脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途的制作方法

本发明涉及一种脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：间充质干细胞(mesenchymalstemcell，mscs)是一类来源于中胚层及外胚层的多能干细胞，具有自我更新及多向分化潜能。研究证明，间充质干细胞可分化成为脂肪细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝脏细胞、神经细胞、神经胶质细胞、皮肤细胞等多种细胞类型，具有很好的损伤修复能力。间充质干细胞最早发现于骨髓，主要参与骨髓造血干细胞的定向归巢及稳态的维持。近年来，国内外研究发现间充质干细胞除具有多向分化潜能外，还具有很好的免疫调节特性，因此而被用于诸如移植物抗宿主(gvhd)、系统性红斑狼疮、关节炎，自身免疫性肠炎等多种炎症性疾病等治疗，临床应用市场巨大。脐带间充质干细胞是一类极具应用价值的间充质干细胞，其来源于产妇废弃胎盘组织。相比传统骨髓来源间充质干细胞，脐带间充质干细胞不受个体条件影响，更具有采集方便，来源丰富，以及特性均一等特点。大量研究已尝试应用脐带间充质干细胞治疗多种疾病，并取得了理想的疗效。将优质低代数间充质干细胞进行冻存，在必要时进行复苏扩增是间充质干细胞临床应用的必经程序。在冻存过程中有效保护间充质干细胞活性，保障间充质干细胞复苏时的活率是间充质干细胞冻存保护液及操作流程在设计时考虑的最终目的。通过冻存复苏后的脐带间充质干细胞可作为理想的种子细胞用于衰老及病变引起的组织器官损伤修复。现有技术中使用的间充质干细胞冻存液多含有胎牛血清，胎牛血清中富含多种细胞营养因子，可用于细胞培养及冻存，能长期保持细胞活力。然而，间充质干细胞在接触胎牛血清时会内吞血清物质，当间充质干细胞回输人体后可由异源蛋白引起过敏反应，在使得间充质干细胞移植后成功率降低的同时，导致不良反应的发生，严重的可引起过敏性休克。另外，优质胎牛血清多源于进口，价格昂贵的同时，面临着携带疯牛病病毒的风险，因此胎牛血清为或临床使用批准，只能用于基础科研。公开号为cn101919378b的中国发明专利申请，公开了一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，相关操作步骤包括:1)将人ab血置于无菌离心管中，在1000～1200rpm条件下离心15分钟；2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g条件下离心20分钟，再次取出上清即为冻存用人ab血浆；3)将二甲基亚砜(dmso)、冻存用人ab血浆、勃脉力a注射液按体积比1:3:6混合均匀，即为间充质干细胞冻存液。由该专利文件的实施例表1可见，经该冻存液i和ii分别冻存细胞1、2、3个月后复苏检测，冻存液i的细胞活率依次为96％、92.6％和89％，其细胞活率降低率为3.5％/月，冻存液ii细胞活率依次为97.4％，95％和为94.7％，其细胞活率降低率为1.35％/月，该申请公开的冻存液虽然可以直接静脉输注，但细胞活率维持时间较短。并且，该间充质干细胞冻存液中含有人ab血浆，其中大量成分未知，且存在个体差异，无法保证细胞冻存的标准化及稳定性，用于异体输注存在安全隐患。另外，健康血浆来源少，成本高，难以大规模应用。综上所述，现有技术中的细胞冻存液难以有效维持间充质干细胞活率，且不具备临床使用的条件。技术实现要素：针对上述问题，本发明提供一种符合临床使用要求，且能有效保证脐带间充质干细胞活力的冻存液级冻存方法。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明提供了一种脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物，其包括按体积百分数计的如下组分：复方右旋糖酐40注射液：30～80％；20wt％人血清白蛋白：10～50％；dmso：5～20％；其中，所述20wt％人血清白蛋白的溶剂为生理盐水。作为优选方案，各所述组分的体积百分数分别为：复方右旋糖酐40注射液：65％；20％人血清白蛋白：25％；dmso：10％。一种如前述的脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物在制备脐带间充质干细胞悬液中的用途。作为优选方案，包括如下步骤：利用新生儿脐带血提取充质干细胞；将所述充质干细胞用权利要求1所述的冻存保护液组合物进行重悬，得到的细胞悬液。作为优选方案，还包括将所述细胞悬液进行冻存的步骤，具体为：将细胞悬液放入梯度降温盒中，-80℃冰箱过夜，第2天放入液氮罐长期保存。作为优选方案，所述充质干细胞的重悬浓度为1×105～1×108个/ml。作为优选方案，所述充质干细胞的提取方法为：无菌条件下取新鲜新生儿脐带，并将所述脐带进行预处理成组织块；将所述组织块进行传代培养后，用胰酶进行消化，离心收集充质干细胞。作为优选方案，所述脐带预处理的方法为：将新鲜新生儿脐带剪成1～2cm脐段，剔除血管，用d-pbs漂洗净血迹，再剪成0.125cm3组织块。本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液所含成分都为临床药物(复方右旋糖酐40注射液，20％人血清白蛋白)或临床使用级(dmso)。其中复方右旋糖酐40注射液含右旋糖酐，是理想的血浆替代物，可参与提高冻存体系中的胶体渗透压。同时，右旋糖酐属于非渗透性抗冻剂，还能降低溶液中低分子溶质(电解质)浓度，减轻盐损伤；人血清白蛋白属于非渗透性抗冻剂，可降低冻存保护液中自由水的含量，减少冰晶的形成，同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤，大大提高细胞存活率；dmso(二甲基亚砜)作为渗透型细胞保护剂能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液，可以长时间维持间充质干细胞的活性及生物学活性，不含细胞培养基、胎牛血清、人血浆等不安全成分。所有成分为临床药物复方右旋糖酐40注射液，20％人血清白蛋白)或临床使用级(二甲基亚砜(ups临床级))，可使冻存复苏的脐带间充质干细胞满足临床使用要求的同时，保证了临床标准化间充质干细胞冻存体系的稳定性。安全有效，制备方法简单，具有良好的临床应用前景。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1脐带间充质干细胞冻存前生长形态；图2本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏时细胞活率；图3本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液及对照组冻存1年复苏后48h细胞生长形态；图4冻存前后脐带间充质干细胞生长曲线；图5冻存前脐带间充质干细胞成脂分化能力图；图6本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后成脂分化能力图；图7冻存前脐带间充质干细胞成骨分化能力图；图8本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后成骨分化能力图；图9本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后48h细胞表面cd45检测结果；图10本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后48h细胞表面cd31检测结果；图11本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后48h细胞表面hla-dr检测结果；图12本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后48h细胞表面cd34检测结果；图13本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后48h细胞表面cd90检测结果；图14本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后48h细胞表面cd105检测结果；图15本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存1年复苏后48h细胞表面cd73检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明中涉及的主要仪器及试剂:1)仪器：离心机eppendorf5810r；co2培养箱thermo8000；流式细胞仪beckmancytoflex；细胞计数countstarbiotech；倒置相差显微镜奥林巴斯ckx412)试剂:复方右旋糖酐40注射液(福他乐):购自西安万隆制药有限责任公司20％人血清白蛋白：购自baxterag(百特中国)dmso(ups临床级)购自德国wak-chemielg-dmem基础培养基+10％胎牛血清购自gibcod-pbs购自gibco0.25％胰酶-0.38g/ledta溶液购自gibco0.04％台盼蓝染色液购自gibco人间充质干细胞成骨分化试剂盒购自gibco人间充质干细胞成脂分化试剂盒购自gibco茜素红(alizarinreds)购自sigma-aldrich油红o(oilredo)购自sigma-aldrich多聚甲醛购自sigma-aldrich流式染色抗体(fitc标记annexin5，pe标记抗cd45、cd31、cd34、hla-dr、cd90、cd73，cd105)以及7-aad染料购自ebioscience。实施例1本实施例涉及一种脐带间充质干细胞临床冻存保护液的制备，具体包括如下步骤：1)如表1所示冻存液配方，取复方右旋糖酐40注射液、20wt％人血清白蛋白，dmso混合，加入密度为5×106/ml脐带间充质干细胞成细胞悬液，即可。表1.冻存液配方表对照组：取40mllg-dmem培养基(40％)与50ml胎牛血清(50％))混匀，加入脐带间充质干细胞至细胞密度为5×106/ml，再加入10mldmso，即可。对照组的配方是国内作为常用的间充质干细胞冻存液配方。2)检测复苏后脐带间充质干细胞活率取冻存前细胞检测细胞活率；将本发明制备的脐带间充质干细胞冻存悬液以及对照组细胞，通过程控降温后保存于液氮罐里，冻存1年后，迅速在37℃水浴复苏后，检测细胞活率。检测方法为台盼蓝经典染色法：(总细胞数一台盼蓝染色细胞)/总细胞数％或annexinv以及7-aad流式染色检测凋亡细胞。3)结果表2.细胞活率检测结果组别细胞活率％冻存前97.3对照组93.4191.2295.8393.7492.3由表2可见，本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存脐带间充质干细胞一年以后复苏，细胞活率均在91.2％之上，与冻存前相比，细胞活率最多仅下降了6.1％/年，细胞活率降低率最多仅为0.51％/月，下降幅度极低；在本发明优选范围内，进一步提高细胞活率，降低生产成本，且最优保存液的ph、渗透压接近人体的ph、渗透压，更为安全；其中，配方2的细胞活率最高，为95.8％，ph为6.7～6.9，渗透压为340～380mosmol/l最接近人体ph和渗透压，故配方安全有效，为最佳配比。证明本发明脐带间充质干细胞临床冻存保护液可以长时间维持细胞活率。在此基础上，选取最优配比冻存液配方进一步研究。实施例2本实施例涉及一种冻存脐带间充质干细胞冻存液的制备方法，包括如下步骤：1)无菌条件下取新鲜新生儿脐带，将脐带剪成1～2cm脐段，剔除血管，用d-pbs洗净血迹，再剪成0.125cm3组织块。用无菌镊夹取吸取组织块均匀散布在10cm培养皿中。37℃，5％co2培养箱孵育30min以使组织块黏贴在培养皿壁上。向每个培养皿中滴加10ml完全培养基(注意沿皿壁小心滴加，勿使冲动组织块)。37℃、5％co2继续培养，5天(d6)后半量换液。再过5天后，夹去组织块的同时，再次半量换液(此时已有细胞明显爬出)。之后每3天换一次培养液，继续培养6～8天，待细胞达到约80～90％后可进行细胞传达培养或冻存。2)弃去培养皿中上清，d-pbs冲洗两次，用0.25％胰酶，1min，室温消化细胞，加入完全培养基终止消化，200g，5min离心收集细胞。3)按体积比例将65％复方右旋糖酐40注射液(福他乐)、25％人血清白蛋白，以及10％dmso混合配置成为冻存液，按1×105～1×108/ml浓度重悬脐带间充质干细胞，得细胞悬液。4)本发明脐带间充质干细胞冻存保护液冻存获得的细胞，放入梯度降温盒中，-80℃冰箱过夜，第2天放入液氮罐长期保存。实施例3本实施例涉及前述的脐带间充质干细胞临床冻存保护液冻存细胞1年后细胞特性检测按照实施例1中最优配方3配置冻存液并冻存另一批次脐带间充质干细胞，冻存1年后，37℃水浴复苏后，进行细胞形态、生长曲线、成脂成骨分化，以及表面标志物检测。对照组同实施例11)细胞形态观察复苏后，将细胞加入10cm培养皿，并加入完全培养基37℃，5％co2培养24h后显微镜观察各组细胞形态。2)细胞生长曲线将冻存前细胞，本发明冻存液冻存细胞注射液和对照组复苏后细胞，分别以2×104个接种在t25培养瓶中，每个组别接种21瓶，分别每天每个组细胞进行三个培养瓶台盼蓝染色后计数，取其平均值，进行生长曲线的绘制。没有计数的培养瓶每3天更换一次培养基。(见图4)3)细胞分化能力检测将冻存前细胞，本发明冻存液冻存细胞注射液和对照组复苏后细胞，分别以2×105个接种于6孔板中，待长至70％融合度时，分别加入成脂、成骨诱导培养基，每4天换液一次，14天后用油红o进行成脂分化染色，21天后用茜素红s进行成骨分化染色。4)间充质干细胞表面标志物检测将冻存前细胞，本发明冻存液冻存细胞注射液和对照组复苏后细胞，分别进行pe标记抗cd45、cd31、cd34、hla-dr、cd73、cd105，cd90抗体染色，并进行流式细胞仪检测。5)检查结果如图1-2所示，本发明冻存脐带间充质干细胞1年后复苏，细胞形态与冻存前以及对照组细胞的形态没有明显变化，均呈梭形，折光度高，分布均一。由图3，及表2可以见，与冻存前和对照组相比，本发明冻存脐带间充质干细胞1年后复苏，增殖能力没有明显变化。如图5～8所示，本发明冻存脐带间充质干细胞1年后复苏，其成脂、骨分化能力与冻存前以及对照组细胞的形态没有明显变化，均出现大量的脂肪滴和钙堆积。仍然具有成脂、骨分化能力。如图9～15所示，本发明冻存脐带间充质干细胞1年后复苏48小时后的细胞高表达cd90、cd105、cd73，而不表达cd31、cd34、cd45、hla-dr，符合人间充质干细胞表面标志的特征。实验结果证明，用本发明冻存液冻存脐带间充质干细胞，细胞形态、表型，增殖、分化能力均未受到影响；本发明间充质干细胞冻存液可以长时间维持细胞活率，临床应用非常有效方便。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页12