一种造血干细胞冻存新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种造血干细胞冻存方法。
【背景技术】
[0002] 造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更 新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细 胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命 极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个 成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液 系统各个细胞组分的生理平衡的角色。
[0003] 造血干细胞在临床上应用极为广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功 的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有-196Γ液氮程控降 温保存和_80°C非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23~25年， 但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1~2年，其操作相对简 便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。
[0004] 探索一种操作简便、快速、成本低廉及保存时间更长的干细胞冻存方法，对于临床 造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。在造血干细胞的冻存中，使 用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于-80°c低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜 (下称DMS0)、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及 使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率 为80 %左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种造血干细胞的冷冻保存方法，操作简便、保存成本 低，细胞存活率更高。
[0006] 为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：造血干细胞冻存新方法，第一步，取 造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6 ;第二步，将造血干细胞悬 液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，然后排净空气、密封放入-80°C冰箱保存12小 时；第三步，取出上述的造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入 造血干细胞保护剂，造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1 :3,再次排净空气、密封放 入-80°C冰箱保存；
[0007] 所述的造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2 : 3 ；
[0008] 所述试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生 理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30%、5%、 15% ；
[0009]所述试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10%。
[0010] 更加优选的技术方案，所述的造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液的体 积比为1. 5:6。
[0011] 以上体积的单位均为ml。
[0012] 其中第三步中造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1 :3,混合液指第二步造血 干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀得到的混合液。
[0013] 二甲基亚砜（DMS0)具有高极性、高沸点、热稳定性好、与水混溶的特性，能溶于乙 醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为"万能溶剂"。
[0014] 与现有技术方案相比，本发明的有益效果：第一，造血干细胞保护剂分两次加入造 血干细胞悬液或骨髓液，通过实验发现粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM略高与传统 冻存方法，但是细胞活力、CD34+细胞回收率的检测明显高于传统方法保存效果；第二，本 发明保存方法能较简便的在_80°C非程控降温的条件下保存造血干细胞，保存简单方便，为 临床外周血造血干细胞的储存应用及造血干细胞移植提供可靠保证。
【具体实施方式】
[0015]下面对本发明作进一步说明。
[0016]实施例：造血干细胞冻存新方法，第一步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液 或骨髓液，体积比为1. 5:6;第二步，将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合 均匀，然后排净空气、密封放入_80°C冰箱保存12小时；第三步，取出上述的造血干细胞悬 液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入造血干细胞保护剂，造血干细胞保护 剂与混合液的体积比为1 :3,再次排净空气、密封放入-80°C冰箱保存；造血干细胞保护剂 由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2 :3 ;试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640 无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙 基淀粉的质量百分比分别为30 %、5 %、15 % ;试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量 百分比为10%。
[0017] 按照以上方法制备造血干细胞保护剂150ml+250ml，准备600ml(A组）+600ml(B 组）+600ml(C组）造血干细胞悬液，取上述150ml保护剂与600ml(C组）造血干细胞混合 均匀，分成10份分别装入10个密封袋保存，作为C组试验用。
[0018] 实验一共分3组即A，B，C，每组分别采用10个密封袋保存，采用本发明技术方案和 传统的冻存方案在不同时间点进行抽样检测，每组的数据均取平均值（即每组的数据均是 取10个数据的平均值），结果如下。
[0019] 本发明冻存方法与传统造血干细胞冻存方法实际效果比较如下表，其中传统冻存 方法指-196Γ液氮程控降温保存和-80°c非程控降温保存，传统冻存方法（包括保护剂配 比）属于现有的公知技术，不详细描述。但是传统保护剂的配比各个资料文件中数值略有 不同，为了更好的进行试验，以下试验中传统冻存方法（即传统-196Γ液氮程控降温保存） 采用的保护剂中二甲基亚砜、羟乙基淀粉、人血白蛋白的质量百分比为1〇%，6%，4% ;保护 剂与造血干细胞悬液的体积比为1:4。传统冻存方法（传统-80°C非程控降温保存）采用 的保护剂中二甲基亚砜，1640、血液保存液I的质量百分比为10%，5%，4%，保护剂与造血 干细胞悬液的体积比为1:4。
[0020] 表1是冻存过程中不同时间点细胞活力的检测（％ )
[0021]
[0022] 表2是冻存过程中不同时间点粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM的检测（每 10万个细胞）
[0023]
[0024]
[0025] 表3是冻存过程中不同时间点⑶34+细胞（造血干细胞）的检测（％ )
[0026]
[0028] 通过以上3组实验可以发现，本发明的方法冻存的干细胞的细胞活性、粒细胞巨 噬细胞集落生成单位CFU-GM和⑶34+细胞回收率均略优于传统冻存方法。
【主权项】
1. 一种造血干细胞冻存新方法，其特征在于：第一步，取造血干细胞保护剂、造血干细 胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6 ;第二步，将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护 剂混合均匀，然后排净空气、密封放入-80°C冰箱保存12小时；第三步，取出上述的造血干 细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入造血干细胞保护剂，造血干细 胞保护剂与混合液的体积比为1 :3,再次排净空气、密封放入-80°C冰箱保存； 所述的造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2 :3 ; 所述试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水， 二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30%、5%、15% ; 所述试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10%。2. 根据权利要求1所述的造血干细胞冻存新方法，其特征在于：第一步，造血干细胞保 护剂、造血干细胞悬液或骨髓液的体积比为1. 5:6。
【专利摘要】本发明公开了一种造血干细胞冻存新方法，第一步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6；第二步，将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，然后排净空气、密封放入-80℃冰箱保存12小时；第三步，取出上述的造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入造血干细胞保护剂,造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，再次排净空气、密封放入-80℃冰箱保存；本发明冻存方法简便易操作，冻存效果更好。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105394026
【申请号】CN201510732004
【发明人】秦岭
【申请人】江苏赛尔特生物技术有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年10月31日