按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存。
[0031]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0032]实验方法:
按上述四个步骤冻存干细胞24h后，
步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波(频率为8~13Hz)振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为
6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ;
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0033]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0034]实验结果:测得复苏率为97.6% (图1上图为未冻存的干细胞，下图为冻存24h后复苏的干细胞)
实施例2
一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代；
步骤二:将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去离子水的混合溶液中，维持温度在3.9°C的条件下，在次声波振荡频率为13Hz的条件下加入3.2%的DMS0, 5%的聚乙二醇，0.5%的葡萄糖，0.7%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.3%的Rho抑制剂，其中Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔1:1:1的混合物，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存。
[0035]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0036]实验方法:
按上述四个步骤冻存干细胞24h后，
步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波(频率为8~13Hz)振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ;
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0037]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0038]实验结果:测得复苏率为96.9%
实施例3 一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代；
步骤二:将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去离子水的混合溶液中，维持温度在3.5°C的条件下，在次声波振荡频率为10Hz的条件下加入8.4%的渗透性保护液，0.35%的葡萄糖，0.55%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.2%的Rho抑制剂，其中渗透性保护液为40%的DMS0和60%的聚乙二醇，Rho抑制剂为法苏地尔和羟基法苏地尔的混合溶液，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存。
[0039]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0040]实验方法:
按上述四个步骤冻存干细胞24h后，
步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波(频率为8~13Hz)振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ;
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0041]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0042]实验结果:测得复苏率为97.4%
实施例4
一种低冷冻损伤的干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:
步骤一:抽取脐带血，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代；