专利名称：假单胞菌m18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物合成调控因子的基因序列，尤其是一种假单胞菌M18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列，属于基因技术领域。
背景技术：
PCA对小麦全蚀病菌(Gaeamauuomyces gramiais var.tritici，Ggt)有显著的抑制作用，Plt对终极腐霉(Pythium ultimum)引起的棉花、甜菜立枯病有很强的防治效果。M18菌株分泌两类不同的抗生素，扩大了该生防菌的抗菌谱，经离体、盆栽接种和多年的大田试验结果表明，M18对甜瓜蔓枯病和黄瓜枯萎病植物病原真菌具有显著的防治作用。Brian Nowak-Thompson和Joyce E.Loper等报道了荧光假单胞菌株Pf-5的Plt生物合成基因簇(美国微生物学会的《细菌学杂志》1999，1812166-2174)，Pf-5野生型菌株的Plt产量仅为5.3±1.2ug/ml(美国微生物学会的《应用与环境微生物学杂志》2000，662718-2725)，Plt产量较低是制约荧光假单胞菌株Pf-5的生物防治能力及其广泛应用的重要因子。本专利所涉及的pltZ基因是位于M18菌株Plt基因簇下游、抑制Plt合成的一个新的负调控基因，该基因的突变菌株在72小时的Plt产量高达150ug/ml，是文献报道的Pf-5菌株Plt产量的30倍。因此，负调控基因pltZ的发现对提高Plt产量及其生物防治能力提供了一条重要的技术途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种假单胞菌M18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列，假单胞菌M18(Pseudomonas sp.M18)是从甜菜根际土壤中分离得到的一种植物促生根际细菌(PGPR)，它能分泌两种不同类型的抗真菌次生代谢物，吩嗪-1-羧酸(PCA，吩嗪类抗生素)和藤黄绿菌素(Plt，聚酮类抗生素)。在一个假单胞菌株中，同时分泌这两类不同的抗生素，该基因为提高藤黄绿菌素产量及生物防治能力提供了一条技术途径，在国内外文献中还从未有类似报道。
本发明是按照以下技术方案来实现的，本发明生物合成调控因子基因编码蛋白的氨基酸序列N端附近具有细菌调控蛋白TetR家族的特征序列G-[LIVMFYS]-x(2，3)-[TS]-[LIVMT]-x(2)-[LIVM]-x(5)-[LIVQS]-[STAGENQH]-x-PA[GPAR]-x-[LIVMF]-[FYST]-x-[HFY]-[FV]-x-[DNST]-K-x(2)-[LIVM]，该保守区域包含一个具有结合DNA活性的helix-turn-helix(HTH)motif，该基因属于细菌调控蛋白TetR家族的一个成员，5’前导区92bp，包含该基因的SD序列及启动子区(-35序列与-10序列)。所述的基因是在从M18基因组文库筛选plt基因簇和测序分析过程中发现的一个新基因。该基因743bp，有一个651bp的开放阅读框，编码216个氨基酸，5’前导区92bp，包含该基因的SD序列及启动子区(-35序列与-10序列)。在GenBank中进行蛋白质序列同源搜素，发现pltZ编码蛋白与细菌调控蛋白家族中的TetR、AcrR、PsrA等成员在N’端附近序列具有一定的同源性，在Pfam(蛋白质家族数据库)和PROSITE数据库中进行同源搜素，发现pltZ编码蛋白N’端附近序列具有细菌调控蛋白TetR家族的特征序列。因此pltZ基因属于细菌调控蛋白TetR家族(Pfam accession number PF00440，Prosite accession number PS01081)的一个新基因。
pltZ基因的DNA序列为启动子序列 ACAGACAATCGCCCTTATCAACSD序列CCCCTGACAG TCCC AGCACACGACGCCGCACCCCACGAAGCGACGGCGAAAGTACCCGCGCACGGATTCTCGAAGTCGCCGGCCGGCTGTTCGCCCAGCACGGTTATGCCAATACCGCCAGCAAGGCCATCTGCGAGGAAGCTGGGGCCGACCTTGCCGCGATCAACTACCATTTCGGTAGCCGCGACGCCTTGTACAAGGCGGTGCTGGTCGAAGGACACAAGCAGTTCGTCAGCCTGCACGACCTCCGCGAACTGGCGGATAGCGCTCTTCCGCCGGAAACCAAGCTGGAGCGTTTCATCAATGCCATTGTTTCCCGCCTGCTCGACGACCGCAGTTGGCAGAGCAAGGTCTGCGCTCGCGAAATCCTCGCGCCGACGGCGCACTTCGCCAGCCTGATCCGCGAGGAGGTGATGCCCAAGTTCGAAGCCTTGGAGCGGATCATCGGCGAGATCACCGGCCTGCCCCGCCACGACCCCGCCCTGTCGCGCTGCGTCATAAGCATCATCGCGCCCTGCCTGATGCTGATGGTCATCGATCGCGACCAGTCGAGCCCGATGCAAGCGATCCTGCTGCACGACGCCGACGCCCTGAAGAACCACCTGAACCTCTTCGCCCGCAGCGGACTGGAAGCCATACGCCGGCACCACGACCCCTCC PltZ基因编码蛋白的氨基酸序列为MSTRRRTPRSDGESTRARILEVAGRLFAQHGYANTASKAICEEAGADLAAINYHFGSRDALYKAVLVEGHKQFVSLHDLRELADSALPPETKLERFINAIVSRLLDDRSWQSKVCAREILAPTAHFASLIREEVMPKFEALERIIGEITGLPRHDPALSRCVISIIAPCLMLMVIDRDQSSPMQAILLHDADALKNHLNLFARSGLEAIRRHHDPS运用KanR抗性盒对pltZ进行染色体上的定向插入失活，构建了假单胞菌M18的pltZ突变菌株(M18-pltZ-)。比较研究了野生型菌株M18与pltZ突变菌株M18-pltZ在KMB培养基中Plt合成的动力学(图2)。结果显示pltZ突变菌株M18-pltZ-的Plt产量在整个生长过程中显著高于野生型菌株M18，最高可达5倍，这表明pltZ基因在M18的Plt合成中具有强烈的抑制作用。
为了进一步说明pltZ基因对M18 Plt合成的负调控作用，在野生型菌株M18的背景下引入pltZ过表达穿梭质粒pBBRZ。比较研究了M18(pBBR1MCS)与M18(pBBRZ)在KMB培养基上Plt合成的动力学(图3)，结果显示Plt合成因pltZ的过表达而受到强烈的抑制，Plt产量降低了60％。
同时，运用β-半乳糖苷酶活性分析技术研究了Plt生物合成基因pltA与lacZ的翻译融合(pltA’-‘lacZ)在野生型菌株M18及其衍生菌株的表达水平(图4)。结果表明在M18整个生长过程中pltA’-‘lacZ翻译融合的表达水平因pltZ的突变而得到了显著的提高(约提高了1～3倍)；在pltZ突变菌株(M18-pltZ-)，pltA’-‘lacZ翻译融合的表达水平由于pltZ过表达穿梭质粒的互补下降更为显著，约下降了98％。这些都表明了pltZ阻抑Plt生物合成基因的表达。
本发明的优点根据pltZ对Plt合成及Plt生物合成基因表达的负调控机理，通过突变负调控基因pltZ，可构建Plt的高产工程菌株，以提高M18的生物防治能力。
图1表明野生型M18与pltZ突变菌株M18-pltZ-在KMB培养基中Plt合成的动力学图2表明pltZ的过表达对Plt合成的抑制图3表明pltZ的突变对Plt生物合成基因表达的负调控
具体实施例方式
具体实施中所涉及的细菌菌株和质粒见下表菌株与质粒 特性 来源假单胞菌M18野生型根际分离； PLT+PCA+AprSpR本专利突变株PltZ-PLT+PCA+ApRSpRKanR本专利大肠杆菌LE392 F-hsdR514 supE44 supF58 lacY1 galk2 Promega公galT22 metB1 trpR55 司DH5a supE44 ΔlacU169(Ψ80 lacZΔM15)hsdR17 实验室收集recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1SM10 thi-1 thr leu tonA lacY supE 实验室收集recA∷RP4-2-Tc∷Mu KanR质粒pLAFR-5 用于构建基因组文库的柯斯质粒(cosmid)， 实验室收集TcRpLAFR-k 用来自pDSK519的卡那抗性片段插入失活 本专利pLAFR-5的四环素抗性盒，KanRpDSK519 卡那抗性盒的来源，KanR实验室收集pUC18 克隆载体，ApR实验室收集pEX18Gm 基因置换载体，其多克隆位点来自pUC18， 实验室收集oriT+sacB+GmRpBBR1MCS 广泛寄主范围的克隆载体，IncP IncQ CmR实验室收集pME6015 用于构建翻译lacZ融合的pVS1-p15A穿梭载 实验室收集体，TcRpUCZ Shotgun测序质粒pUC18中包含带有pltZ基本专利因的2.48kb片段，AmpRpUCZK 卡那抗性片段插入失活pUCZ的pltZ基因，本专利KanRApRpEXZK 来自pUCZK的4.18kb EcoRI-BamHI片段被亚 本专利克隆到pEX18Gm，GmRoriT+sacB+KanR
pBBRZ 来自pUCZ的1kb EcoRV-PvuII片段被亚克隆 本专利到pBBR1MCS的SmaI位点pMEAZ 包含PpltLA-pltL-pltA’的长733bp 本专利BamHI-PstI PCR扩增片段被克隆到pME6015细菌菌株、质粒及培养条件假单胞菌M18及其衍生菌株的常规培养通常在28℃和Luria-Bertani(LB)培养基(配方见Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis的《分子克隆实验指南》)中进行，而King’s medium(KMB)有利于Plt的合成，因此Plt发酵实验需要在KMB培养基中进行。大肠杆菌被培养在37℃下的LB培养基中。KMB培养基的配方为蛋白胨20g、K2HPO40.3g、MgSO4·H2O 1.5g、甘油15ml、蒸馏水1000ml、PH7.0。在pltZ突变菌株构建过程中，在培养基中添加5％的蔗糖负选择单交换突变体。当需要要时，抗生素按下列浓度(μg ml-1)进行添加对于假单胞菌，卡那霉素(Kan)50，四环素(Tc)75，氯霉素(Cm)200，庆大霉素(Gm)40，氨苄青霉素(Amp)100，壮观霉素(Sp)100，利福平(Rif)20；对于大肠杆菌，卡那霉素(Kan)50，四环素(Tc)25，氯霉素(Cm)40，庆大霉素(Gm)10，氨苄青霉素(Amp)100。
DNA操作和序列分析DNA分离、限制酶消化、琼脂糖凝胶电泳、连接和转化均按分子克隆实验指南(Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989)的标准方法进行。采用shot-gun测序方法对Plt生物合成基因区域进行测序。测序结果开放阅读框(ORF)的分布情况先采用Gene Mark.HMM程序(http//opal.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html)进行预测，结果在Plt生物合成基因簇pltLABCDEFG操纵子下游发现一个反向转录的新调控基因，命名为pltZ。而后利用BLASTX程序(http//www.ncbi.nlm.nih.Gov/BLAST/)对pltZ编码蛋白进行相似蛋白序列的数据库搜索，发现pltZ编码蛋白与Pseudomonas stutzeri的TetR/AcrR(基因库序列号BAC55323)，Pseudomonas putida KT2440的TetR and PsrA(基因库序列号为NP744293和CAC17801)，Pseudomonas.chlororaphis.的PsrA(基因库序列号AAM52309)等细菌调控蛋白在近N’端序列具一定的相似性。pltZ编码蛋白可能结构域的同源性搜索采用Pfam(Protein Family Database，http//www.sanger.ac.uk/software/pfam/)和PROSITE(http//us.expasy.org/prosite/)进行。PltZ与其同源蛋白序列的多重比对通过程序CUSTAWL(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行。分析结果发现在pltZ编码蛋白序列的近N’端具有TetR家族的特征序列，该特征序列包含一个具有DNA结合活性的HTH模体，因此，pltZ基因与其相似蛋白同属于细菌调控蛋白TetR家族的一个新的成员，该家族的许多成员大部分作为细菌阻抑蛋白起作用。
Plt合成量测定200微升发酵菌液加200微升乙酸乙酯抽提，离心取100微升上清，真空干燥，溶于100微升甲醇中，取2μl进行C18反相高效液相色谱(HPLC)分析，检测条件为Plt检测波长308nm，保留时间为3.1min，流动相为70％甲醇，流速1ml min-1，探测范围为0.01。
pltZ基因突变菌株(M18-pltZ-)的构建及其对Plt合成的影响用PvuII从pDSK519切下1.7kb的卡那霉素抗性片段(KanR盒)，插入到pltZ(为测序质粒pUCZ所包含)中用klenow大片段补平末端的Bsp119I位点，结果产生pltZ体外突变的重组质粒pUCZK。接着用EcoRI和BamHI从pUCZK切下包含pltZ∷kmr突变体的4.18kb片段，亚克隆至自杀质粒pEX18Gm(带有蔗糖致死基因sacB)，产生重组质粒pEXZK。随后将pEXZK转化至E.coli SM10作为供体，与受体M18进行双亲杂交，在含100μg ml-1壮观霉素和50μg ml-1卡那霉素的LB琼脂平板上筛选转连接子，其中壮观霉素用来负选择受体E.coli SM10。在经历第二次重组后，即可获得抗卡那霉素(KmR)、庆大霉素敏感(GmS)、蔗糖敏感(SacS)的M18的pltZ-突变株，用Southern杂交来验证所获得的突变株M18-pltZ-。
野生型菌株M18与pltZ突变菌株M18-pltZ-在KMB培养基中Plt合成的动力学比较如图2所示。结果表明pltZ突变菌株M18-pltZ-的Plt产量在整个生长过程中显著高于野生型菌株M18的Plt产量，pltZ突变菌株M18-pltZ-的Plt产量在72小时高达150μg ml-1，而野生型菌株M18在72小时的Plt产量不足30μg ml-1，pltZ基因的突变使Plt产量在野生型水平的基础上足足提高了近4.36倍，这对提高M18菌株在生物防治中的抑菌能力具有重要的意义。
pltZ过表达载体的构建及其对Plt合成的影响从pUCZ切下包含pltZ和pltZ启动子区域的1.04kb EcoRV-PvuII片段，插入到E.coli-pseudomonas穿梭质粒pBBR1MCS的SmaI位点，产生pltZ的过表达载体pBBRZ，随后被转化至M18及其衍生菌株。M18(pBBR1MCS)与M18(pBBRZ)在KMB培养基上Plt合成的动力学分析见图3，结果显示Plt合成因pltZ的过表达而受到强烈的抑制，在72小时，仅含空质粒pBBR1MCS的M18菌株Plt产量为38μg ml-1而此时含pltZ过表达载体的M18菌株的Plt产量仅为16μg ml-1，降低了60％。这个结果进一步说明了pltZ基因对Plt合成的负调控作用，同时说明pltZ基因对Plt合成的抑制是部分抑制而并非完全抑制。
pltA’-‘lacZ翻译融合质粒的构建及β-半乳糖苷酶活性的测定以plt cosmid 8H12为模板，以P1(5’TACGATGGATCCGGCAGATA CTTTAGG 3’)and P2(5’AGAATTCTGCAGGCCTACGTCGAAATC 3’)为引物，PCR扩增包含pltLA启动子、完整pltL及pltA前9个密码子的一个733bp片段，PCR产物经BamHI和PstI酶切后克隆至pME6015，结果产生pltA’-‘lacZ翻译融合载体pMEAZ。
假单胞菌M18和它的衍生菌株被培养在250毫升三角烧瓶的50毫升KMB培养基中，添加合适的抗生素与0.05％Triton X-100至培养基中，培养温度28℃，摇床转速220rpm，按1∶100(V/V)的比例接种KMB培养基培养的过夜菌液。分别在不同的时间点取样测定β-半乳糖苷酶活性，按照分子克隆实验指南(Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989)上描述的Miller方法进行测定。
PltZ对Plt生物合成基因表达的影响将pltA’-‘lacZ翻译融合质粒pMEAZ分别引入到野生型菌株M18，pltZ突变菌株M18-pltZ-，M18-pltZ-(pBBR1MCS)和M18-pltZ-(pBBRZ)，通过分别测定各重组菌株在KMB培养基中的LacZ活性来进一步说明pltZ对Plt生物合成基因表达的负调控作用(图3)。结果表明在整个生长过程中pltA’-‘lacZ翻译融合的表达水平因pltZ的突变而得到了显著的提高，在野生型水平的基础上提高了1～3倍，pltZ突变菌株M18-pltZ-在24小时的LacZ活性达到最大值1443 Miller单位，而野生型菌株M18在24小时的LacZ活性仅为358Miller单位。更为显著的是，在pltZ突变菌株(M18-pltZ-)，pltA’-‘lacZ翻译融合的表达水平由于pltZ过表达穿梭质粒的互补下降更为显著，24小时的LacZ活性峰值从M18-pltZ-(pBBR1MCS)的1761Miller单位下降到M18-pltZ-(pBBRZ)的33 Miller单位，约下降了98％。这些都表明了pltZ强烈阻抑Plt生物合成基因的表达，进而抑制Plt的合成。
权利要求
1.一种假单胞菌M18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列，其特征在于，生物合成调控因子基因编码蛋白的氨基酸序列N端附近具有细菌调控蛋白TetR家族的特征序列G-[LIVMFYS]-x(2，3)-[TS]-[LIVMT]-x(2)-[LIVM]-x(5)-[LIVQS]-[STAGENQH]-x-PA[GPAR]-x-[LIVMF]-[FYST]-x-[HFY]-[FV]-x-[DNST]-K-x(2)-[LIVM]，该保守区域包含一个具有结合DNA活性的helix-turn-helix(HTH)motif，该基因属于细菌调控蛋白TetR家族的一个成员，5’前导区92bp，包含该基因的SD序列及启动子区(-35序列与-10序列)。
2.根据权利要求1所述的假单胞菌M18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列，其特征在于，生物合成调控因子基因及其前导区的DNA序列 ACAGACAATCGCCCTTATCAACCCCCTGACAG TCCC AGCACACGACGCCGCACCCCACGAAGCGACGGCGAAAGTACCCGCGCACGGATTCTCGAAGTCGCCGGCCGGCTGTTCGCCCAGCACGGTTATGCCAATACCGCCAGCAAGGCCATCTGCGAGGAAGCTGGGGCCGACCTTGCCGCGATCAACTACCATTTCGGTAGCCGCGACGCCTTGTACAAGGCGGTGCTGGTCGAAGGACACAAGCAGTTCGTCAGCCTGCACGACCTCCGCGAACTGGCGGATAGCGCTCTTCCGCCGGAAACCAAGCTGGAGCGTTTCATCAATGCCATTGTTTCCCGCCTGCTCGACGACCGCAGTTGGCAGAGCAAGGTCTGCGCTCGCGAAATCCTCGCGCCGACGGCGCACTTCGCCAGCCTGATCCGCGAGGAGGTGATGCCCAAGTTCGAAGCCTTGGAGCGGATCATCGGCGAGATCACCGGCCTGCCCCGCCACGACCCCGCCCTGTCGCGCTGCGTCATAAGCATCATCGCGCCCTGCCTGATGCTGATGGTCATCGATCGCGACCAGTCGAGCCCGATGCAAGCGATCCTGCTGCACGACGCCGACGCCCTGAAGAACCACCTGAACCTCTTCGCCCGCAGCGGACTGGAAGCCATACGCCGGCACCACGACCCCTCC
3.根据权利要求1所述的假单胞菌M18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列，其特征在于生物合成调控因子基因编码蛋白的氨基酸序列MSTRRRTPRSDGESTRARILEVAGRLFAQHGYANTASKAICEEAGADLAAINYHFGSRDALYKAVLVEGHKQFVSLHDLRELADSALPPETKLERFINAIVSRLLDDRSWQSKVCAREILAPTAHFASLIREEVMPKFEALERIIGEITGLPRHDPALSRCVISIIAPCLMLMVIDRDQSSPMQAILLHDADALKNHLNLFARSGLEAIRRHHDPS
全文摘要
一种假单胞菌M18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列，属于基因技术领域。本发明假单胞菌M18中藤黄绿菌素生物合成调控因子的基因序列，生物合成调控因子基因编码蛋白的氨基酸序列N端附近具有细菌调控蛋白TetR家族的特征序列G－[LIVMFYS]－x(2，3)－[TS]－[LIVMT]－x(2)－[LIVM]－x(5)－[LIVQS]－[STAGENQH]－x－PA[GPAR]－x－[LIVMF]－[FYST]－x－[HFY]－[FV]－x－[DNST]－K－x(2)－[LIVM]，该保守区域包含一个具有结合DNA活性的helix－turn－helix(HTH)motif，该基因属于细菌调控蛋白TetR家族的一个成员，5’前导区92bp，包含该基因的SD序列及启动子区(－35序列与－10序列)。本发明的优点根据pltZ对Plt合成及Plt生物合成基因表达的负调控机理，通过突变负调控基因pltZ，可构建Plt的高产工程菌株，以提高M18的生物防治能力。
文档编号C12N15/11GK1523107SQ0315090
公开日2004年8月25日 申请日期2003年9月11日 优先权日2003年9月11日
发明者许煜泉, 黄显清 申请人:上海交通大学