专利名称：一种重组人肝细胞生长因子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的生产工艺。该工艺是通过基因工程和蛋白质工程技术相结合，从而实现原核表达体系表达产生真核基因产物的一种新方法，应用该工艺可以大量制备rhHGF。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术路线和步骤进行一、技术路线(图1)1.hHGFα、hHGFβ基因的获取；2.pBV220-hHGFα、pBV220-hHGFβ重组质粒的构建；3.hHGFα、hHGFβ重组质粒分别转化到不同的大肠杆菌内；4.hHGFα和hHGFβ蛋白质的表达和分离纯化；5.异源蛋白体外共复性和活性测定。
二、步骤1.hHGFα和hHGFβ原核表达体系的构建1).HGF基因结构分析从GENBANK获取HGFcDNA全序列，其序列为1 actgactccg aacaggattc tttcacccag gcatctcctc cagagggatccgccagcccg61 tccagcagca ccgattgggt gaccaaactc ctgccagccc tgctgctgcagcatgtcctc121 ctgcatctcc tcctgctccc catcgccatc ccctatgcag agggacaaaggaaaagaaga181 aatacaattc atgaattcaa aaaatcagca aagactaccc taatcaaaatagatccagca241 ctgaagataa aaaccaaaaa agtgaatact gcagaccaat gtgctaatagatgtactagg301 aataaaggac ttccattcac ttgcaaggct tttgtttttg ataaagcaagaaaacaatgc361 ctctggttcc ccttcaatag catgtcaagt ggagtgaaaa aagaatttggccatgaattt421 gacctctatg aaaacaaaga ctacattaga aactgcatca ttggtaaaggacgcagctac481 aagggaacag tatctatcac taagagtggc atcaaatgtc agccctggagttccatgata541 ccacacgaac acagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctacaggaaaactac601 tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaatccagaggta661 cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgacctgcaatggg721 gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca agatttgtcagcgctgggat781 catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat atcccgacaagggctttgat841 gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat ggtgctatactcttgaccct901 cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg acaatactatgaatgacact961 gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggctacaggggcact1021 gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg attctcagtatcctcacgag1081 catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac gagaaaattactgccgaaat1141 ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccgagttggctac1201 tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcgtgggaatggc1261 aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttcaatgtgggac1321 aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaagtaagctgaat1381 gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgctacacgggaaat1441 ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgataccacacctaca1501 atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaattgcgagttgta1561 aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta gtttgagatacagaaataaa1621 catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc ttactgcacgacagtgtttc1681 ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgtccacggaaga1741 ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc tggtatatggccctgaagga1801 tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattttgttagtacg1861 attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcagtgtttatggc1921 tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac gagtggcacatctctatata1981 atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaatgagtctgaa2041 atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg agggggattatggtggccca2101 cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcctggtcgtgga2161 tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag catattatgcaaaatggata2221 cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatagc tgaagtaagtgtgtctgaag2281 cacccaccaa tacaactgtc ttttac2).hHGFα原核表达体系的构建a.根据真核基因在原核细胞中表达的要求和hHGFα基因序列分析结果，设计合成一对引物，上游引物是5’-ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA-3’下游引物是5’-ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTCTTTCG-3’上游引物长度为27个核苷酸，含有EcoRI识别位点、起始密码ATG及与编码HGF的N末端基因相同的18个核苷酸；下游引物长度为29个核苷酸，含有终止密码子、BamHI识别位点及与编码HGF的C末端基因互补的20个核苷酸。以pRC/CMV-HGF(由美国著名科学家闫占清馈赠)为模板，通过聚合酶链反应(PCR)，扩增得到了去除N端54肽前体序列(包括信号肽在内)，并加上起始密码ATG、串联终止密码TAA、TGA及适于克隆和表达的酶切位点EcoRI和BamHI的hHGFαcDNA(1.34bp)。
b.将hHGFαcDNA基因片段以Xho1切为386bp、954bp两个片段，分别以EcoRI/XhoI、XhoI/BamHI重组到克隆载体pBSKS(全长2.96kb，由本室保存)上，形成pBSKS-HGF386、pBSKS-HGF954两个亚克隆重组质粒(图2)；将EcoRI/XhoI、XhoI/BamHI从pBSKS-HGF386、pBSKS-HGF954中酶切回收的EcoRI-XhoI(386bp)、XhoI-BamHI(954bp)两个片段与表达载体pBV220连接克隆，经筛选、酶切分析、克隆片段全序列测定证实，正确构建了pBV220-hHGFα重组表达质粒(图3)。
hHGFα的基因序列为1 actgactccg aacaggattc tttcacccag gcatctcctc cagagggatccgccagcccg61 tccagcagca ccatgtgggt gaccaaactc ctgccagccc tgctgctgcagcatgtcctc121 ctgcatctcc tcctgctccc catcgccatc ccctatgcag agggacaaaggaaaagaaga181 aatacaattc atgaattcaa aaaatcagca aagactaccc taatcaaaataga tccagca241 ctgaagataa aaaccaaaaa agtgaatact gcagaccaat gtgctaatagatgtactagg301 aataaaggac ttccattcac ttgcaaggct tttgtttttg ataaagcaagaaaacaatgc361 ctctggttcc ccttcaatag catgtcaagt ggagtgaaaa aagaatttggccatgaattt421 gacctctatg aaaacaaaga ctacattaga aactgcatca ttggtaaaggacgcagctac481 aagggaacag tatctatcac taagagtggc atcaaatgtc agccctggagttccatgata541 ccacacgaac acagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctacaggaaaactac601 tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaatccagaggta661 cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgacctgcaatggg721 gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca agatttgtcagcgctgggat781 catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat atcccgacaagggctttgat841 gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat ggtgctatactcttgaccct901 cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg acaatactatgaatgacact961 gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggctacaggggcact1021 gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg attctcagtatcctcacgag1081 catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac gagaaaattactgccgaaat1141 ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccgagt tggctac1201 tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcgtgggaatggc1261 aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttcaatgtgggac1321 aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaagtaagctgaat1381 gagaattact gccgaAatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgctacacgggaaat1441 ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgataccacacctaca1501 atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaac3).hHGFβ原核表达体系的构建a.根据真核基因在原核细胞中表达的要求和hHGFβ基因序列分析结果，设计合成一对引物，上游引物是5’-CATACCCGGGATGGTTGTAAATGGGATTC-3’
下游引物是5’-ACATCTGCAGCTTCAGCTATGACTGT-3’上游引物含有SmaI识别位点和起始密码子，下游引物含有PstI识别位点和终止密码子。以pRC/CMV-HGF为模板，经过PCR后，扩增得到了含有翻译起始密码子ATG和SD序列及SD序列间隔，加上SmaI和PstI酶切位点的hHGFβcDNA(700bp)。
b.利用SmaI和PstI的酶切位点将hHGFβcDNA定向克隆到pBV220表达载体上，经过筛选、限制性内切酶酶切鉴定和hHGFβ基因可表达全序列测序后，正确构建了pBV220-hHGFβ(图4)。HGF-β的基因序列为1 gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt gagatacaga61 aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag121 tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac181 ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt atatggccct241 gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga tgattttgtt301 agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag ttgcagtgtt361 tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt ggcacatctc421 tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac tctgaatgag481 tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg ggattatggt541 ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt601 cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata ttatgcaaaa661 tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag1.hHGFα和hHGFβ蛋白质的表达和分离纯化1)hHGFα蛋白质的表达将构建正确的pBV220-hHGFα重组表达质粒用氯化钙等转化方法转化到大肠杆菌DH5α(来自中国预防医学科学院病毒研究所)中。10L发酵罐装料7L，菌种接种量2-4％(V/V)，采用改良的M9+LB培养基(以M9+LB培养基为基础，经正交实验设计出的最适细菌生长和蛋白表达的培养基)，用温控诱导表达的方法，培养温度30℃，诱导温度42℃，让阳性克隆菌株DH5α-hHGFα表达人肝细胞生长因子重链蛋白，SDS-PAGE(10％)分析表达产物。
2)HGFβ蛋白质的表达将正确构建的pBV220-hHGFβ转化到大肠杆菌pLysS菌株(来自中国预防医学科学院病毒研究所)内，用1)中a的方法，让pLysS-hHGFβ表达人肝细胞生长因子轻链蛋白，SDS-PAGE(12％)分析表达产物。
3)hHGFα和hHGFβ蛋白质的分离纯化人肝细胞生长因子hHGFα和hHGFβ在大肠杆菌中以包涵体的形式存在，其分离纯化大致上采取先分离包涵体，将菌体悬于Tris缓冲液中，加入溶菌酶，消化，冰浴超声破菌，加入脱氧胆酸钠，离心取沉淀得到包涵体，将沉淀充分重悬于变性液尿素缓冲液中，静置，离心弃上清。用尿素的缓冲液洗涤沉淀，直到上清无明显变化为止。最后，将包涵体沉淀溶于含尿素缓冲液中，离心，回收包涵体溶解液上清，再用凝胶过滤层析法做进一步纯化，分部收集洗脱峰，SDS-PAGE鉴定目的蛋白所在峰。
3.异源蛋白体外共复性及活性测定1).人肝细胞生长因子重链和轻链蛋白的体外共复性由于包涵体蛋白的空间结构错误，没有生物学活性，必须为其提供一定的氧化还原环境，让两种蛋白质之间形成正确的二硫键和空间结构。本发明采用梯度稀释的方法，将目的峰中蛋白质浓度调至1mg/mL，然后调整rhHGF-α蛋白与用类似方法分离纯化的rhHGF-β蛋白的摩尔比为1∶1，每隔20min用含有1～3mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)和0.1～0.3mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)的20～50mmol/L Tris-Cl，pH 8.0的复性液，将尿素浓度逐步降低到1mol/L，然后在20～50mmol/L Tris-Cl、pH 8.0的透析液中4℃充分透析。将透析后的共复性样品经过离子交换层析纯化。
2).生物活性测定a.分离的肝细胞悬浮于含10％小牛血清、青霉素(104U/L)、链霉素(100mg/L)、胰岛素(10-8mol/L)的DMEM中，按每孔细胞数2×104接种于96孔培养板，置于37℃，5％CO2培养箱中。
b.肝细胞在培养箱中培养6小时后换培养液，继续培养24小时。
c.rhHGF样品准备复性的HGF样品根据测算用DMEM稀释成蛋白浓度为200ng/ml，与培养液混合后倍比稀释成100ng/ml、50ng/ml。
d.将肝细胞培养液更换成无血清、含不同浓度rhHGF样品的DMEM培养液，阴性对照孔不加HGF样品。细胞在5％CO2，37℃饱和湿度环境下培养48小时。
e.向培养的肝细胞中加入5mg/ml MTT(四甲基偶氮唑盐)显色液10μ1，继续培养6小时，然后弃去培养液，再加入100μl DMSO终止反应并溶解细胞内蓝色结晶，用空白孔(不含肝细胞及HGF样品的培养液)调零，570nm波长比色，得出在不同复性HGF浓度下刺激肝细胞生长的OD值。
f.以复性的HGF样品的蛋白浓度为横坐标，OD570nm比色值为纵坐标，作二者之间关系变化的直方图(图5)。
分 组 OD570nm阴性对照组 0.29±0.0550ng/ml0.72±0.07100ng/ml 0.91±0.10200ng/ml 0.98±0.03重组人肝细胞生长因子(rhHGF)是一种能有效促进肝细胞损伤后有序再生的重要细胞因子。它在肝炎、肝硬化、肝癌等肝损伤的修复中起到不可替代的作用。目前市场尚无此类作用药物。近年来，国内外许多科研机构都致力于HGF的开发和研制，但由于受到来源和相关技术的限制，一直未能投入生产。本发明的优点在于用基因工程的方法并首次将蛋白质工程技术和基因工程技术结合应用于rhHGF生产，建立了一条体外大量获得rhHGF的途径，对于治疗多种原因引起的肝细胞坏死、肝硬化、肝癌以及其它损伤具有重要的临床价值和应用前景，对于研究肝细胞分化和增殖调控、肝癌等肿瘤细胞的发生发展机制有着重要意义，同时为进一步研究和开发基因工程药物提供了一种新思路和新方法。
图1重组人肝细胞生长因子(rhHGF)制备技术路线图2PBSKS-HGF386、PBSKS-HGF954亚克隆质粒的构建示意3表达质粒的pBV220-hHGFα构建示意4表达质粒的pBV220-hHGFβ构建示意5用MTT法测定的复性HGF的活性图6rhHGFα凝胶过滤色谱7rhHGFβ凝胶过滤色谱图序列表<110>协和生物工程研究所有限公司<120>一种重组人肝细胞生长因子的制备方法<160>3<210>1<211>2306<212>DNA<213>人种(human)<220><221>gene<400>11 actgactccg aacaggattc tttcacccag gcatctcctc cagagggatc cgccagcccg61 tccagcagca ccgattgggt gaccaaactc ctgccagccc tgctgctgca gcatgtcctc121 ctgcatctcc tcctgctccc catcgccatc ccctatgcag agggacaaag gaaaagaaga181 aatacaattc atgaattcaa aaaatcagca aagactaccc taatcaaaat agatccagca241 ctgaagataa aaaccaaaaa agtgaatact gcagaccaat gtgctaatag atgtactagg301 aataaaggac ttccattcac ttgcaaggct tttgtttttg ataaagcaag aaaacaatgc361 ctctggttcc ccttcaatag catgtcaagt ggagtgaaaa aagaatttgg ccatgaattt421 gacctctatg aaaacaaaga ctacattaga aactgcatca ttggtaaagg acgcagctac481 aagggaacag tatctatcac taagagtggc atcaaatgtc agccctggag ttccatgata541 ccacacgaac acagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac601 tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 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权利要求
1.一种重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的制备方法，其特征在于所述方法是将基因工程技术与蛋白质工程技术相结合，对HGF基因进行转录前加工、修饰，分别构建HGF重链(α链)表达体系和HGF轻链(β链)表达体系，分别表达HGF的重链蛋白和轻链蛋白，然后利用异源蛋白体外共复性技术，制备有野生活性的HGF蛋白。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征是hHGFα原核表达体系的构建采取以下步骤A)根据真核基因在原核细胞中表达的要求和hHGF基因序列分析结果，设计合成一对引物，以HGF为模板，通过聚合酶链反应(PCR)，扩增得到相应序列并加上起始密码ATG、串联终止密码TAA、TGA及适于克隆和表达的酶切位点的hHGFαcDNA；B)将hHGFαcDNA基因片段经合适的酶切重组到原核表达克隆载体上，构建得到含hHGFα的重组质粒。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征是hHGFβ基因表达体系的构建采取以下步骤A)根据真核基因在原核细胞中表达的要求和hHGFβ基因序列分析结果，设计合成一对引物，以HGF为模板，经过PCR后，扩增得到含有翻译起始密码的ATG和SD序列及SD间隔，加上相应酶切位点的hHGFβcDNA；B)利用相应的酶切位点将hHGFβcDNA定向克隆到原核表达载体上，经过筛选、限制性内切酶切，构建得到含hHGFβ的重组质粒。
4.按照权利要求1或2所述的制备方法，其特征是hHGFα蛋白质的表达和分离纯化步骤如下A)将构建的含hHGFα重链表达质粒用氯化钙等转化法转化至大肠杆菌中，经选用最适细菌生长和蛋白表达的发酵培养基培养，经诱导表达的方法，表达人肝细胞生长因子重链蛋白hHGFα，SDS-PAGE分析表达产物；B)以包涵体形式存在于大肠杆菌中的表达菌体按一定比例重悬于Tris缓冲液中，加溶菌酶消化，超声破菌，加脱氧胆酸纳，离心取沉淀，将其重悬于尿素缓冲液中，离心弃上清，用含尿素的缓冲液II洗涤沉淀，将沉淀溶于含尿素的缓冲液，离心回收包涵体溶解液上清，用凝胶过滤层析进一步纯化，分部收集洗脱峰，SDS-PAGE鉴定目的蛋白所在峰。
5.按照权利要求1或3所述的制备方法，其特征是hHGFβ蛋白质的表达和分离纯化步骤如下A)将构建的含hHGFβ转化到大肠杆菌中，经选用最适细菌生长和蛋白表达的发酵培养基培养，用诱导表达的方法，表达人肝细胞生长因子轻链蛋白hHGFβ，SDS-PAGE分析表达产物；B)以包涵体形式存在于大肠杆菌中的hHGFβ蛋白质的分离纯化步骤如下离心收集诱导表达的菌体，加入缓冲液，搅拌，使菌体分散均匀；加蛋白酶抑制剂、溶菌酶，搅拌，加脱氧胆酸纳；超声破菌，低温高速离心，沉淀中加入Tris溶液，搅拌，低温离心，沉淀重悬于尿素缓冲液；包涵体按浓度比加入含尿素的变性液中室温作用，离心沉淀，包涵体溶解液经凝胶过滤层析纯化目的蛋白，将纯度较高的收集液合并，用于复性。
6.按照权利要求1、4或5所述的制备方法，其特征是hHGFα与hHGFβ蛋白的体外共复性是采用梯度稀释的方法，将目的峰中蛋白质调至规定浓度，然后调整hHGF-α与hHGF-β蛋白的摩尔比，间隙使用含还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)的复性液，降低尿素的浓度，在透析液中充分透析，将透析后的共复性样品经离子交换层析纯化，最终得到有野生活性的HGF。
全文摘要
重组人肝细胞生长因子(rhHGF)是一种能有效促进肝细胞损伤后有序再生的重要细胞因子,本发明涉及其制备生产工艺,它是通过基因工程技术与蛋白质工程技术相结合,对HGF基因进行转录前加工、修饰,分别构建HGF重链(α链)表达体系和HGF轻链(β链)表达体系,分别表达HGF重链蛋白和轻链蛋白,然后利用异源蛋白体外共复性技术,制备有野生活性的HGF蛋白,本发明首次将蛋白质工程技术与基因工程技术结合用于生产rhHGF,建立了一条体外大量获得rhHGF的途径。
文档编号C12N15/70GK1385533SQ0114020
公开日2002年12月18日 申请日期2001年12月5日 优先权日2001年12月5日
发明者牛勃, 向前, 解军, 常冰梅, 杨涛, 杨琦, 张悦红 申请人:协和生物工程研究所有限公司