外源油菜素内酯处理缓解玉米幼苗镉逆境胁迫伤害的方法与流程

本发明属于农业应用技术领域，具体涉及外源24-表油菜素内酯处理对重金属镉逆境胁迫下玉米幼苗生长的缓解方法。

背景技术：

镉（Cd）是植物非必需元素，具有较高的移动性和毒性，对各种生物有机体具有潜在的危害，能引起人类很多的疾病，被视为是对人类最具威胁的重金属之一。随着采矿、冶炼和镉处理工业的发展及农业生产上含重金属的有机肥、化肥等的大量使用，土壤镉污染日益严重。研究表明，镉在土壤中的积累对植物的危害很大，镉进入植物体后累积到一定含量会破坏植物细胞膜结构与功能，造成植株氧化胁迫，叶绿素、糖及蛋白质合成受阻、抑制光合及呼吸过程，降低酶的活性以及其他一些生理代谢物紊乱最终会导致生物量和产量的下降。

而且，镉还可导致农作物产量和质量下降，可以通过食物链危害人类的健康。因此，研究植物镉毒害的保护措施对农业可持续发展具有重要意义。

玉米是在重金属污染土壤上种植最广泛的粮食作物之一，对玉米重金属毒害的缓解方法现有关于一些激素缓解的报道，如水杨酸和一氧化氮，而关于油菜素内酯缓解重金属逆境胁迫的方法鲜有报道，在实际农业生产中应用少见。油菜素内酯是第一个被分离出的具有活性的油菜素甾族化合物（Brassinosteroids，BRs），是国际上公认为活性最高的广谱、无毒的植物生长激素，对植物生长发育十分重要。植物生理学家认为，它能最大程度上激发植物内在潜能，具有促进作物生长、提高含糖量、增加产量和增强对寒、旱、涝、盐等多种逆境的抵抗能力,在生产上已广泛应用，人工合成的高活性油菜素内酯类似物为24-表油菜素内酯(EBR)。因此探讨外源EBR 对重金属镉胁迫下玉米幼苗生长的影响，明确EBR诱导玉米幼苗抗重金属镉胁迫的可能生理机制是非常必要的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供一种通过外源油菜素内酯处理缓解玉米幼苗镉逆境胁迫伤害的方法；该方法简便易行，不受季节限制，不仅可以缩短实验时间，还可以提高玉米幼苗抗重金属镉的耐受力，能够缓解重金属镉对玉米幼苗生长的胁迫伤害。

为了解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案：一种外源油菜素内酯处理缓解玉米幼苗镉逆境胁迫伤害的方法，包括如下步骤：

1、材料准备：准备玉米种子；配置不同浓度的24-表油菜素内酯水溶液和硝酸镉溶液。

2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，用0.5% 的次氯酸钠消毒10 min，蒸馏水冲洗3～5次，用滤纸吸干附着水，得玉米消毒种子。

3、试材培育：将玉米消毒种子播种到垫有两层滤纸的的发芽盒中，每发芽盒50粒，发芽盒长×宽×高为13 cm×19 cm×12 cm；置于25℃培养箱中发芽；玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径8 cm×高为25 cm、内装蛭石的塑料花盆中，每盆植苗8株，于人工气候室内常规培养，每2d用1/5 浓度的Hoaglands 营养液浇灌，待第4片叶长出后，选取长势良好且长势一致的玉米幼苗120株进行镉胁迫试验。

4、试验处理：

4.1设系列Cd²⁺胁迫浓度梯度，进行Hoagland营养液处理玉米幼苗，培养10d后根据幼苗相对生长速率，筛选出最佳Cd²⁺胁迫浓度；本发明采取0 mg•L^-1 Cd²⁺、25 mg•L^-1 Cd²⁺、50 mg•L^-1 Cd²⁺、100 mg•L^-1 Cd²⁺、150 mg•L^-1 Cd²⁺与200mg•L^-1 Cd²⁺ 六个Cd²⁺胁迫浓度。

4.2根据步骤4.1的试验结果，选取100mg•L^-1 Cd²⁺作为胁迫条件，油菜素内酯溶液的浓度设定为五个浓度：0、0.004%、0.008%、0.012%与0.016%；油菜素内酯对Cd²⁺毒害缓解效应试验设置6个处理溶液：

a.CK对照，Hoagland溶液；

b.含100 mg•L^-1 Cd²⁺的Hoagland溶液；

c.含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.004%油菜素内酯的Hoagland溶液；

d.含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.008%的油菜素内酯Hoagland溶液；

e.含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.012%的油菜素内酯Hoagland溶液；

f.含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.016%的油菜素内酯Hoagland溶液；

将步骤3所得玉米幼苗每盆留5株，每个处理4盆，隔日向种植了玉米幼苗的塑料花盆里浇灌相应的6个处理溶液，浇灌至花盆底部略有处理液渗出；处理7d后将玉米幼苗进入步骤5。

5、各项指标的测定：将步骤4所得玉米幼苗用去离子水冲洗干净，测量株高、根长与植株鲜重后，置于烘箱中105℃杀青30min，再置于80℃烘箱中烘干至恒重，测量植株干重；取玉米幼苗第二片功能叶进行叶片相对电导率、丙二醛（MDA）含量 、超氧化物歧化酶（POD）、过氧化物酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量与叶绿素含量的测定。

6、结果分析与最适EBR 浓度筛选：对步骤5测得的镉胁迫处理幼苗的每个样品中的各项数据，采用Microsoft Excel 2003 软件进行数据处理，所有试验数据统计分析SPSS16.0 进行处理，试验结果用平均值±标准偏差(SD) 表示，采用Duncan’s 新复极差法进行多重比较，对各处理进行显著性差异分析；根据测定的相关指标筛选最佳EBR浓度，并分析EBR对重金属镉胁迫下玉米幼苗生长的影响。

在上述胁迫处理中，步骤3发芽盒用酒精消毒，滤纸进行高压灭菌后使用；为了得到更好的胁迫效果，种子经步骤2消毒后，应立即进入步骤3。本领域的技术人员知道：步骤4.1中的Cd²⁺胁迫浓度梯度的设置，可以自行设计调整，为了清楚地表述本发明，步骤4.1写明了Cd²⁺胁迫浓度梯度；步骤4.2中的EBR浓度可随处理中镉浓度的变化做适当调整，也可随玉米品种的变化调整，为了清楚地表述本发明，步骤4.2中写明了EBR溶液的不同浓度。

本发明通过探讨外源油菜素内酯对重金属镉胁迫下玉米幼苗生长的影响，反映出EBR对逆境下幼苗生长的胁迫伤害具有缓解作用。该方法简便易行，不受季节限制，不仅可以缩短试验时间，还可以提高玉米幼苗抗重金属镉的耐受力，能够缓解重金属镉对玉米幼苗生长的胁迫伤害。

本发明主要通过设计多个EBR 浓度，进行重金属镉胁迫下EBR对玉米幼苗的POD、SOD、CAT、MDA、相对电导率等指标的测定，探讨外源EBR对重金属镉胁迫下玉米幼苗生长生理生化特性的影响，明确EBR诱导玉米幼苗抗重金属镉可能生理机制，对缓解逆境对植株的伤害，具有很高的应用价值，本发明表明采用外源物EBR 处理有望成为实践中改善玉米在重金属镉胁迫下耐性的好方法，应用潜力很大。

具体实施方式

本发明下述实施例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规试剂、器材。

实验例，24-表油菜素内酯处理对重金属镉胁迫下最适EBR浓度的筛选方法，按以下步骤进行：

1、材料准备：玉米杂交种“郑单958”种子，24-表油菜素类内酯和硝酸镉溶液配置。

2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5% 的次氯酸钠消毒10 min，用蒸馏水冲洗4 次，用无菌滤纸吸干附着水，得玉米消毒种子。

3、试材培育：将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15 cm的培养皿中，置于25℃培养箱中暗发芽。玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到塑料花盆中，每盆植苗8株，于人工气候室内常规培养，每2d用1/5 浓度的Hoaglands 营养液浇灌，待第4片叶长出后，选取长势良好和长势一致的玉米幼苗进行镉胁迫试验。

4、试验处理：

4.1试验首先设系列Cd²⁺(0、25、50、100、150、200mg•L^-1)胁迫浓度梯度，进行Hoagland营养液处理玉米幼苗，培养10d后根据幼苗相对生长速率，筛选出最佳Cd²⁺胁迫浓度；本试验例采取0 mg•L^-1 Cd²⁺、25 mg•L^-1 Cd²⁺、50 mg•L^-1 Cd²⁺、100 mg•L^-1 Cd²⁺、150 mg•L^-1 Cd²⁺与200mg•L^-1 Cd²⁺ 六个Cd²⁺胁迫浓度。试验结果见表1。

由表1可知：用不同浓度（25、50、100、150、200 mg·L^-1）的Cd处理玉米幼苗，其株高、地上部和地下部鲜重和干重均呈下降趋势，与对照相比，当Cd浓度为100 mg·L^-1，株高、地上鲜重、地上干重、地下鲜重和地下干重均显著下降，分别下降了54.75%、57.52%、30.0%、47.92%和31.43%。

表中：不同小写字母代表不同处理间在0. 05水平差异显著，下同。

4.2 根据步骤1的试验结果可以得知：当Cd浓度为100 mg·L^-1，玉米幼苗株高、地上鲜重、地上干重、地下鲜重和地下干重均明显下降，与对照相比，均达到显著水平；

故选择100 mg·L^-1的Cd²⁺胁迫浓度，油菜素内酯溶液的浓度设定为5个：0、0.004%、0.008%、0.012%与0.016%；油菜素内酯对Cd²⁺毒害缓解效应试验设置6个处理溶液：

（1）CK对照，Hoagland溶液；

（2）含100 mg•L^-1 Cd²⁺的Hoagland溶液；

（3）含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.004%油菜素内酯的Hoagland溶液；

（4）含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.008%的油菜素内酯Hoagland溶液；

（5）含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.012%的油菜素内酯Hoagland溶液；

（6）含100 mg•L^-1 Cd²⁺和0.016%的油菜素内酯Hoagland溶液。

将步骤3所得玉米幼苗每盆留5株，每个处理溶液4盆，隔日向种植了玉米幼苗的塑料花盆里浇灌相应的6个处理溶液，浇灌至花盆底部略有处理液渗出；处理7d后将玉米幼苗进入步骤5。

为了保证处理期间培养液中的离子浓度相对恒定，每次处理时用相当于盆中蛭石最大持水量2 倍的处理液浇灌塑料花盆中蛭石，让多余的溶液从渗水孔流出，减少试验处理误差。

5.各项指标的测定：将步骤4中所得的处理玉米幼苗用去离子水冲洗干净，测量株高、根长、植株鲜重后，置烘箱中105℃杀青30min，再于80℃烘箱中烘干至恒重，测量植株干重；取玉米幼苗第二片功能叶进行各项指标测定，各项指标包括叶片相对电导率、MDA；POD、SOD、CAT活性；可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和叶绿素含量。测定结果如下：

（1）油菜素内酯处理对镉胁迫下玉米幼苗生长的影响见表2；由表2可以得出：与对照相比，单独镉胁迫处理后幼苗生物量均有显著性下降，添加不同浓度的油菜素内酯后，各处理均较单独镉胁迫处理有所上升，表明油菜素内酯可以缓解镉毒害对玉米幼苗生长的影响，由不同处理显著性差异看来，0.012%为油菜素内酯缓解的最适浓度。

（2）油菜素内酯处理对镉胁迫下玉米幼苗生理特性的影响见表3；由表3 可以看出：重金属镉单独处理时，MDA含量和相对电导率均显著高于未经镉胁迫处理的(CK)；POD、CAT、SOD活性；脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量均显著低于未经镉胁迫处理的(CK)，Cd²⁺+EBR可以降低MDA 和相对电导率的含量，且可以进一步提高POD、CAT、SOD活性；增加脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量，其中以0.012% EBR处理效果最好，与重金属镉单独胁迫处理相比，MDA含量和相对电导率降低了29.89%和39.39%；POD、CAT和SOD的活性分别增加了9.43%、13.33 %和67.21%，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量分别增加了79.45%、127.27%、86.78和49.37 %。

6.结果分析与最适EBR 浓度筛选：对步骤5测得的镉胁迫处理幼苗的每个样品中的各项数据，采用Microsoft Excel 2003 软件进行数据处理，所有试验数据统计分析SPSS16.0 进行处理，试验结果用平均值±标准偏差(SD) 表示，采用Duncan’s 新复极差法进行多重比较，对各处理进行显著性差异分析。

从以上实例可以看出，外源24-表油菜素内酯可有效地促进重金属镉胁迫下玉米幼苗的生长，增加玉米幼苗生物量的积累，提高重金属镉胁迫下玉米叶片中的抗氧化酶活性，降低其体内活性氧含量，减少胁迫下电解质外渗，从而减轻重金属镉胁迫对植株的伤害。采用外源物EBR处理在实践中易操作，有实效，有望成为实践中有效提高玉米种子发芽率，并改善玉米在重金属镉胁迫下耐性的好方法，应用潜力很大。