用于治疗的una寡聚体的制作方法

用于治疗的una寡聚体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于治疗的UNA寡聚体。具体而言，本发明涉及RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸的复合物，其含有至少一个羟甲基取代的核苷酸单体。羟甲基取代的核苷酸单体理解为含有羟甲基基团的核苷酸单体。该羟甲基基团不参与形成核苷酸间键合且不是天然RNA单体的羟甲基基团。该复合物包括能够调节基因表达的短干扰RNA复合物。这些链中至少一条被一个或多个本发明的羟甲基取代的核苷酸单体修饰，所述核苷酸单体可位于3’-末端、5’-末端或内部。本发明的RNA复合物还可为以至少一个羟甲基取代的核苷酸单体修饰的单链RNA寡核苷酸。本发明的复合物相对于包括完全天然RNA单体的相应复合物展示对溶核降解增强的稳定性。
【专利说明】用于治疗的UNA寡聚体
[0001] 本申请是申请号为200880016977. 5,申请日为2008年05月21日，发明名称为"羟 甲基取代的RNA寡核苷酸和RNA复合物"的中国专利申请的分案申请。
[0002] 序列表
[0003] 本申请包括序列表，其经由EFS-Web以2009年11月2日创建的名为MD0807PC. txt的ASCII文件提交，大小是30, 642字节，据此通过引用将其全部内容并入本文。

【背景技术】
[0004] RNA干扰（RNAi)近年吸引了大量注意，因为它提供沉默靶基因表达的手段。它为 基础研究提供研究遗传和生化途径、和单独基因和基因产物功能的方法。因此，RNA干扰已 成为在制药行业中验证靶的关键工具。而且，本着开发可用作药物的能够介导RNA干扰复 合物的RNA复合物的目标，已进行了大量的研究。
[0005] RNAi用于治疗的吸引力在于其敏感性和序列特异性。然而，已经产生了关于序列 特异性的担忧，如由于RNA复合物的错误链可能指导对错误的靶核酸响应。而且，某种大小 的RNA复合物诱导非特异性干扰素依赖性响应，这也是不期望的。
[0006] 专利申请US2003/0108923描述能够介导RNAi的包含反义链和信使链的RNA复合 物，其中各链长度是21-23个核苷酸。提议将该RNA复合物用于治疗应用。
[0007] 类似地，专利申请US2005/0234007描述能够介导RNAi的包含反义链和信使链的 RNA复合物，其中复合物包括3' -悬端（3' -overhang)。提议将该RNA复合物用于治疗应 用。
[0008] W02005/073378描述含有化学修饰的核苷酸、能够介导RNAi、包含反义链和信使 链的RNAi复合物。该说明书中所述的RNA复合物包括LNA残基，且指出在靠近一条链5' 末端处并入LNA残基可控制哪条链并入RISC复合物，因为在5-末端形成最弱碱基对的链 并入RISC复合物。
[0009] RNAi只是使用包括本发明的RNA复合物的寡核苷酸介导基因表达抑制的许多策 略之一。包括RNA酶H介导的RNA裂解、立体封闭RNA结合、DNA酶或核酶介导的RNA裂解 和siRNA方法的这些不同策略已连同与生物活性相容的所选的化学修饰的核苷酸的性质 描述于文献中[J. Kurreck, Eur. J. Biochem. 2003, 270, 1628]。
[0010] 本发明的羟甲基取代的单体B-E已经被并入DNA链，且因此已报道制备其 用于自动DNA/RNA合成的亚磷酰胺结构单元的程序[K. D. Nielsen等人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3,1493 ;H.Thrane 等人，Tetrahedron 1995, 51，10389 ;P. Nielsen 等 人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]。已被并入DNA链的胸腺嘧啶单体是独有的。这些羟甲 基取代的单体此前都还未被并入RNA链。
[0011] 在一项报道中，一个或两个2' -开环尿苷被并入DNA寡核苷酸并观察到对RNA酶 H介导的 RNA 降解的积极效应（Mangos MM，Min KL，Viazovkina E，Galarneau A, Elzagheid MI, Parniak MA, Damha MJ.，J Am Chem Soc. 2003Jan 22 ; 125 (3):654-61.)。


【发明内容】

[0012] 本发明提供具有并入RNA链的一个或多个羟甲基取代的单体、将在关于RNA-引导 的基因调节或基因分析、尤其是RNA干扰的情况下使用的RNA复合物。因此，本发明的一个 目的是提供与通常使用的RNA复合物相比具有减少的脱靶效应的RNA复合物。另一目的是 提供诱导减少的干扰素应答的RNA复合物。又另一目的是提供在细胞培养物中或体内关于 对酶促降解的稳定性具有改善特性的RNA复合物。又另一目的是提供相对于未修饰的RNA 复合物，在细胞培养物中或体内展示增强的基因调节功能如基因沉默效应的RNA复合物。 又另一目的是提供靶向特定器官或组织并能够穿透细胞膜的RNA复合物。本发明还提供适 于将羟甲基取代的单体并入寡核苷酸的单体和其合成方法。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1 :显示并入RNA复合物的羟甲基取代的核苷酸的不同构造的示例。为了比较 显示单体A，其是具有其核糖支架的天然RNA单体。包括在本发明的RNA复合物中的单体 B-E的特征是其包含为羟甲基基团（"自由羟甲基基团"）的取代基，且因此本发明题为"羟 甲基取代的RNA寡核苷酸和RNA复合物"。自由羟甲基基团例如连接在环状核糖支架的C4' 原子或基于无环的核糖的支架的C1'原子。本发明的羟甲基取代的核苷酸含有各自连接于 磷原子并因此参与形成核苷酸间键合的其它氧原子（参见图1)。这些其它氧原子中的一个 或多个可为羟基基团的一部分，这是当本发明的RNA复合物的羟甲基取代的核苷酸中的一 个或多个位于RNA链的3' -或5' -末端时的情形。当本发明的RNA复合物的羟甲基取代的 核苷酸中的一个位于RNA链的3' -末端和/或5' -末端时，该单体的轻基基团可被磷酸化， 如对任何位于末端的天然RNA单体的情形一样。向本发明的羟甲基取代的核苷酸连接核碱 基如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或任何其它已知的天然或合 成的核碱基或核碱基类似物（图1中标为"碱基"）。
[0014] 图2 :显示羟甲基取代的单体的衍生化、官能化和共轭变体。作为实例显示羟甲基 取代的2'，3' -开环-RNA单体D的衍生化、官能化和共轭变体（参见图1)。单体F含有经 由醚键合连接的基团R。单体G含有经由硫醚键合连接的基团R。单体H含有经由酰胺键 合连接的基团R。单体I含有经由氨基键合连接的基团R。单体J含有经由哌嗪基单元连 接的基团R。通过将这种单体中的一个或若干个并入本发明的RNA复合物，可调节RNA复合 物的特性。例如可引入增加的生物稳定性、增加的RNA靶向能力或特异性递送特性、并为了 检测目的可连接荧光基团。
[0015] 图3 :两个羟甲基取代的单体（单体C和单体D)的结构，它们可为寡核苷酸或RNA 复合物的单体。
[0016] 图4 :含有"单体X"（即2'，3' -开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基 因沉默结果。结果以含有具有尿嘧啶作为核碱基的单体D(显示为W130有义链中的'X'） 的W130有义链（参见图4的核苷酸序列）获得。用于本研究的反义链的核酸序列列在该 图下部（反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。具有上标"L"的单 体代表锁核酸（例如，f表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图4按出现的顺序分别公开了 SEQ ID NO:44-52。
[0017] 图5 :含有"单体X"（即2'，3' -开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基 因沉默结果。结果以含有具有尿嘧啶作为核碱基的单体D(显示为W131有义链中的'X'） 的W131有义链（参见图5的核苷酸序列）获得。用于本研究的反义链的核酸序列列在图 4下部（反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。图5公开了 SEQ ID N0:53。
[0018] 图6 :含有"单体X"（即2'，3' -开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基 因沉默结果。这些结果以含有具有胞嘧啶（sC，从W282序列5'-末端的第一个X)、腺嘌呤 (sA，从W282序列5' -末端的第二个X)和胞嘧啶（sC，从W282序列3' -末端的最后一个X) 作为核碱基的单体D的W282有义链（参见图6的核苷酸序列）获得。用于本研究的反义 链的核酸序列列在图4下部（反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。 图 6 公开了 SEQ ID NO: 11。
[0019] 图7 :含有"单体X"（即2'，3' -开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基 因沉默结果。这些结果以W194有义链（参见图7的核苷酸序列）获得。用于本研究的反义 链的核酸序列列在图4下部（反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。 具有上标"L"的单体代表锁核酸（例如，1^表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图7公开了 SEQ ID N0:55。
[0020] 图8 :含有"单体X"（即2'，3' -开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基 因沉默结果。这些结果以W181有义链（参见图8的核苷酸序列）获得。用于本研究的反义 链的核酸序列列在图4下部（反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。 具有上标"L"的单体代表锁核酸（例如，1^表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图8公开了 SEQ ID N0:56。
[0021] 图9 :含有"单体X"（即2'，3' -开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基 因沉默结果。这些结果以含有具有尿嘧啶作为核碱基的单体D (显示为W129有义链中的 'X'）的W129有义链（参见图9的核苷酸序列）获得。本研究中包括的反义链列在图4下 部（反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。具有上标"L"的单体代表 锁核酸（例如，T l表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图9公开了 SEQ ID NO: 57。

【具体实施方式】
[0022] 在本发明一方面描述的具体特征也适用于本发明的其它方面。例如，在适当时，关 于第一方面的RNA复合物描述的特征也适用于第九方面的寡核苷酸和第十方面的RNA双链 体。
[0023] 第一方面，RNA复合物
[0024] siRNA双链体或单链RNA形式的RNA复合物可介导细胞中对靶核酸的各种修饰。 这个过程中，复合物的反义链作为向导，因为反义链可杂交于具有与该反义链互补的序列 段的靶核酸。
[0025] 靶向靶核酸之前，反义链通常被并入RNA引导的蛋白复合物（RGPC)，这可对靶核 酸起作用。RNA引导的蛋白复合物的一个实例是RNA诱导的沉默复合物（RISC)。认为存在 其它这种RGPC且本发明的RNA复合物将也有益处，当与这些其它RGPC -起使用或甚至不 与任何RGPC相互作用时。
[0026] 本发明的一个目的是使RNA复合物对生物介质（血清、体内、细胞培养物中）中的 溶核降解稳定。
[0027] 本发明的另一个目的是改善双链RNA复合物的基因沉默效应。该改善可例如涉及 增加的效力、减少的脱靶效应、减少的免疫刺激、增加的储存稳定性、在生物介质如血清等 中增加的稳定性、增加的作用持续时间和改善的药代动力学特征，所有这些均是相对于天 然未修饰的RNA复合物而言。
[0028] 本发明的又另一个目的是改善单链RNA寡核苷酸的基因沉默效应。该改善可例如 涉及增加的效力、减少的脱靶效应、减少的免疫刺激、增加的储存稳定性、在生物介质如血 清等中增加的稳定性、增加的作用持续时间和改善的药代动力学特征，所有这些均是相对 于天然未修饰的RNA复合物而言。
[0029] 本发明的一个目的是确保只有本发明SiRNA复合物的反义链而不是信使链将介 导对靶核酸的修饰。这一目的的实现将提供具有较少脱靶效应的RNA复合物。
[0030] 本发明的另一个目的是确保RNA复合物在生物介质中的足够的稳定性。因此一个 目的是提供相对于未修饰的RNA复合物，在细胞培养物中或体内展示增强的基因调节功能 如基因沉默效应的RNA复合物。
[0031] 本发明的基本理念是将一个或多个羟甲基取代的单体并入本发明的RNA复合物。 在siRNA的情况中，这可导致优先将复合物的仅一条链并入RISC。将一个或多个羟甲基取 代的单体并入RNA复合物的一条（或多条）RNA链将改善RNA复合物在生物介质中和体内 的寿命，并因此将导致改善的生物活性，例如改善的基因调节活性。
[0032] 本发明RNA复合物的RNA链可包括天然的RNA核苷酸、已知与基因沉默活性相容 的 RNA 修饰[Nawrot 和 Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925]和羟甲基取代的 单体（图1)。磷酸二酯键合（Phosphordiester linkage)可连接单独单体，但可改为使用 修饰的键合如硫代磷酸酯键合和本领域技术人员已知的其它键合[Nawrot和Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925]。RNA复合物可包括两条链，它们一起构成包括反义链 (反义链本文中也称为引导链）和信使链（信使链本文中也称为有义链）的siRNA双链体， 但单链微RNA模拟分子在本文也被认为是本发明的RNA复合物，如例如可用于靶向微RNA 的单链反义分子。
[0033] 在本发明实施方案中，RNA复合物包括一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体（参 见图1)。依此作为一个这种实例的是无环的核苷酸单体，更优选地选自单体D-J组成的组 的无环的单体。因此，在第一方面关于羟甲基修饰的核苷酸单体所述的实施方案将适用于 关于无环的核苷酸单体的其它实施方案。
[0034] 出于多种原因，使用羟甲基修饰的核苷酸单体可为有利的。羟甲基修饰的核苷酸 单体可例如用于增加 RNA复合物的基因沉默效应，且将一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单 体并入例如RNA复合物末端诱导对溶核降解的显著稳定性。羟甲基修饰的核苷酸单体还可 用于减少siRNA复合物信使链的基因沉默效应，从而减少脱靶效应的数目。
[0035] 在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的 RNA复合物是单链RNA构建体。
[0036] 在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的 RNA复合物是能够通过作为单链反义分子抑制基因表达的单链RNA构建体。
[0037] 在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的 RNA复合物是功能上模拟微RNA的单链RNA构建体。
[0038] 在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的 RNA复合物是siRNA构建体。
[0039] 因此，在一个实施方案中，siRNA构建体的反义链包括一个或多个羟甲基修饰的核 苷酸单体。
[0040] 在另一个实施方案中，SiRNA构建体的信使链包括一个或多个羟甲基修饰的核苷 酸单体。在又另一个实施方案中，siRNA构建体的带切口的信使链的第一和第二RNA分子 各含有一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体。
[0041] 在本发明一个实施方案中，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体的数目是10。在本 发明其它实施方案中，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2 或1。
[0042] 在另一个实施方案中，反义链的所有核苷酸是羟甲基修饰的核苷酸单体。
[0043] 在优选实施方案中，反义链中所有羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置1-8,其中 位置从5'末端计数。甚至更优选地，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体存在于对应于微 RNA的所谓种子区（seed region)的位置2-7。因此，在前述区域中存在羟甲基修饰的核苷 酸单体将阻止反义链作为微RNA起作用，这减少当反义链意为作为siRNA起作用时的脱靶 效应。
[0044] 在优选实施方案中，至少一个轻甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-16之一，其 中位置从5'末端计数。甚至更优选地是，2、3、4、5或6个羟甲基修饰的核苷酸单体存在于 位置9-16,且在另一实施方案中，反义链中的羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-16的 所有位置。在一个实施方案中，轻甲基修饰的核苷酸单体仅存在于区域9-16且不存在于反 义链的其余部分。
[0045] 甚至更优选地，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-11，且优选地不 存在于寡核苷酸的其余部分。在前述区域中存在羟甲基修饰的核苷酸单体将诱导反义链作 为微RNA起作用，即确保siRNA效应将最小且微RNA效应更高。该效应可能来自于因存在 无环的羟甲基取代的单体例如单体D导致亲和力减少而向全长结合的趋势的减少。
[0046] 类似地，在本发明另一实施方案中，本发明siRNA复合物信使链中羟甲基修饰的 核苷酸单体的数目是10。在本发明其它实施方案中，本发明siRNA复合物信使链中羟甲基 修饰的核苷酸单体的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。
[0047] 在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物信使链的所有核苷酸是羟甲基修饰的 核苷酸单体。
[0048] 在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链和信使链含有一个或多个羟甲 基修饰的核苷酸单体。
[0049] -方面，本发明提供能够介导对靶核酸的核酸修饰的RNA复合物。这种RNA复合 物可例如为siRNA、微RNA或微RNA前体（前-微RNA，pre-microRNA)。
[0050] 本发明siRNA复合物的RNA复合物包括含有反义链和杂交于反义链的信使链的核 心双链区。
[0051] 本文上下文中所指的靶核酸是对复合物反义链具有显著的互补性的核酸。优选 地，互补性对若干个核苷酸的段是完全的。
[0052] 因此，在一个实施方案中，互补性对25个核苷酸的段是完全的。
[0053] 在其它实施方案中，互补性分别对24个核苷酸、23个核苷酸、22个核苷酸、21个 核苷酸、20个核苷酸、19个核苷酸、18个核苷酸、17个核苷酸、16个核苷酸、15个核苷酸、14 个核苷酸、13个核苷酸、12个核苷酸、11个核苷酸、10个核苷酸、9个核苷酸、8个核苷酸、7 个核苷酸或6个核苷酸的段是完全的。
[0054] 在一个实施方案中，互补性段包括1个错配。在其它实施方案中，互补性段分别包 括2个错配、3个错配或4个错配。1个错配是互补性段中的一个区域，其中不能形成碱基 对，例如当G面对A时。当存在更多错配时，它们可能彼此相邻或它们可在互补性段的不同 区域中间隔开。
[0055] 在优选实施方案中，本发明siRNA复合物的RNA复合物包括核心双链区，其是大致 双链的区。RNA复合物中的单链区主要与复合物的悬端相关。
[0056] 因此，在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的双链区包括1个错配。在其它实 施方案中，双链区分别包括2个错配、3个错配和4个错配。
[0057] 本文所用的术语"靶核酸"包涵将经受反义链引导的调节诸如靶向裂解或空间阻 塞（steric blockage)的任何RNA/DNA。靶RNA/DNA可例如是基因组DNA、基因组病毒RNA、 mRNA、前-mRNA或非编码RNA。
[0058] 本文所用的术语"靶核酸修饰"是指对靶核酸的任何修饰，包括影响靶核酸活性而 不影响靶核酸结构的修饰。
[0059] 本发明优选的靶核酸是mRNA。因此，在一个实施方案中，RNA复合物介导的核酸修 饰是RNA干扰（RNAi)。在优选实施方案中，RNAi介导mRNA的降解。在另一优选实施方案 中，RNAi介导mRNA的翻译抑制。在另一个实施方案中，RNAi介导mRNA的翻译抑制和降解。
[0060] 在其它优选实施方案中，靶核酸是非编码RNA，例如tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA或 rRNA〇
[0061] 在又一个实施方案中，靶核酸是基因组DNA。在这种实施方案中，优选的核酸修饰 包括DNA甲基化和DNA缺失。
[0062] 本发明RNA复合物的大小可改变而仍实现本发明的一个或多个目的。这在例如当 具体目的是减少的脱靶效应时适用。
[0063] 因此，本发明siRNA复合物的核心双链区可包括选自下组的许多碱基对：10个碱 基对、11个碱基对、12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个 碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对、21个碱基对、22个碱基对、23个碱基对、24 个碱基对和25个碱基对、26个碱基对、27个碱基对、28个碱基对、29个碱基对、30个碱基 对、35个碱基对、40个碱基对、42个碱基对、45个碱基对、50个碱基对、55个碱基对、60个碱 基对或62个碱基对。
[0064] 在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区包括15至40个碱基对。
[0065] 在另一优选实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区包括18-22个碱基对。
[0066] 在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区甚至长于40个碱基对，尽 管知道在一些细胞引入较长双链RNA复合物可诱导干扰素依赖性非特异性应答。在一个这 种实施方案中，预期复合物与RGPC接合之前被加工为较短的双链RNA复合物。RNA酶III 样酶诸如切丁酶（Dicer)可进行加工。切丁酶还加工短于40个碱基对的双链RNA，且这种 RNA复合物（称为切丁酶底物）与不经加工进入RISC的siRNA相比具有多种益处。因此在 一个实施方案中，本发明的RNA复合物是切丁酶底物。
[0067] 在另一个实施方案中，RNA复合物是单链，并且没有双链区。
[0068] 在又另一个实施方案中，RNA复合物是单链但折叠以使其含有一个或多个双链区。 这种实施方案可用于例如模拟微RNA和其功能。
[0069] 在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区短于10个碱基对且因 此包括一到九个碱基对。
[0070] 在本发明一个实施方案中，RNA复合物的核心双链区被多于两条RNA链包括。
[0071] 在本发明一个实施方案中，RNA复合物的核心双链区被三条RNA链包括。
[0072] 在本发明另一实施方案中，RNA复合物的核心双链区被四条或更多RNA链包括。
[0073] 在本发明优选实施方案中，本发明siRNA复合物包括悬端。本文上下文中所用的 悬端是指跟随双链区之后的短单链区。
[0074] 在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链包括3' -悬端。
[0075] 在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的信使链包括3' -悬端。
[0076] 在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链包括5' -悬端。
[0077] 在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的信使链包括5' -悬端。
[0078] 在优选实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链和信使链都包括3' -悬端。
[0079] 本发明siRNA复合物的悬端可为不同长度，而不干扰复合物的基本功能。因此在 一实施方案中，悬端选自长度为1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷 酸、6个核苷酸、7个核苷酸和8个核苷酸的悬端的组。
[0080] 本发明siRNA复合物的最优选的悬端是长度分别为1、2和3个核苷酸的悬端。
[0081] 在一个实施方案中，本发明SiRNA复合物的反义链的悬端具有与信使链悬端相同 的长度。
[0082] 在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链的悬端不具有与信使链悬端 相同的长度。
[0083] 在本发明siRNA复合物的又另一实施方案中，RNA复合物包括至少一个平端。"平 端"是指双链核酸不具有任何突出的核苷酸的末端，即双链核酸的两条链在相同位置终止。
[0084] 在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物在两个末端均是平端的。
[0085] 本发明的优选RNA复合物总体结构上类似于切丁酶加工较长的双链RNA复合物的 产物。在另一个实施方案中，本发明的RNA复合物是如上述的切丁酶底物。
[0086] 本发明的其它优选的RNA复合物是其中核心双链区包括18-22个碱基对，且其中 反义链和信使链各包括1-3个核苷酸的3' -悬端的复合物。
[0087] 本发明RNA复合物的反义链可具有不同长度，而不干扰复合物的功能。因此在 优选实施方案中，反义链分别是 8-mer、9_mer、l〇-mer、ll-mer、12-mer、13-mer、14-mer、 15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、2〇-mer、21-mer、22-mer、23-mer、24-mer、25-mer、 26-mer、27-mer、28-mer、29-mer、30-mer、31-mer、32-mer、33-mer、34-mer、35-mer、36-mer、 37-mer、38-mer、39-mer、40-mer、41-mer、42-mer、43-mer、44-mer、45-mer、46-mer、47-mer、 48-mer、49-mer、5〇-mer、51-mer、52-mer、53-mer、54-mer、55-mer、56-mer、57-mer、58-mer、 59-mer、6〇-mer、61-mer或62-mer。应理解，例如19-mer是19个单体即19个核苷酸的反 义链。
[0088] 在另一优选实施方案中，RNA复合物的反义链选自下组反义链：15-mer、16-mer、 17-mer、18-mer、19-mer、2〇-mer、21-mer、22-mer 和 23-mer。在一实施方案中，本发明 siRNA 复合物的信使链是不连续的。在本发明siRNA复合物的一实施方案中，信使链包括若干个 分开的RNA分子。RNA分子的数目可为1、2、3、4、5或6。
[0089] 在一个实施方案中，本发明siRNA复合物信使链的单独RNA分子的长度是多于4 个单体。在其它实施方案中，信使链的单独RNA分子的长度分别是多于5个单体、6个单体、 7个单体、8个单体、9个单体、10个单体、11个单体和12个单体。
[0090] 在其它实施方案中，本发明siRNA复合物信使链的单独RNA分子的长度分别是低 于5个单体、6个单体、7个单体、8个单体、9个单体、10个单体、11个单体和12个单体。
[0091] 在本发明一个实施方案中，本发明SiRNA复合物的不连续的信使链包括第一和第 二RNA分子，它们一起形成不连续的信使链，其中第一 RNA分子杂交于反义链的下游部分， 而第二RNA分子杂交于反义链的上游部分。
[0092] 在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链是不连续的。反义链的优选的 不连续性与信使链的优选的不连续性相同。
[0093] 本发明siRNA复合物的一条链的不连续性可以是切口。切口应理解为双链核酸的 一条链中因缺少磷酸二酯键但双链核酸却没有缺少核苷酸而导致的不连续性。因此，面对 切口的碱基仍将杂交于带切口的链上的碱基。
[0094] 本发明siRNA复合物的一条链的另一种不连续性是可选的切口，这理解为双链核 酸的一条链中因糖-磷酸酯主链上缺少除了磷酸二酯键以外的一个键或多于一个键但双 链核酸却没有缺少核碱基而导致的不连续性。因此，面对切口的碱基仍可杂交于带切口的 链上的喊基。
[0095] 当本发明RNA复合物的RNA链可被描述为具有其中双链核酸中缺少至少一个核苷 酸或核苷或核碱基的不连续性时，缺口用作命名。
[0096] 优选地，RNA复合物的5' -末端是磷酸化的或可用于磷酸化。可用于磷酸化是指 5' -羟基基团还未被例如通过直接共轭或通过与接近5' -羟基基团的其它基团的其它共轭 封闭，这种封闭将阻止5' -羟基基团被磷酸化。
[0097] 因此在本发明优选实施方案中，RNA复合物的RNA分子包括5'-末端磷酸酯和 3'-羟基基团。
[0098] 在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的第二RNA分子包括5' -末端磷酸酯 和3'-羟基基团。
[0099] 在又另一个实施方案中，反义链包括5' -末端磷酸酯和3' -羟基基团。
[0100] 在本发明一些实施方案中，RNA复合物包括轻甲基修饰的核苷酸以外的核苷酸类 似物是优选的。这种羟甲基修饰的核苷酸以外的核苷酸类似物以下称为"另外修饰的核苷 酸"。
[0101] 出于多种原因，另外修饰的核苷酸的使用可为有利的。它们可例如用于增加本发 明siRNA复合物的核心双链区的解链温度。
[0102] 另外修饰的核苷酸的使用可有利于增加反义链和靶核酸之间形成的双链结构的 解链温度。
[0103] 因此在一个实施方案中，反义链包括另外修饰的核苷酸。
[0104] 在另一个实施方案中，本发明SiRNA复合物的信使链包括另外修饰的核苷酸。
[0105] 在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的信使链的第一和第二RNA分子各 含有另外修饰的核苷酸。
[0106] 在本发明一个实施方案中，RNA复合物中另外修饰的核苷酸的数目是10。在本发 明其它实施方案中，RNA复合物中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。
[0107] 在本发明一个实施方案中，反义链中另外修饰的核苷酸的数目是10。在本发明其 它实施方案中，反义链中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。
[0108] 在另一个实施方案中，反义链的所有核苷酸是另外修饰的核苷酸或是另外修饰的 核苷酸与羟甲基取代的核苷酸的组合。
[0109] 类似地，在本发明另一实施方案中，本发明SiRNA复合物信使链中核苷酸类似物 的数目是10。在本发明其它实施方案中，信使链中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、 4、3、2 或 1。
[0110] 在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物信使链的所有核苷酸是核苷酸类似物 或是另外修饰的核苷酸与羟甲基取代的核苷酸的组合。
[0111] 在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链和信使链都含有另外修饰的核 苷酸。
[0112] 在一个实施方案中，RNA复合物的另外修饰的核苷酸是相同的，即它们例如都是 LNA或都是2' -Ο-Me-RNA。在另一个实施方案中，各种不同的另外修饰的核苷酸用于同一 RNA复合物中。
[0113] 在一个实施方案中，RNA复合物包括硫代磷酸酯键（或称为硫代磷酸酯键合， phosphorothioate linkage)〇
[0114] 在另一个实施方案中，RNA复合物包括天然磷酸二酯（phosphordiester)和硫代 磷酸酯键合的混合物。
[0115] 本发明的优选的核苷酸类似物是选自下组的核苷酸类似物：2' -0-烷基-RNA单 体、2' -氨基-DNA单体、2' -氟-DNA单体、LNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、DNA 单体、PNA单体和INA单体，但还可使用其它单体[Nawrot和Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925]。
[0116] 在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基被共轭基团官能 化。共轭基团是本领域技术人员已知的改变、扩大或改善本发明RNA复合物的特性的基团。 这种基团可用于调节细胞分布、器官分布、组织分布、双链体解链温度、靶亲和力、生物稳定 性、杂交信号转导等。
[0117] 在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基被共轭的基团与羟 甲基取代基的亚甲基基团之间的醚键合官能化。参见图2(单体F)。
[0118] 在一实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体 的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为硫醚官能度。参见图2 (单体G)。
[0119] 在另一实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单 体的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为巯甲基官能度。参见图2(单体G， R = H)。使用本领域技术人员已知的方法，该巯基官能度在RNA合成期间被适当地保护，例 如作为其乙酰基衍生物。
[0120] 在一实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体 的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为胺官能度。参见图2 (单体I，R = H)。 使用本领域技术人员已知的方法，该胺官能度在RNA合成期间被适当地保护，例如作为其 三氟乙酰基或Fmoc衍生物。
[0121] 在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基作为柄（handle) 起作用以连接酰胺-连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转变， 例如如上所述的，以及使用本领域技术人员已知的方法通过例如共轭基团经由酰胺键形成 的该氨基基团的进一步衍生化。使用本领域技术人员已知的方法，这可发生在RNA合成之 前或RNA合成之后（图2,单体H)。
[0122] 在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基作为柄起作用以连 接氨基-连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转变，例如如上所 述的，以及使用本领域技术人员已知的方法通过例如共轭基团经由胺键形成的该氨基基团 的进一步衍生化。使用本领域技术人员已知的方法，这可发生在RNA合成之前或RNA合成 之后（图2,单体I)。
[0123] 在另一实施方案中，用于共轭的胺基团是氨基基团、哌嗪基基团或二氨基烷基基 团。这种单体称为胺-衍生化的单体。这些基团各自可被进一步衍生化或共轭（图2,单体 J)。
[0124] 在一个实施方案中，与天然RNA复合物相比，本发明RNA复合物具有减少的脱靶效 应。
[0125] 在一优选实施方案中，RNA复合物在反义链中具有至少一个本发明的羟甲基取代 的单体。
[0126] 在另一优选实施方案中，RNA复合物具有至少一个并入或围绕反义链的所谓种子 区的本发明的羟甲基取代的单体，即该单体在从反义链5' -末端的第1-12号位置的至少一 个中。
[0127] 在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有至少一个从反义链5' -末端的第2-10 号位置的至少一个中并入的本发明的羟甲基取代的单体。
[0128] 在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5' -末端的第3-8号位 置之一中并入的本发明的羟甲基取代的单体。
[0129] 在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5' -末端的第7号或第8 号位置之一中并入的本发明的羟甲基取代的单体。
[0130] 在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5'-末端的第7号位置 中并入的本发明的羟甲基取代的单体。
[0131] 在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5' -末端的第9-16号位 置中并入的本发明的羟甲基取代的单体。
[0132] 在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5' -末端的第9-11号位 置中并入的本发明的羟甲基取代的单体。
[0133] 在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链'-末端的第9-10号位 置中并入的本发明的羟甲基取代的单体。
[0134] 在另一个实施方案中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比产生减少的免 疫应答。
[0135] 在更另一个实施方案中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比具有延长的 效应。
[0136] 在又另一个实施方案中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比具有增加的 效应。因此在优选实施方案中，RNA复合物比天然RNA复合物更有效地介导RNAi，例如通过 靶mRNA的更有效地降解或通过靶mRNA的更有效地翻译抑制。
[0137] 在又另一个实施方案中，本发明的RNA复合物有效地递送于人类或动物的特定器 官或组织。
[0138] 在又另一实施方案中，本发明的RNA复合物能够有效地穿透细胞膜。
[0139] 在又另一实施方案中，本发明的RNA复合物能够比（that)天然RNA复合物更有效 地穿透细胞膜。
[0140] 在一个实施方案中，本发明的RNA复合物能够结合血浆蛋白，这增加 RNA复合物在 人体中的滞留。
[0141] 第二方面，RNA复合物的制备
[0142] 本发明的另一方面是制备本发明双链RNA复合物的方法，所述方法包括在其中形 成包含核心双链区的RNA复合物的条件下温育反义链与信使链，所述RNA复合物能够介导 相应细胞RNA的RNA干扰。
[0143] 在该方面的替代实施方案中，RNA复合物被本发明的RNA双链体代替（第十方 面）。
[0144] 第三方面，介导核酸修饰的方法
[0145] 本发明的又另一方面是介导细胞或生物体中靶核酸的核酸修饰的方法，其包括以 下步骤：
[0146] a.在其中可发生靶核酸修饰的条件下将细胞或生物体与本发明的RNA复合物接 触，
[0147] b.从而介导靶核酸的修饰。
[0148] 在优选实施方案中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在体外进行。
[0149] 在优选实施方案中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在体内进行，即在动物、人类或 非人类动物中。
[0150] 在优选实施方案中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在细胞培养物中进行。
[0151] 在又另一个实施方案中，该方法对分离的细胞进行。
[0152] 在优选实施方案中，该方法的核酸修饰是RNA干扰，优选的是靶mRNA的降解或靶 mRNA的翻译抑制或其它类型RNA例如非编码RNA的抑制。
[0153] 在另一个实施方案中，该核酸修饰是DNA甲基化。
[0154] 在该方面的替代实施方案中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸（第九方面）或 本发明的RNA双链体（第十方面）代替。
[0155] 第四方面，检查基因功能的方法
[0156] 本发明的另一方面是检查细胞或生物体中基因功能的方法，其包括：
[0157] a.将对应于所述基因的本发明的RNA复合物引入细胞或生物体，从而产生测试细 胞或测试生物体，
[0158] b.将测试细胞或测试生物体保持在其中可发生靶核酸修饰的条件下，
[0159] c.观察测试细胞或生物体在步骤b中产生的表型并任选地将观察到的表型与合 适的对照细胞或对照生物体的表型比较，从而提供关于基因功能的信息。
[0160] 例如使用所附实施例中列出的转染，本发明的RNA复合物可引入细胞。
[0161] 可观察生物体或细胞的表型，例如使用蛋白组学来评价蛋白水平或使用微阵列来 评价RNA水平。还可使用更精细的表型，例如一种特定基因的表达。
[0162] 所获得的关于基因功能的信息可用于确定基因产物是否是与特定疾病相关的治 疗干预的适合的靶。因此，如果证实某一基因产物在已知在例如具体亚型癌症中受影响 的某一生化途径中起作用，那么该基因产物可能是治疗前述亚型癌症的治疗干预的适合的 靶。
[0163] 在检查细胞或生物体中基因功能的方法的优选实施方案中，该方法中的核酸修饰 是RNA干扰，优选的是靶mRNA的降解或靶RNA的翻译抑制。
[0164] 在另一个实施方案中，该核酸修饰是DNA甲基化。
[0165] 在检查细胞或生物体中基因功能的方法的优选实施方案中，该方法在细胞培养物 中、体外或体内进行。
[0166] 在又另一个实施方案中，该方法对分离的细胞进行。
[0167] 在该方面的替代实施方案中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸（第九方面）或 本发明的RNA双链体（第十方面）代替。
[0168] 第五方面，评价药剂的方法
[0169] 本发明的另一方面是评价一种药剂是否作用于基因产物的方法，其包括以下步 骤：
[0170] a.将对应于所述基因的本发明的RNA复合物引入细胞或生物体，从而产生测试细 胞或测试生物体，
[0171] b.将测试细胞或测试生物体保持在其中发生靶核酸修饰的条件下，
[0172] c.将药剂引入测试细胞或测试生物体，
[0173] d.观察测试细胞或生物体在步骤c中产生的表型，并任选地将观察到的表型与合 适的对照细胞或对照生物体的表型比较，从而提供关于药剂是否作用于基因产物的信息。 [0174] 步骤d中优选的对照是不具有步骤a中引入的RNA复合物的测试细胞或测试生物 体。
[0175] 在评价药剂是否作用于基因或基因产物的方法的优选实施方案中，该方法的核酸 修饰是RNA干扰，优选的是靶RNA的降解或靶RNA的翻译抑制。在另一个实施方案中，核酸 修饰的修饰是DNA甲基化。
[0176] 在评价药剂是否作用于基因产物的方法的优选的实施方案中，该方法在细胞培养 物中、体外或体内进行。
[0177] 在又另一个实施方案中，该方法对分离的细胞进行。
[0178] 在该方面的替代实施方案中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸（第九方面）或 本发明的RNA双链体（第十方面）代替。
[0179] 第六方面，药物组合物
[0180] 本发明的又另一方面是RNA复合物和药学上可接受的稀释剂、载体或辅助剂。对 技术人员明显的是，本发明的RNA复合物可设计为靶向特定基因和基因产物。应理解的是， 该RNA复合物将靶向DNA序列或RNA序列而不是蛋白。然而，基因产物诸如蛋白的水平可 被间接影响，如果其mRNA或非编码RNA被例如RNA降解或翻译抑制所修饰。还可影响编码 该蛋白的基因的表达，例如因为DNA甲基化。
[0181] 在该方面的替代实施方案中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸（第九方面）或 本发明的RNA双链体（第十方面）代替。
[0182] 第七方面，使用药物
[0183] 因此另一方面是本发明的RNA复合物用作药物。验证治疗靶后，技术人员可设计 影响靶水平和活性的RNA复合物，因为RNA复合物的特异性专门地存在于反义链序列中。对 于具有连续信使链的天然RNA复合物，由于信使链作为引导序列起作用，因而仍存在脱靶 效应的问题。
[0184] 在该方面的替代实施方案中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸（第九方面）或 本发明的RNA双链体（第十方面）代替。
[0185] 第八方面，单体
[0186] 本发明的一个方面是适于并入本发明的羟甲基取代的单体的单体和从易于获 得的起始物料制备其的方法。本发明的羟甲基取代的单体的胸腺嘧啶-1-基衍生物 已被并入DNA链，且制备其用于自动DNA/RNA合成的亚磷酰胺结构单元的程序已被报 道[K. D. Nielsen 等人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493 ;H. Thrane 等人，Tetrahedron 1995, 51，10389 ;P. Nielsen 等人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]。
[0187] 最通常地，本发明的RNA复合物将由如本领域技术人员已知的自动寡核苷酸 合成制备。将本发明的羟甲基取代的单体并入本发明的RNA复合物遵循用于a)在 自动RNA合成仪上的RNA合成、b) RNA检查、c) RNA纯化和d) RNA分离的标准方法 [F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues (寡核苷酸和类似物），IRL Press, Oxford University Press, 1991]。轻甲基取代的RNA寡核苷酸（=RNA链）和RNA复合物可使用 亚磷酰胺衍生物，使用RNA合成的标准技术合成。
[0188] 在优选实施方案中，制备本发明的羟甲基取代的单体的亚磷酰胺衍生物的方法开 始于核糖核苷，例如核糖核苷的05' -DMT保护的衍生物，对于碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶 和5-甲基胞嘧啶含有碱基保护基团，如例如，苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基、苯氧乙酰基、叔 丁基苯氧乙酰基或本领域技术人员已知的其它标准碱基保护基团。
[0189] 在优选实施方案中，本发明包括制备具有2'，3' -断开的碳-碳键（核糖核苷命名 法）的适于并入单体D和E的单体结构单元的方法。
[0190] 在其它优选实施方案中，本发明包括制备具有2'，3' -断开的碳-碳键、适于并入 单体如F-J且另外在例如其2'-碳原子（核糖核苷命名法）携带羟基基团以外的官能度或 基团的单体结构单元的方法。
[0191] 在本发明优选实施方案中，制备单体D的亚磷酰胺衍生物的方法的关键步骤 中包括2'，3'-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性02'-保护和03'-磷酸化 (phosphitylation)〇
[0192] 在优选实施方案中，以例如高碘酸钠为试剂使用氧化裂解进行2'，3' -二醇裂解。
[0193] 在另一优选实施方案中，高碘酸钠裂解后中间产物的还原被还原为相应的二醇， 以例如硼氢化钠实现。
[0194] 为了将单体D并入本发明的RNA复合物，保护2' -羟基基团（核糖核苷命名法） 是必须的。在本发明的优选实施方案中，这通过苯甲酰化进行。为了优化保护的选择性，即 02'-苯甲酰化相对于03'-苯甲酰化的量，仅使用略多于一当量的苯甲酰化试剂（苯甲酰氯 或例如苯甲酸酐（benzoyl anhydride))可为有益的。在一个优选的实施方案中，苯甲酰化 在室温以下进行。在另一有用的实施方案中，苯甲酰化在〇°C以下或甚至_50°C以下进行。
[0195] 在另一优选实施方案中，02' -保护通过乙酰化或通过使用有机合成领域技术人员 已知的酰化试剂进行酰化来完成。
[0196] 在另一优选实施方案中，02'-保护通过使用有机合成领域技术人员已知的硅烷化 试剂和方法硅烷化来进行。优选的硅烷化保护基团是叔丁基二甲基甲硅烷基。
[0197] 在优选实施方案中，随后的磷酸化（phosphitylation)反应使用所谓"PC1"试剂 [PCI(OCH 2CH2Cn) (NQPr)2)]或所谓"bis-amidite"试剂[P(OCH2CH2CN) (N(iPr)2)2]进行。
[0198] 在制备单体D的亚磷酰胺衍生物的方法的优选实施方案中，起始物料是核糖核 苷，例如核糖核苷的05' -DMT保护的衍生物，对于碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和5-甲基胞 嘧啶含有碱基保护基团如例如苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基、苯氧乙酰基、叔丁基苯氧乙酰 基或本领域技术人员已知的其它标准碱基保护基团。
[0199] 在另一优选实施方案中，本发明提供制备单体E的亚磷酰胺衍生物的方法。
[0200] 在本发明优选实施方案中，制备单体E亚磷酰胺衍生物的方法的关键步骤 中包括2'，3'-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性03'-保护和02'-磷酸化 (phosphitylation)。03' -保护可例如通过娃烧化或酰化进行，或通过组合如首先02' -苯 甲酰化、然后03' -硅烷化、之后02' -脱苯甲酰化进行。如本领域技术人员清楚的，还可施 加其它保护基团。
[0201] 在另外优选实施方案中，制备具有2'，3'-断开的碳-碳键、适于并入单体 如F-J且另外在其2'-碳原子（核糖核苷命名法）携带羟基基团以外的官能度的单体 结构单元的方法的关键步骤中包括开始于核糖核苷（例如05'-DMT保护的核糖核苷 (ribonucleosde))2'，3' -二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性03' -保护、2' -轻基基 团的转化、03' -脱保护和03' -磷酸化（phosphitylation)。03' -保护可例如通过娃烧化或 酰化进行，或如首先02' -苯甲酰化、然后03' -硅烷化、之后02' -脱苯甲酰化的组合进行。 如本领域技术人员清楚的，还可施加其它保护基团。转化2'-羟基基团为另一基团如氨基、 酰化氨基、烃化氨基、二烃化氨基、氨甲酰化氨基、哌嗪基、酰化哌嗪基、烃化哌嗪基、氨甲酰 化哌嗪基、巯基、酰化巯基、烃化巯基、二硫化物、酰化羟基、烃化羟基、氨甲酰化羟基等，或 通过这些基团的取代和/或保护的衍生物，可使用有机合成领域技术人员已知的方法和程 序进行。这种方法和程序包括对2' -羟基基团的活化衍生物的取代反应或酰化或氨甲酰化 反应。这种方法和程序还包括02'-烃化反应和并入其它C2'连接基团如氨基或巯基后的 烃化反应。又另一种可能性是2' -羟基基团氧化获得醛官能度，其可通过例如与亲核试剂 反应进一步修饰，或获得羧基官能度，其可在羧基官能度转化为活化的衍生物如活化酯后 通过例如与亲核试剂反应进一步修饰。
[0202] 在本发明另一实施方案中，制备适于并入单体如F-J、但为"倒置的"（如单体D和 E可认为是"倒置的"）以使02'原子被磷酸化（phosphitylated)且3'-羟基基团转变为 另一基团以使C3'原子连接于羟基基团以外的官能度的单体结构单元的方法的关键步骤 中包括开始于核糖核苷（例如05' -DMT保护的核糖核苷（ribonucleosde))2'，3' -二醇裂 解、所得的中间产物的还原、选择性02' -保护、3' -羟基基团的转化、02' -脱保护和02' -磷 酸化（phosphitylation)。02'-保护可例如通过娃烧化或酰化、或两者的组合来进行。如 本领域技术人员清楚的，还可施加其它保护基团。3'-羟基基团转化为另一基团如氨基、酰 化氨基、烃化氨基、二烃化氨基、氨甲酰化氨基、哌嗪基、酰化哌嗪基、烃化哌嗪基、氨甲酰化 哌嗪基、巯基、酰化巯基、烃化巯基、二硫化物、酰化羟基、烃化羟基、氨甲酰化羟基等，或通 过这些基团的取代和/或保护的衍生物，可使用有机合成领域技术人员已知的方法和程序 进行。这种方法和程序包括对3' -羟基基团的活化衍生物的取代反应或酰化或氨甲酰化反 应。这种方法和程序还包括03'-烃化反应和并入其它C3'连接基团如氨基或巯基后的烃 化反应。又另一种可能性是3' -羟基基团氧化获得醛官能度，其可通过例如与亲核试剂反 应进一步修饰，或获得羧基官能度，其可在羧基官能度转化为活化的衍生物如活化酯后通 过例如与亲核试剂反应进一步修饰。
[0203] 在一个实施方案中，2' -C-哌嗪基衍生物通过转化2' -羟基基团为离去基团（例 如甲磺酸酯衍生物）、随后与大量过量哌嗪反应而制备。这例如可作为朝向结构Amidite J 的亚磷酰胺（参见下图）合成的步骤进行。
[0204] 在又另一个实施方案中，本发明包括制备适于并入本发明的羟甲基取代的单体、 在C1'原子（核糖核苷命名法）携带不同于天然核碱基的基团或官能度的单体结构单元的 方法。可含有保护基团的这种基团或官能度包括例如天然核碱基以外的芘、茈、荧光团、氢、 烧基、反应性基团和杂环。
[0205] 在又另一个实施方案中，本发明包括制备适于并入本发明的羟甲基取代的单体的 单体结构单元的方法，该羟甲基取代的单体构造为H-膦酸酯衍生物而不是亚磷酰胺衍生 物。
[0206] 以下显示本发明关于亚磷酰胺（=amidite)结构单元的一些优选的实施方案的 结构实例（DMT = 4, 4' -二甲氧基三苯甲基；碱基=天然核碱基；CEtO =氰基乙氧基）：
[0207]

【权利要求】
1. 一种包含无环的2' -3' -开环-核苷酸单体的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是具有第 一和第二RNA链的RNA双链体，并且其中所述无环单体是单体D
其中喊基是核喊基。
2. 如权利要求1所述的寡核苷酸，每条链包括15至40个核苷酸和无环单体。
3. 如权利要求1所述的寡核苷酸，每条链包括1至5个无环单体。
4. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其进一步包括选自2' -0-烷基-RNA单体、2' -氨 基-DNA单体、2' -氟-DNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA 单体、DNA单体和INA单体的核苷酸类似物。
5. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其进一步包括一个或多个2' -0-烧基-RNA核苷酸类 似物。
6. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其进一步包括硫代磷酸酯键或硼代磷酸酯键。
7. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够介导与部分寡核苷酸互补的 靶核苷酸序列的RISC依赖的翻译阻遏或降解。
8. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其包括14至26个碱基对。
9. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一个悬端。
10. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其包括1至14个核苷酸的悬端。
11. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一个3' -悬端。
12. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一个1至14个核苷酸的3' -悬端。
13. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一个平端。
14. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其包括与靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。
15. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其与具有天然RNA单体而不是无环单体的相同寡核 苷酸相比具有减少的脱靶效应。
16. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与具有天然RNA单体而不是无环 单体的相同寡核苷酸相比具有增加的或延长的基因沉默的效力。
17. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与具有天然RNA单体而不是无环 单体的相同寡核苷酸相比具有改善的对酶促降解的稳定性。
18. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与具有天然RNA单体而不是无环 单体的相同寡核苷酸相比具有减少的免疫刺激。
19. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其中链中的一条是不连续的信使链。
20. -种包括无环的2' -3' -开环-核苷酸单体的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是微 RNA，并且其中所述无环单体是单体D 其中喊基是核喊基。
21. -种包括无环的2' -3' -开环-核苷酸单体的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是靶向 微RNA的单链RNA，并且其中所述无环单体是单体D 其中喊基是核喊基。
22. -种包括无环的2' -3' -开环-核苷酸单体的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是结合 空间阻塞RNA的RNA，并且其中所述无环单体是单体D
其中喊基是核喊基。
【文档编号】C12N15/113GK104480112SQ201410554369
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2008年5月21日 优先权日:2007年5月22日
【发明者】耶斯佩·温格尔 申请人:阿克丘勒斯治疗公司