至大部分种子的种皮脱落飘至溶液上层。过滤后得到的种子用无菌水清洗6遍后，保持无 菌水在离心管中浸泡种子，封好盖子，放入4°C冰箱10小时。
[0046] 用MS培养基配置AHC浓度为0· lg/L、6-BA浓度为0· 2mg/L、2, 4D浓度为6mg/L的 诱导培养基，将诱导培养基高压灭菌后放置于超净工作台静置降温后倒在培养皿中等待接 种。
[0047] 将浸泡后的种子取出，重新用无菌水清洗3遍后，倒在铺有4层无菌滤纸的培养皿 中，待滤纸吸干种子表面水份后，按一盘40粒种子的数量在培养基上接种。
[0048] 将种子在25°C下全黑暗培养进行愈伤诱导30天后更新培养基进行继代一次，统 计出愈率，此后，30天再继代一次，共计60天，统计胚性愈伤率。诱导过程中观察种子的出 芽情况，及时将芽拔除。将出愈率（愈伤组织诱导率，简称出愈率）和胚性愈伤率列于表2。 蒙特利III种子诱导60天后获得的胚性愈伤组织见图1。
[0049] 实施例2
[0050] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0051] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2, 4D的浓度为 6. 2mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0052] 实施例3
[0053] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0054] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2, 4D的浓度为 5. 8mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0055] 实施例4
[0056] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0057] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为 0. 18mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0058] 实施例5
[0059] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0060] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为 0. 22mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0061] 实施例6
[0062] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0063] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中AHC的浓度为 0. 08g/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0064] 实施例7
[0065] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0066] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中AHC的浓度为 0. 12g/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0067] 实施例8
[0068] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0069] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为 夜影种子。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0070] 实施例9
[0071] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0072] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为 高帽种子，培养基中不含有AHC。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0073] 实施例10
[0074] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0075] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为 德比极品，诱导培养基中2, 4D的浓度为4mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。德比极品 诱导60天后获得的胚性愈伤组织见图2。
[0076] 实施例11
[0077] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0078] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为 德比极品，诱导培养基中2, 4D的浓度为3. 8mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0079] 实施例12
[0080] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2, 4D的浓度为 5. Omg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0081] 实施例13
[0082] 按照与实施例10相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2, 4D的浓度为 5. Omg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0083] 实施例14
[0084] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中不添加 AHC。出愈 率和胚性愈伤率列于表2。
[0085] 实施例15
[0086] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0087] 按照与实施例9相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为 0. 22mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0088] 对比例1
[0089] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2, 4D的浓度为 6. 4mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0090] 对比例2
[0091] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为 0. 16mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
[0092] 对比例3
[0093] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中不添加6-BA。出愈 率和胚性愈伤率列于表2。
[0094] 对比例4
[0095] 按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中不添加2, 4D。出愈 率和胚性愈伤率列于表2。
[0096] 表 2
[0098] 通过将实施例1-15的结果与对比例1-4的结果进行对比可以看出，利用本发明所 提供的方法进行多年生黑麦草愈伤组织诱导时，出愈率和胚性愈伤率显著高于对比例所取 得的诱导效果。
[0099] 通过将实施例1的结果与实施例2和3的结果进行对比可以看出，当2, 4D的浓度 为本发明优选的浓度时，获得的出愈率和胚性愈伤率更高。
[0100] 通过将实施例1的结果与实施例4和5进行对比可以看出，当6-BA的浓度为本发 明优选的浓度时，获得的出愈率和胚性愈伤率更高。
[0101] 通过将实施例10的结果与实施例11和13的结果进行对比可以看出，当对德比极 品进行诱导时，2, 4D的浓度为本发明优选的浓度时，获得的德比极品出愈率和胚性愈伤率 更尚。
[0102] 通过将实施例9的结果与实施例15的结果进行对比可以看出，当对高帽进行诱导 时，诱导培养基中各原料的浓度为本发明优选的浓度时，获得的高帽出愈率和胚性愈伤率 更尚。
[0103] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：将多年生黑麦 草种子消毒处理并脱种皮，再在3-5°C的无菌水中浸泡7-9小时后接种于诱导培养基中进 行愈伤诱导； 其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基中含 有按质量体积比计3. 8-6. 2mg/L的2, 4D、0. 18-0. 22mg/L的6-BA和0-0. 12g/L酸水解酪蛋 白。2. 根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述多年生黑麦草种子的品种为高 帽，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，6mg/L的2, 4D、0. 2mg/L的6-BA，不含有酸水 解酷蛋白。3. 根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述多年生黑麦草种子的品种为 蒙特利ΠΙ或夜影，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，5. 8-6. 2mg/L的2, 4D、 0· 18-0. 22mg/L 的 6-ΒΑ、0· 08-0. 12g/L 的酸水解酪蛋白。4. 根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述多年生黑麦草种子的品种为德 比极品，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，3. 8-4mg/L的2, 4D、0. 18-0. 22mg/L的 6-BA、0. 08-0. 12g/L的酸水解酪蛋白。5. 根据权利要求1-4中任意一项所述的诱导方法，其特征在于，所述愈伤诱导的步骤 包括：在20-28 °C下全黑暗培养67-77天，全黑暗培养过程中每30-35天换一次培养基继代 一次，共继代2次。6. 根据权利要求5所述的诱导方法，其特征在于，全黑暗培养7天后将种子发出的芽拔 除。7. 根据权利要求1-4和6中任意一项所述的诱导方法，其特征在于，所述消毒处理并 脱种皮的步骤包括：将多年生黑麦草种子4-5g置于含有浓度为1. 2-1. 8%的吐温-80和 8. 5-9. 5%的次氯酸钠的溶液中搅拌40-50min脱去种皮，再用无菌水清洗3-6遍。8. 根据权利要求7所述的诱导方法，其特征在于，所述方法还包括在浸泡结束后用无 菌水将种子清洗2-3遍，再用滤纸吸干种子表面的水分。9. 根据权利要求1-4和8中任意一项所述的诱导方法，其特征在于，所述方法还包括在 第一次继代时统计出愈率，在第二次继代时统计胚性愈伤率。
【专利摘要】本发明涉及一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮，再在3-5℃的无菌水中浸泡7-9小时后接种于诱导培养基中进行愈伤诱导；其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计3.8-6.2mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA和0-0.12g/L酸水解酪蛋白。利用本发明所提供的方法，可以通过简单的操作步骤对多年生黑麦草愈伤组织进行诱导，不需要对种子进行划开处理，而且具有显著提高的出愈率和胚性愈伤率。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105684894
【申请号】CN201410710582
【发明人】许立新, 瞿杨, 梁小红, 韩烈保
【申请人】北京林业大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年11月27日