植物乳杆菌、干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌复合菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明属于益生菌发酵【技术领域】，具体涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌植物乳杆菌HM-10(Lactobacillus?plantarum?HM-10)、干酪乳杆菌HM-09(Lactobacillus?casei?HM-09)和地衣芽孢杆菌BL-09(Bacillus?licheniformis?BL-09)为菌种的混合固态发酵技术，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，此方法可以生产出具有特殊酸香味的发酵型饲料产品，且发酵产品的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率高。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。
【专利说明】植物乳杆菌、干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌复合菌剂的制备
【技术领域】
[0001] 本发明属于益生菌发酵【技术领域】，具体涉及一种以豆柏、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌植物乳杆菌HM-1O (Lactobacillus pi ant arum HM-10)、干酿乳杆菌HM-09 (Lactobacillus casei HM-09)和地衣芽抱杆菌 BL-09 (Bacillus licheniformisBL-09)为菌种的混合固态发酵技术，此技术可广泛应用于动物微生态等方面。
【背景技术】
[0002]目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。因此本申请采用植物乳杆菌HM-1O、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09混合固态发酵豆柏、麸皮和玉米粉，采用固态发酵，其生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作。采用植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09进行混菌固态发酵，可生产出一种具有酸香气味的发酵制品，改善动物饲料的适口性。其蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，有利于动物肠胃消化吸收。
[0003]专利《一种有效预防及改善牛乳房炎的复合乳酸菌微生态制剂》，CN103202391A,公开了含有干酪乳杆菌HM-09、植物乳杆菌HM-10的复合微生态制剂。所述干酪乳杆菌和植物乳杆菌已于2012年10月29日在地址为北京市大屯路，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，干酪乳杆菌HM_09(L.casei HM-09)保藏号:CGMCC N0.6736 ;植物乳杆菌 HM-10 (L.Plantarum HM-10)保藏号:CGMCC N0.6741。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种以豆柏、麸皮和玉米粉为基质，采用植物乳杆菌HM-10 (Lactobacillus pi ant arum HM-10)、干酪乳杆菌 HM-09 (Lactobacillus caseiHM-09)和地衣芽孢杆菌BL-09 (Bacillus licheniformis BL-09)进行混合固态发酵，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，此方法可以生产出具有特殊酸香味的发酵型饲料产品，且发酵产品的活菌数高，豆柏蛋白质的降解率高。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。
[0005]本发明目的是通过下述技术方案实现的。
[0006]一种以豆柏、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，包括植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09的培养及其混合固态发酵，得到益生菌的固态发酵产品。
[0007]所述混合固态发酵培养为:先分别以1-5%接种量(v/w)将植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09接种于固态发酵培养基，控温30-37°C，相对湿度50%_60%，发酵0_12h后以2-8%接种量(v/w)接入地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵，其他条件不变，继续发酵 24-36h。[0008]固态发酵培养基组成包括豆柏、麸皮和玉米粉，所述豆柏、麸皮和玉米粉的质量比例为:豆柏、麸皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。水份含量控制在40-75%。
[0009]在最佳控制条件下，固态发酵中同时接种1% (v/w)的植物乳杆菌HM-10和1% (ν/w)的干酪乳杆菌ΗΜ-09，其他条件保持一致，混菌发酵12h后，再接种5% (v/w)的地衣芽孢杆菌BL-09，再继续混菌发酵36h。测定游离氨基态氮含量可达到1090.0 μ mol/g，较发酵前提高约11倍。地衣芽孢杆菌BL-09芽孢率较单独发酵提高约3倍。混合发酵的益生菌活菌数在101Qcfu/g以上，其中植物乳杆菌HM-10活菌数达3.55\090血/^、干酪乳杆菌麗-09活菌数达3.89X09cfu/g、地衣芽孢杆菌BL-09活菌数达1.29 X 10lclcfu/g。
[0010]所述植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09在混合固态发酵前分别经过种子培养。种子培养基为(g/L):蛋白胨10-20，葡萄糖10-20，其余为水，pH7.0-7.2。地衣芽孢杆菌BL-09的种子培养条件:摇床转速为150_180r/min，温度为34-370C，培养20-24h。所述的植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌腿_09的种子培养条件，分别置于恒温培养箱静置培养，培养温度30_37°C,培养时间为20_24h。
[0011]所述地衣芽孢杆菌BL-09于2011年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.5686，分类名:地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0012]所述地衣芽孢杆菌BL-09是一株分离自内蒙古自治区呼和浩特市地区健康牛肠道样品中的芽孢杆菌，属于兼性厌氧的、革兰氏阳性芽孢杆菌。菌体呈棒杆状，偶尔见长杆状，芽孢中生，呈椭圆形。最适生长温度为37± 1°C，最适生长pH为7.0-7.4，固态发酵烘干产物常温储存6个月，芽孢损失率低于5%.营养琼脂平板培养12h左右，菌落不规则、边缘不光滑，菌落中央具有明显的凸起峰；培养至24-36h，菌落褶皱明显且褶皱内物质呈液体状，接种环挑取具有拉丝情况，镜检芽孢基本脱落。经过伯杰氏细菌手册(第9版)及细菌、菌落形态确定为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌BL-09。体外实验证实，该菌株具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐等生化特性，还能够高产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类及氨基酸、维生素、抗菌物质等多种生理活性物质，发酵后的固态培养基粘度很大，拉丝严重，培养器皿底部可见少量液体物质，证明其固态发酵中的保湿能力相对较强。
[0013]耐酸试验:
[0014]地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37°C，150r/min培养24h，于4°C、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于pH分别为2.0、3.0及4.0的缓冲溶液中，37°C培养l_3h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的
耐酸性。
[0015]
【权利要求】
1.一种复合益生菌发酵制剂，由植物乳杆菌CGMCC N0.6741、干酪乳杆菌CGMCCN0.6736、地衣芽孢杆菌经混合固态发酵制得，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC N0.5686 ;所述混合固态发酵包括:先分别以l_5%v/w接种量将植物乳杆菌和干酪乳杆菌接种于固态发酵培养基，控温30-37°C，相对湿度50%-60%，发酵0_12h后以2-8%v/w接种量接入地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵，其他条件不变，继续发酵24-36h。
2.如权利要求1所述的复合益生菌发酵制剂，其特征在于，所述固态发酵培养基的组成包括豆柏、麸皮和玉米粉，所述豆柏、麸皮和玉米粉的质量比例为:豆柏、麸皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在 40-75%。
3.如权利要求1或2所述的复合益生菌发酵制剂，其特征在于，所述复合益生菌发酵制剂中游离氨基态氮含量达到1090.0μπιΟ1/^，益生菌活菌数在101(lCfu/g以上，其中植物乳杆菌活菌数达3.55X09cfu/g、干酪乳杆菌活菌数达3.89X09cfu/g、地衣芽孢杆菌活菌数达 1.29X1010cfu/go
4.如权利要求1或2所述的复合益生菌发酵制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌、干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌在混合固态发酵前分别经过种子培养，种子培养基为:蛋白胨10-20g/L，葡萄糖10-20g/L，其余为水，pH7.0-7.2 ;地衣芽孢杆菌的种子培养条件:摇床转速为150-180r/min，温度为30_37°C，培养20_24h ;植物乳杆菌和干酪乳杆菌的种子培养条件:分别置于恒温培养箱静置培养，培养温度30-37°C,培养时间为20-24h。
5.权利要求1-4任一所述的复合益生菌发酵制剂的固态发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:植物乳杆菌CGMCC N0.6741、干酪乳杆菌CGMCC N0.6736和地衣芽孢杆菌CGMCCN0.5686分别经过种子培养制备菌剂；混合固态发酵:先分别以1_5%V/W接种量将植物乳杆菌和干酪乳杆菌接种于固态发酵培养基，控温30-37°C，相对湿度50%-60%，发酵0-12h后以2-8%接种量接入地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵，其他条件不变，继续发酵 24-36h。
6.权利要求1-4任一所述的复合益生菌发酵制剂在饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A23K1/16GK103952346SQ201410154685
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】高鹏飞, 贺润晶, 姚国强 申请人:青岛九和宜生生物科技有限公司