.0mg/L IBA、40g/L蔗糖的MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.8，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用；液体培养基配制为:将IOOmL含有3.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、40g/L蔗糖的MS液体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.8，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用。实施例2一种西洋参不定根组织培养方法，包括如下步骤:
( I)西洋参愈伤组织的诱导:取灭菌后的西洋参新鲜根除去根皮的组织，切成0.5 Icm2的小块接种到第一种固体培养基上，在无菌、24°C及避光条件下培养3.5周，形成愈伤组织；( 2)西洋参愈伤组织的继代培养:将愈伤组织接种到第二种固体培养基上，在无菌、24°C及避光条件下培养3.5周；(3)西洋参不定根的诱导:将步骤(2)获得的继代培养出的愈伤组织接种到第三种固体培养基上，在无菌、24°C及避光条件下培养5周，培养出西洋参不定根；(4)西洋参不定根的继代培养:挑选出生长良好的步骤(3 )获得的西洋参不定根接种到液体培养基内，在摇床上，在无菌、24°C及避光条件下培养4.5周，获得西洋参不定根；(5)西洋参不定根的反应器培养:将步骤(4)获得的西洋参不定根接种到含有2L液体培养基的3L球形鼓泡式反应器中，在无菌、20°C及避光条件下培养4.5周，收获，干燥；第一种固体培养基为:将IOOmL 含有 1.0mg/L2, 4_D、0.lmg/L KT、35g/L 蔗糖的 MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.9，在121 °C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟；第二种固体培养基配制为:将IOOmL含有1.0mg/L2, 4_D、0.lmg/L6_BA、35g/L蔗糖的MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.9，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备；第三种固体培养基配制为:将IOOmL含有1.0mg/L IBA、30g/L蔗糖的MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.9，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用；液体培养基配制为:将IOOmL含有5.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、30g/L蔗糖的MS液体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至5.9，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用。实施例3一种西洋参不定根组织培养方法，包括如下步骤: (I)西洋参愈伤组织的诱导:取灭菌后的西洋参新鲜根除去根皮的组织，切成0.5 Icm2的小块接种到第一种固体培养基上，在无菌、25°C及避光条件下培养3周，形成愈伤组织；( 2)西洋参愈伤组织的继代培养:将愈伤组织接种到第二种固体培养基上，在无菌、25°C及避光条件下培养3周；(3)西洋参不定根的诱导:将步骤(2)获得的继代培养出的愈伤组织接种到第三种固体培养基上，在无菌、25°C及避光条件下培养3周，培养出西洋参不定根；(4)西洋参不定根的继代培养:挑选出生长良好的步骤(3)获得的西洋参不定根接种到液体培养基内，在摇床上，在无菌、25°C及避光条件下培养4周，获得西洋参不定根；(5)西洋参不定根的反应器培养:将步骤(4)获得的西洋参不定根接种到含有2L液体培养基的3L球形鼓泡式反应器中，在无菌、25°C及避光条件下培养4周，收获，干燥；第一种固体培养基为:将IOOmL 含有 1.5mg/L2, 4_D、0.3mg/L KT、40g/L 蔗糖的 MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至6.0，在121 °C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟；第二种固体培养基配制为:将IOOmL含有1.5mg/L2, 4_D、0.3mg/L6_BA、40g/L蔗糖的MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至6.0，在121°C、
0.1MPa的压力下灭菌15分钟备；第三种固体培养基配制为:将IOOmL含有5.0mg/L IBA、35g/L蔗糖的MS固体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至6.0，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用；液体培养基配制为:将IOOmL含有3.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、35g/L蔗糖的MS液体培养基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液调pH至6.0，在121°C、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用。
实验表明，本发明的方法各实施例培养的西洋参不定根，其生长速率要比原根快很多，(反应器培养时一个培养周期后可增殖21.76倍)并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定，培养物均一。取干燥后的西洋参不定根，加入15-25倍重量的蒸馏水，静置5_12h，水浴1_5次，每次l_3h。重复水浴2-5次，合并滤液，浓缩到一定体积，以无水乙醇调制终浓度为50-90 %，0-6°C静置过夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎，得到西洋参多糖粉末。取IOOg上述西洋参多糖，200g羟丙甲基纤维素，150g乳糖，混合均匀后，过100目筛，加入20gl-5%的乙基纤维素的乙醇溶液， 60°C干燥5h，然后过20目筛子整粒，即得到西洋参多糖颗粒制剂。
权利要求
1.一种西洋参不定根组织培养方法，其特征是包括如下步骤: (1)西洋参愈伤组织的诱导: 取灭菌后的西洋参新鲜根除去根皮的组织，切成0.5 Icm2的小块接种到第一种固体培养基上，在无菌、23 25°C及避光条件下培养3 4周，形成愈伤组织； (2)西洋参愈伤组织的继代培养: 将愈伤组织接种到第二种固体培养基上，在无菌、23 25°C及避光条件下培养3 4周; (3)西洋参不定根的诱导: 将步骤(2)获得的继代培养出的愈伤组织接种到第三种固体培养基上，在无菌、23 25°C及避光条件下培养3 5周，培养出西洋参不定根； (4)西洋参不定根的继代培养: 挑选出生长良好的步骤(3)获得的西洋参不定根接种到液体培养基内，在摇床上，在无菌、23-25°C及避光条件下培养4 5周，获得西洋参不定根； (5)西洋参不定根的反应器培养: 将步骤(4)获得的西洋参不定根接种到含有2L液体培养基的3L球形鼓泡式反应器中，在无菌、20-25 °C及避光条件下培养4 5周，收获，干燥； 所述第一种固体培养基为:含有1.0-2.0mg/L(2, 4- 二氯苯氧基)乙酸、0.1-0.5mg/L激动素、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固体培养基； 所述第二种固体培养基为:含有1.0-2.0mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.1-0.5mg/L6-苄基腺嘌呤、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固体培养基； 所述第三种固体培养基为:含有1.0-5.0mg/L吲哚丁酸、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固体培养基； 所述液体培养基为含有3.0-5.0mg/L吲哚丁酸、 0.5-1.0mg/L萘乙酸、30_40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS液体培养基。
全文摘要
本发明公开了一种西洋参不定根组织培养方法，包括如下步骤(1)西洋参愈伤组织的诱导；(2)西洋参愈伤组织的继代培养；(3)西洋参不定根的诱导；(4)西洋参不定根的继代培养；(5)西洋参不定根的反应器培养；本发明的方法，其生长速率要比原根快很多，培养一个培养周期后可增殖21.76倍，并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定，培养物均一，同时又不受天灾等自然环境的影响。本发明具有工艺过程简单，成本低廉,诱导率高，重复性好，不定根增殖快等特点。
文档编号A01H4/00GK103141391SQ201310086310
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者高文远, 刘辉, 郭松波, 满淑丽, 王娟 申请人:天津大学