专利名称：表面上带有pna和/或dna寡聚物的寡聚物阵列的制作方法
技术领域：
本发明涉及表面上带有PNA(肽核酸)和/或DNA寡聚物的寡聚物阵列。
根据过去几年里方法进展的在分子生物学领域里仔细研究的观察层面是基因本身，这些基因向RNA的翻译，以及由此而产生的蛋白质。在个体的发育过程中，它的基因何时启动，某些基因在一定的细胞和组织中的活化和抑制如何控制，是同基因或基因组的甲基化和特性相关联的。在这一方面明显地假定为病原的状态在单个基因或者基因组的一个改变的甲基化模型中表现出来。
5-甲基胞嘧啶在DNA真核细胞中是经常发生共价修饰的碱基。比如说，它在转录调控、基因组印记、肿瘤基因方面起作用。5-甲基胞嘧啶识别作为基因信息的组成部分因此有着极大的意义。5-甲基胞嘧啶的位置但是却不能通过测序而被确定，因为5-甲基胞嘧啶表现出了和胞嘧啶同样的碱基配对特性。除此之外，在PCR的扩增过程中，5-甲基胞嘧啶所携带的后生信息会完全丢失。
把基因组碱基胞嘧啶修饰为5′-甲基胞嘧啶，直到今天仍是最重要研究最详细的后生参数。尽管如此今天有方法查出大量的细胞和个体的基因类型，但是还没有可比的附件(Anstze)可以大量产生和分析后生信息。
一个相对新的，在此期间经常为人们所使用的研究5-甲基胞嘧啶上的DNA的方法是以亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特殊反应为基础，在随后发生的碱性水解反应中转化成尿嘧啶，它在碱基配对特性中是与胸苷相对应的。相反5-甲基胞嘧啶在这些条件下未被修饰。在这种情况下，初始的DNA会发生变化，原来通过它的杂交不能同胞嘧啶区分开来的甲基胞嘧啶，现在应用普通的分子生物学技术比如通过扩增、杂交或者测序分析可以证实是特有残留胞嘧啶。所有这些技术都以碱基配对为根据，现在仍被完全利用。所涉及的现有技术水平，可以通过一个方法来阐明，该方法将被研究的DNA包括在琼脂基质里，从而阻碍DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐只对单股的DNA起反应)，所有沉淀和净化步骤可以通过快速渗析代替(Olek，A..et al.，NuCl.Acids.Res.24，5064-5066)。用这种方法可以研究单一细胞，表明了这种方法的潜能。但是直到如今只研究了个别的地区直到约3000个碱基对的长度，全球性的对细胞中上千甲基化的发生的研究是不可能的。此外，这种方法也不能用于微量样品中非常小的片段的可靠分析。尽管有扩散保护，但这些物质还会通过基质流失。
检测5-甲基胞嘧啶的其它已知可能方法的概况，可以参考下面的概述文章Rein，T.，DePamphilis，M.L.，Zorbas，H.，NucleicAcids Res.26，2255(1998)。
从理论上讲，有很多可能性可制备在不同表面上的寡聚物阵列。
1.所有的寡聚物可以以传统的方法单个或较大量地在试管里或者是在特殊的自动人工合成装置里制造，然后单独移吸到载体上。对此，人们通常使用自动的高精度的微量加样器。这一方法的好处在于，更加以已经优化了的标准方法和工具为根据。这样，人们可以制造出质量高的有非常纯净的寡聚物的DNA阵列，这样会对阵列的检测敏感性和可靠性起到一个极大正面影响。这一方法的缺点是花费很多。它特别地用于单个寡聚物的合成。
2.寡聚物可以通过吸移以最小量直接在底物上合成。在每一个光栅(raster)点处，预定的寡聚物链会一个核碱基一个核碱基地建立起来。加样的方法类似于方法1)，用一个特殊的微型加样仪器或者例如一个设备，通过它的管道输送各个合成构成单元到阵列的各个点(EP-A 0915897)。化学合成方法同传统的寡聚物在自动合成器里的合成方法是基本上一样的。区别在于，所有的寡聚物不依靠数量的多少同时由一个单独的自动仪器直接在预定的地点生产出来。在方法1)分开的操作步骤寡聚物的合成和微型加样，现在都合为一个操作程序。在仪器和手工劳动上的花费同方法1)相比明显减少。
3.寡聚物如方法2)中的那样直接在底物上合成，但是正确的核碱基在正确的光栅点处有目的的连接起来，可通过一个完全平行的，源于半导体准备的光刻术取代顺序的、目的明确的、加样过程。这一方法是基于人们可以利用一定波长的光，把5′-OH保护基团从寡核苷酸有目的地除去。通过恰当的局部照射模型人们可以使得寡核苷酸末端恰恰在那些光栅点上有反应活性，人们会在下一个步骤里把一个新的核苷酸构成单元连接在这些光栅点上。在阵列表面被核苷酸构成单元溶液完全润湿的情况下，只有在以前照射的位置会有核碱基连接起来，所有未照射区域保持不变。局部照射模型通过在底物和光源之间安放一个微型光刻术黑白掩模形成，这个光板能遮住所有的光栅位，使光栅位无反应活性。在所有的光栅点处，寡聚物链延长一个核碱基，这一反应的发生如下在第一个掩模的帮助下，必须延长4种可能类型核碱基中的第一种(比如C)的光栅点被准确照射。以后阵列被相应的核苷酸构成单元溶液润湿，只有被照射点能被延长这一碱基。因为新连接的核苷酸构成单元还拥有保护基，所以这些核苷酸构成单元不会在下面的步骤里再发生反应了，直到它们的保护基通过另外的照射裂解掉。在这步反应后，清洗阵列。现在在第二个掩模的帮助下精确地照射必须延长四种可能核碱基中的第二种(比如T)的光栅位。阵列又一次用相应的核苷酸构成单元溶液润湿，因而照射区域延长了这个碱基。同样对剩下的两个核碱基(G和A)进行操作。为了让所有的寡聚物都延长一个核碱基，需要四个照射步骤和四个掩模。
这种方法由于在加工处理过程中的高平行性而快速、有效。此外，由于高精确性(可以由光刻术实现)也非常适合达到高光栅密度。
关于在寡聚物阵列的制造现有技术水平的概况是从1999年1月出版的自然界遗传学增刊(自然界遗传学增刊，21册1999年1月)以及节选的参考文献中获悉的。
通常涉及到寡聚物阵列和光刻术掩模设计的专利有比如，US-A5,837,832，US-A 5,856,174，WO-A 98/27430和US-A 5,856,101。此外还有几个材料和方法专利。这些限制了在核苷酸上对光不稳定的保护基的使用，比如WO-A 98/39348以及US-A 5,763,599。
为了固定DNA，有各种不同的方法。最著名的方法是把用生物素官能化的DNA固定结合在涂有链酶抗生物素的表面上。这个系统的连接强度相当于一个没有连接的共价化学键。为了把一个目标DNA共价地连接到一个化学准备好的表面，需要目标DNA有相应的官能度，DNA本身没有恰当的官能基团。有各种不同的方法可以在目标DNA中引入恰当的官能基团两个容易处理的官能基团是伯脂肪胺和硫醇。这些胺同N-羟基-琥珀酰亚胺酯发生了完全反应，而硫醇在适当的条件下同烷基碘化物发生完全反应。困难在于，把这样的一个官能基团引入DNA中。最简单的方法是通过一个PCR的引物来引入。上述的方法需要5′-修饰的引物(NH2和SH)以及一个双官能的连接体。
在表面上固定的一个主要因素是它们的特性。直到今天，被描述的系统主要是来自硅或者金属(磁性珠子)。连接目标DNA的另外一个方法是基于，运用一个短的识别序列(比如20个碱基)在目标DNA中用于在一个表面稳固的寡核苷酸上进行杂交。
作为在寡聚物阵列中在一个表面上固定的探针，寡核苷酸是适合的。但是也出现对核苷酸的修饰，比如PNA(肽核酸)(Nielsen，P.E.，Buchardt，O.，Egholm，M.and Berg，R.H.1993.Peptide nucleicacids.US专利。5,539,082；Buchardt，O.，Egholm，M.，Berg，R.H.和Nielsen，P.E.1993.Peptide nucleic acids and their potentialapplication in biotechnology.Trends in Biotechnology 11384-386)、硫代磷酸寡核苷酸或者甲基硫代磷酸寡核苷酸。这个探针的特异性十分重要。PNA有一个未装载的主链，同时这个主链在化学上与核酸中主链的常见糖-磷酸酯结构有很大不同。PNA的主链有一个酰胺序列来取代常见的DNA主链的糖-磷酸酯。PNA同互补序列的DNA很好地杂交。PNA/DNA杂交物的熔化温度比相应的DNA/DNA杂交物高，杂交受缓冲盐的影响非常小。
基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI)是一个在分析生物分子领域上的新的很有成效的发展(Karas，M.and Hillenkamp，F.1988.Laser desorption ionization of proteins with molecular massesexceeding 10.000daltons.Anal.Chem.602299-2301)。分析分子被加入在UV吸收的基质内。借助一个短的激光器脉搏，基质在真空中被蒸发，分析物无碎片地进入气相。一个外加的电压加速离子进入无电场的飞行管中。根据质量的不同，离子加速的程度也不同。小的离子要比大的离子早些到达检测器，飞行时间也被折算成离子质量。
本发明的任务在于，提供出寡聚物阵列，这个阵列特别适合于对胞嘧啶甲基化的检测。
这项任务按本发明通过下面的方法得以解决，即创造出一种表面上带有PNA(肽核酸)和/或DNA-寡聚物的寡聚物阵列，包含各由6-20个单体或核碱基组成的寡聚物，其中所述单体或核碱基至少包含通式DDCGDD，或通式DDTGDD，或通式HHCGHH，或通式HHCAHH的一种序列，其中H代表腺嘌呤A、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T碱基中的一种碱基，D代表腺嘌呤A、鸟嘌呤G或胸腺嘧啶T碱基中的一种碱基，其中寡聚物在表面上的位置与寡聚物的序列相关。
本发明优选的是，至少10％的寡核苷酸包含通式DDCGDD，或通式DDTGDD，或通式HHCGHH，或通式HHCAHH的一种序列。
本发明还优选的是，至少25％的寡核苷酸包含通式DDCGDD，或通式DDTGDD，或通式HHCGHH，或通式HHCAHH的一种序列。
另外本发明优选的是，至少50％的寡核苷酸包含通式DDCGDD，或通式DDTGDD，或通式HHCGHH，或通式HHCAHH的一种序列。
同时，本发明优选的是，至少75％的寡核苷酸包含通式DDCGDD，或通式DDTGDD，或通式HHCGHH，或通式HHCAHH的一种序列。
本发明优选的是，表面是平滑的，寡聚物在一个直角或者是六边形的光栅里安装在上面，这个光栅会协调归类。但也可以选择其它合适几何方式的装置，这样有助于改善自动化的可能性，比如圆形的装置。
一个优选的寡聚物阵列包含通式DDCGDD和通式DDTGDD和通式HHCGHH和通式HHCAHH的序列。
特别优选的寡聚物阵列包含通式DDCGDD和通式DDTGDD的序列或通式HHCGHH和通式HHCAHH的序列。
优选的是，至少包括100个不同的寡聚物。
本发明优选的是一个按本发明的寡聚物阵列，其特征是，适合于每一个包括一个CG序列的寡聚物，固定一个类似的寡聚物，它与上述提到的寡聚物的区别仅在于，前者寡聚物不是含有CG序列而是含有一个TG序列或者CA序列。
此外优选的是，表面是玻璃的。
优选的还有，表面是金属的或者其它导电的材料。这里特别优选的是，表面是一个MALDI质谱仪的靶。
本发明所描述的寡聚物阵列，可以用于检测基因组DNA试样的甲基化状态。
本发明所研究的另一个主题就是，本发明的寡聚物阵列用于在先前扩增后DNA片段的杂交的用途。
这里特别优选的是，在扩增DNA之前用亚硫酸氢盐溶液处理DNA。
本发明所研究的另一个主题就是，本发明的寡聚物阵列用于检测基因组DNA中胞嘧啶甲基化的用途。
本发明所研究的主题是一个表面上带有PNA或者DNA-寡聚物的装置，优选寡聚物阵列的形式，包含各由6-20个单体(或者核碱基)组成的寡聚物，单体(或核碱基)又包含通式DDCGDD和/或通式DDTGDD和/或通式HHCGHH和/或通式HHCAHH的序列，其中寡聚物在表面上的位置使得可以推出它们的序列。这种类型的寡聚物阵列特别适合于检测基因组DNA中的胞嘧啶甲基化。上面展示过的序列根据DNA的甲基化情况，在用亚硫酸氢盐化学预处理后进行不同程度的杂交。
为了能把由这些杂交出来的信号更好地归类到所用的寡聚物序列，这里特别优选的是，表面是光滑的，寡聚物在直角或六边形的光栅上安装在上面，光栅会协调归类。
特别优选的是，表面上带有PNA(肽核酸)或DNA-寡聚物的装置，包含各由6-20个单体(或核碱基)组成的寡聚物，包含通式DDCGDD和通式DDTGDD和通式HHCGHH和通式HHCAHH的序列，其中寡聚物在表面上的位置使得可以推出它们的序列。
特别优选的是，表面上带有PNA(肽核酸)或DNA寡聚物的装置，包含各由6-20个通式DDCGDD和通式DDTGDD的单体(或核碱基)组成的寡聚物，其中寡聚物在表面上的位置使得可以推出它们的序列。
特别优选的是，表面上带有PNA或DNA-寡聚物的装置，包含各由6-20个通式HHCGHH和通式HHCAHH的单体(或核碱基)的寡聚物，其中寡聚物在表面上的位置使得可以推出它们的序列。
特别优选的是，这个装置至少包括100个不同的寡聚物，每一个都包括序列DDCGDD，DDTGDD，HHCGHH或者HHCAHH中的至少一种。
在一个特别优选的实施形式中，装置表面由玻璃制成。另外一个优选的实施形式中，装置表面由金属或者其它导电材料制成。另外一个同样特别优选的实施形式中，装置的特点在于，表面是MALDI质谱仪的靶。
本发明的主题是表面上带有PNA或DNA-寡聚物的装置的用途，该装置包含各由6-20个单体(或核碱基)组成的寡聚物，而单体(或核碱基)又包括通式DDCGDD和/或DDTGDD和/或HHCGHH和/或HHCAHH的序列，其中寡聚物在表面上的位置使得可以推出它们的序列，用于事先扩增过的DNA片段的杂交。
这里特别优选的是DNA片段的应用，这些片段可以借助于聚合酶链反应生成。
特别优选的是表面上带有PNA或/DNA-寡聚物的装置的用途，该装置包含各由6-20个单体(或核碱基)组成的寡聚物，而单体(或核碱基)又包括通式DDCGDD和/或DDTGDD和/或HHCGHH和/或HHCAHH的序列，其中寡聚物在表面上的位置使得可以推出它们的序列，用于事先用亚硫酸氢盐溶液处理过的DNA的杂交，特别优选的是DNA被扩增。
特别优选的是表面上带有PNA或/DNA-寡聚物的装置的用途，该装置包含各由6-20个单体(或核碱基)组成的寡聚物，而单体(或核碱基)又包括通式DDCGDD和/或DDTGDD和/或HHCGHH和/或HHCAHH的序列，其中寡聚物在表面上的位置使得可以推出它们的序列，用于检测基因组DNA中的胞嘧啶甲基化。
图1表示了本发明的寡聚物阵列检测基因组DNA中的胞嘧啶甲基化模型的用途。
图1中，字母H、D、N有下面的含义H代表腺嘌呤A、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T碱基中的一种，D代表腺嘌呤A、鸟嘌呤G或胸腺嘧啶T碱基中的一种，N代表腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T碱基中的一种碱基。
只是在胞嘧啶甲基化上不同的DNA序列，在用亚硫酸氢盐处理后得到一个改变了的核碱基序列。甲基化的胞嘧啶用亚硫酸氢盐处理后没有改变，而没有甲基化的胞嘧啶变成了胸腺嘧啶。在扩增后产生了不同的序列，然后它们就会连接在寡聚物阵列的不同的位置，在这些位置上有互补的序列。因为在寡聚物上的序列是知道的，可以推出在原始的DNA中存在的胞嘧啶的甲基化。
权利要求
1.表面上带有PNA(肽核酸)或/DNA-寡聚物的寡聚物阵列，包含各由6-20个单体或核碱基组成的寡聚物，单体或核碱基包含通式DDCGDD或通式DDTGDD或通式HHCGHH或通式HHCAHH的序列中的至少一种，其中H代表腺嘌呤A、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T碱基中的一种碱基，D代表腺嘌呤A、鸟嘌呤G或胸腺嘧啶T碱基中的一种碱基，其中寡聚物在表面上的位置与寡聚物的序列相关。
2.根据权利要求1的寡聚物阵列，其特征是，至少10％的寡核苷酸包含通式DDCGDD或通式DDTGDD或通式HHCGHH或通式HHCAHH的一种序列。
3.根据权利要求1的寡聚物阵列，其特征是，至少25％的寡核苷酸包含通式DDCGDD或通式DDTGDD或通式HHCGHH或通式HHCAHH的一种序列。
4.根据权利要求1的寡聚物阵列，其特征是，至少50％的寡核苷酸包含通式DDCGDD或通式DDTGDD或通式HHCGHH或通式HHCAHH的一种序列。
5.根据权利要求1的寡聚物阵列，其特征是，至少75％的寡核苷酸包含通式DDCGDD或通式DDTGDD或通式HHCGHH或通式HHCAHH的一种序列。
6.根据权利要求1-5之一的寡聚物阵列，其特征是，表面是平滑的，寡聚物在直角或六边形的光栅上安装在上面，光栅会协调归类。
7.根据前述权利要求之一的寡聚物阵列，包含了通式DDCGDD和通式DDTGDD和通式HHCGHH和通式HHCAHH的序列。
8.根据权利要求1-6之一的寡聚物阵列，包含了通式DDCGDD和通式DDTGDD的序列或通式HHCGHH或通式HHCAHH的序列。
9.根据前述权利要求之一的寡聚物阵列，其特征是，至少包含了100个不同的寡聚物。
10.按照前述权利要求之一的寡聚物序列，其特征是，符合每一个包含一个CG序列的寡聚物，固定一个类似的寡聚物，与前述寡聚物区别在于含有的不是CG序列而是TG序列或CA序列。
11.按照前述权利要求之一的寡聚物序列，其特征是，表面是由玻璃做的。
12.按照权利要求1-10之一的寡聚物序列，其特征是，表面是由金属或者导电材料组成的。
13.按照权利要求11的寡聚物序列，其特征是，表面是MALDI质谱仪的靶。
14.按照权利要求1的寡聚物阵列在事先扩增后用于DNA片段杂交的用途。
15.按照权利要求14的用途，其特征是，在扩增之前用亚硫酸氢盐溶液处理DNA。
16.按照权利要求1的寡聚物阵列用于检测基因组DNA甲基化的用途。
全文摘要
本文描述了在表面上带有PNA(肽核酸)和/或DNA－寡聚物的寡聚物阵列，所述寡聚物包含各由6－20个单体或核碱基组成的寡聚物，所述单体或核碱基包含至少一个通式为DDCGDD或通式为DDTGDD或通式为HHCGHH或通式为HHCAHH的序列。其中H代表腺嘌呤A、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T碱基中的一种，D代表腺嘌呤A、鸟嘌呤G或胸腺嘧啶T碱基中的任一种。寡聚物在该表面上的阵列位置与寡聚物的序列相关。利用发明的寡聚物阵列，可以检测基因组DNA的胞嘧啶甲基化。
文档编号C12Q1/68GK1413263SQ0081619
公开日2003年4月23日 申请日期2000年11月24日 优先权日1999年11月25日
发明者K·柏林 申请人:Epi基因组股份公司