诺卡拉蛋白质分离物的颜色淡化的制作方法

专利名称：诺卡拉蛋白质分离物的颜色淡化的制作方法
相关申请参考
依据35 USC 119(e)，本申请要求2002年6月20日提交的共同未决的美国临时专利申请No.60/389,957和2002年11月6日提交的60/432,985的优先权。
发明领域
本发明涉及从卡诺拉种子粗粉中回收卡诺拉蛋白质分离物。
背景技术：
在美国专利No.5,844,086和6,005,076(“Murray II”)(已转让给该发明的受让人，其公开被引入本文作为参考)中，描述了一种从具有丰富脂肪含量的油性种子粗粉(包括具有如此含量的卡诺拉油性种子粗粉)中分离蛋白质分离物地方法。该方法的步骤包括从油性种子粗粉中溶解蛋白质物质(该步骤也溶解粗粉中的脂肪)，从得到的蛋白质水溶液中除去脂肪。蛋白质水溶液可以在除去脂肪的步骤之前或之后，与残余的油性种子粗粉分离。浓缩脱脂的蛋白质溶液以增加蛋白质浓度，同时保持离子强度基本上恒定，然后可以对浓缩的蛋白质溶液实施进一步的除脂步骤。随后稀释浓缩的蛋白质溶液，以形成高度聚集的蛋白质分子的云状团块(mass)，其是微团(micellar)形式的离散的蛋白质微滴。使蛋白质微团沉淀，形成聚集的、联合的、致密无定形的、粘性面筋样蛋白质分离物团块，称为“蛋白质微胶粒团”或PMM，将其从残余的水相中分离并干燥
蛋白质分离物具有至少90％的蛋白质含量(用Kjeldahl氮或其它适宜方法N x6.25测定)，基本上为未变性的(用差式量热扫描测定)，具有低残余脂肪含量。本文所使用的术语“蛋白质含量”是指蛋白质在蛋白质分离物中的量(以干重表示)。利用该方法获得的蛋白质分离物的产量(以作为干燥蛋白质分离物回收的从油料种子粗粉中提取的蛋白质的比例表示)一般小于40wt％，典型地在20wt％左右。
上述Murray II专利中描述的方法是对USP 4,208,323(MurrayIB)中描述的方法(从包括油料种子的多种蛋白质来源的物质中形成蛋白质分离物)的修改和改进。1980年公布USP 4,208,323时能够获得的油料种子粗粉不具有Murray II专利时能获得的卡诺拉油料种子粗粉的脂肪污染水平，故此，Murray IB专利的方法不能从所述油料种子粗粉中生产蛋白质含量高于90wt％的蛋白质物质。Murray IB专利中没有描述任何采用油菜籽(卡诺拉)粗粉作为原料进行实施的具体实验。
Murray IB专利自身的目的在于通过在稀释前引入浓缩步骤以形成PMM从而改进美国专利No.4,169,090和4,285,862(Murray IA)所描述的方法。Murray IA专利公开了包括油菜籽的一个实验但未提供产物纯度的数据。Murray IB专利所描述的浓缩步骤将Murray IA方法的蛋白质分离物的产率提高了约20％。
通过所述现有方法制备的卡诺拉蛋白质分离物的缺点是黄色相对暗和气味不佳。已有报道指出酚类化合物是导致卡诺拉蛋白质产品(包括粗粉)这些问题的原因。卡诺拉所含酚类化合物的量大约是大豆的十倍，所述酚类化合物可能包括芥子碱和缩合鞣质。经过氧化，酚类化合物能引起暗色的发生。该问题在通过等电沉淀制备的卡诺拉蛋白质产品中特别严重，等电沉淀中的强碱环境导致酚类化合物迅速氧化为醌，其随即与蛋白质反应，并赋予蛋白质及其溶液暗绿色或暗棕色。其它化合物和反应也可能对颜色的形成产生作用。
发明概述
本申请人此处提供了对产生卡诺拉蛋白质分离物的方法的改进，其中处理卡诺拉种子以产生卡诺拉蛋白质粗粉，提取卡诺拉蛋白质粗粉形成蛋白质水溶液，浓缩蛋白质水溶液，和从蛋白质浓缩水溶液中回收卡诺拉蛋白质分离物。
在提取步骤中从卡诺拉粗粉中提取酚类化合物，通过330nm(A330)UV吸光度可得存在的游离酚的量。所述酚类化合物易于被氧化为醌，其与蛋白质反应形成有色化合物，其易于吸收较高的波长。测定420nm(A420)吸光度提供了对分离物和卡诺拉蛋白质溶液的实际可见的黄色着色更为直接的检测。在本发明中，在获得卡诺拉蛋白质分离物过程中，实施如下步骤，除去酚类化合物以使其不能形成可见的着色成分，抑制酚类化合物氧化为可见着色化合物和除去其它可见着色成分。
本发明的一个方面提供的改进涉及在上述方法中实施至少一个最终得到颜色淡化的卡诺拉蛋白质分离物的步骤。本发明人在该方法中采取了多种操作，可采用的一个或多个步骤包括
-加工卡诺拉种子
-加工粗粉
-使用特定形式的卡诺拉蛋白质粗粉
-在特定条件下实施卡诺拉蛋白质的提取
-加工提取物
-加工回收的卡诺拉蛋白质分离物
可应用两种或多种所述操作，通常使用所述操作的组合。
当实施对种子的加工时，操作至少包括灭活仍在脱壳的种子中的黑芥子酶。使黑芥子酶失活，黑芥子酶对硫代葡萄糖酸盐的任何催化作用均导致其裂解为含硫成分(为抗营养物，是味觉和颜色的原因)。共同未决的美国专利申请No.＿＿提交的＿＿(转让给该专利受让人，其公开引入此处作为参考)中更全面地描述了该方法。
对粗粉的处理可包括用水可混合性有机溶剂(包括醇，例如乙醇)提取粗粉，以提取酚类化合物和/或其它着色成分。
当使用特定形式的卡诺拉蛋白质粗粉时，所述粗粉可以是经气体脱溶剂的粗粉，该粗粉通过在低于约50℃的温度下，通常在约15℃～约30℃的室温下从卡诺拉油料种子粗粉的溶剂提取中除去残余溶剂而进行制备。
此外，特定形式的卡诺拉蛋白质粗粉可以是低温焙烤的，该粗粉通过在低于约100℃的升高温度下从卡诺拉油料种子粗粉的溶剂提取中除去残余溶剂进行制备。
当方法步骤包括提取步骤时，提取步骤可在抑制酚类化合物氧化和可见颜色形成的抗氧剂的存在下实施。可选地或组合地，由提取步骤产生的蛋白质水溶液可用至少一个着色成分吸收剂进行处理。此外，或可选地，用至少一个着色成分吸收剂处理浓缩步骤中产生的卡诺拉浓缩的蛋白质溶液。
当方法步骤包括浓缩步骤时，对卡诺拉蛋白质浓缩水溶液实施渗滤以便从卡诺拉浓缩的蛋白质溶液中洗掉着色物。渗滤可采用包含在渗滤期间抑制酚类化合物氧化和可见颜色形成的抗氧剂的水溶液进行实施。
当方法步骤包括回收的卡诺拉蛋白质分离物时，该方法步骤可包括采用醇水溶液，例如乙醇水溶液提取卡诺拉蛋白质分离物，以便从卡诺拉蛋白质分离物中提取酚类化合物和/或可见的着色物。
通过将浓缩水溶液加入冷水以产生蛋白质微胶粒，和从上清液中分离蛋白质微胶粒，可以从蛋白质浓缩水溶液中分离卡诺拉蛋白质分离物。
通过浓缩上清液，对浓缩的上清液实施渗滤以便从浓缩的上清液中除去酚类化合物和/或可见的着色物，然后从渗滤的上清液中，例如从干燥渗滤的上清液回收卡诺拉蛋白质分离物由此处理上清液以便从中回收更多的卡诺拉蛋白质分离物。
通过防止颜色形成和通过改善卡诺拉蛋白质分离物的颜色，该产品可用于更广泛的用途。根据本发明去除和防止着色物形成被认为还能改善卡诺拉蛋白质分离物的气味。
根据此处的方法制备的蛋白质分离物可用于蛋白质分离物的传统用途中，例如加工食品中的蛋白质强化，油的乳化，焙烤品中的成形体和俘获气体的产品中的发泡剂。此外，该蛋白质分离物可被制成蛋白质纤维(可用于肉类似物)，可在将蛋白作为粘合剂的食品中用作蛋白代用品或添加剂。卡诺拉蛋白质分离物可用作营养添加剂。卡诺拉蛋白质分离物的其它用途为宠物食品，动物饲料和工业及化妆品用途和个人护理产品。
根据本发明的一个具体方面，提供了一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括(a)通过使用包含抗氧剂的盐水溶液提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，(c)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，产生浓缩的蛋白质溶液，(d)将经渗滤的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，(e)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和(f)从上清中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N x 6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
根据本发明的另一个具体方面，提供了一种由卡诺拉油料种子粗粉制备卡诺拉蛋白质溶液的方法，包括(a)用醇洗涤所述卡诺拉油料种子粗粉，(b)提取经洗涤的卡诺拉油料种子粗粉，使经洗涤的卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，(c)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，(d)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，产生浓缩的蛋白质溶液，(e)将经渗滤的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，(f)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和(g)从上清中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N x 6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
根据本发明的其它具体方面，提供了一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括(a)提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，(c)通过对蛋白质水溶液实施超滤而提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，产生浓缩的蛋白质溶液，(d)对浓缩的蛋白质溶液实施渗滤，(e)将经渗滤的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，(f)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和(g)从上清中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N x 6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
根据本发明的另一方面，提供了一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括(a)提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，(c)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，产生浓缩的蛋白质溶液，(d)将所述浓缩的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，(e)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，(f)将蛋白质微胶粒和上清液分离，(g)干燥蛋白质微胶粒，得到以干重(N x 6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％的诺拉蛋白质分离物，和(h)用醇水溶液提取所述卡诺拉蛋白质分离物。
根据本发明的其它具体方面，提供了一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括(a)提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，(c)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，产生浓缩的蛋白质溶液，(d)对浓缩的蛋白质溶液实施巴氏消毒，形成巴氏消毒的蛋白质溶液，(e)将巴氏消毒的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，(f)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和(g)从上清液中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N x 6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
根据本发明的另一方面，提供了一种从卡诺拉油料种子中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括(a)处理卡诺拉油料种子，灭活油料种子所包含的黑芥子酶，制备经处理的油料种子，(b)加工所述油料种子，从中除去卡诺拉油，制备卡诺拉油料种子粗粉，(c)提取卡诺拉油料种子，使卡诺拉油料种子中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的水溶液，(d)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，(e)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，产生浓缩的蛋白质溶液，(f)将浓缩的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，(g)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和(h)从上清液中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N x 6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
卡诺拉也被认为是油菜籽或油料种子油菜。
发明详述
通过处理种子可获得颜色的改进。使用蒸汽处理脱壳种子以热灭活黑芥子酶。然后可通过常规方法处理灭活的种子以从种子中回收油和形成卡诺拉油料种子粗粉。
优选(根据本发明的一个实施方案)通过在低于约100℃的升高温度下焙烤而对油料种子粗粉脱溶剂，因为所述粗粉引起的颜色发生比采用常规(更高焙烤温度)的方法脱溶剂的粗粉少。共同未决的2002年12月9日提交的US专利申请No.10/314,202(转让给该专利受让人，其公开引入此处作为参考)中描述了从所述粗粉中形成蛋白质含量为至少约90wt％(N x 6.25)，优选至少约100wt％的卡诺拉蛋白质分离物。
更优选地，将油料种子粗粉在低于约50℃，优选约15℃～约30℃的室温附近的温度，在气体中脱溶剂，因为其产生的颜色甚至比使用存在于提取液中的焙烤的粗粉的情况下更低。共同未决的2002年6月21日提交的US专利申请No.60/390,126和2002年8月8日提交的60/401,712和＿＿提交的＿＿(转让给该专利受让人，其公开引入此处作为参考)中描述了从所述粗粉中产生蛋白质含量为至少约90wt％(N x 6.25)，优选至少约100wt％的卡诺拉蛋白质分离物。从卡诺拉油料种子粗粉中可产生卡诺拉蛋白质分离物。共同未决的2001年5月4日提交的US专利申请No.60/288,415，2001年10月5日提交的60/326,987，2001年11月7日提交的60/331,066，2001年11月26日提交的60/333,494，2002年4月24日提交的60/374,801和2002年5月3日提交的10/137,391(WO 02/089597)(均转让给该专利受让人，其公开引入此处作为参考)中描述了从卡诺拉油料种子粗粉中产生卡诺拉蛋白质分离物的方法，所述分离物的蛋白质含量为至少约100wt％(N x 6.25)。该方法包括多个方法步骤，其包括通过使用盐溶液提取卡诺拉油料种子粗粉，将所得蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，利用选择性膜技术将水溶液中蛋白质浓度增加至至少约200g/L，同时保持离子强度基本恒定，将所得浓缩的蛋白质溶液在冷水中稀释以产生蛋白质微胶粒，使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团(PMM)，和从上清中回收以干重(N x 6.25)计，蛋白质含量为至少约90wt％的蛋白质微胶粒团。如此处所使用的，以干重测定蛋白质含量。回收的PMM可被干燥。
在上述和US专利Nos.60/326,987，60/331,066，60/333,494，60/374,801和10/137,391具体描述的方法的一个实施方案中，处理来自PMM沉淀步骤的上清液以回收蛋白质分离物，其包含干燥来自潮湿PMM和上清液的蛋白质分离物。该方法可通过首先使用超滤膜浓缩上清液，然后将浓缩的上清液与潮湿的PMM混合，以及干燥混合物来实施。所得卡诺拉蛋白质分离物具有至少约90wt％蛋白质(N x 6.25)，优选至少约100wt％蛋白质(N x 6.25)的高纯度。
上述和申请Nos.60/333,494，60/374,801和10/137,391具体描述的方法的另一个实施方案中，处理来自PMM沉淀步骤的上清液以便从上清液中回收蛋白质分离物。该方法可通过首先使用超滤膜浓缩上清液和干燥浓缩物进行实施。所得卡诺拉蛋白质分离物具有至少约90wt％蛋白质(N x 6.25)，优选至少约100wt％蛋白质(N x 6.25)的高纯度。
上述US专利所描述的方法是基本上批量的方法。共同未决的提交于2001年11月20日提交的US专利申请No.60/331,646，2002年5月30日提交的60/383,809和2002年11月19日的10/298,678(WO03/043439)(转让给该专利受让人，其公开引入此处作为参考)中描述了制备卡诺拉蛋白质分离物的连续过程。根据该过程，将卡诺拉油料种子粗粉与盐溶液持续混和，将混合物从管中输送，同时从卡诺拉油料种子粗粉中提取蛋白质，形成蛋白质水溶液，将蛋白质水溶液与残余的卡诺拉油料种子粗粉持续分离，将蛋白质水溶液持续通过选择性膜操作以将蛋白质水溶液的蛋白质含量增加到至少约200g/L，同时保持离子强度基本恒定，将所得浓缩的蛋白质溶液与冷水持续混和，产生蛋白质微胶粒，持续沉淀蛋白质微胶粒，同时持续溢流上清液直至在沉淀器中累积所需量的PMM。从沉淀器中取出PMM，可将其干燥。PMM的蛋白质含量为至少约90wt％(N x 6.25)，优选至少约100wt％(N x 6.25)。
如前述US专利Nos.60/326,987，60/331,066，60/333,494，60/333,494，60/374,801和10/137,391中所述，可处理溢流的上清液以从中回收卡诺拉蛋白质分离物。
根据本发明的一个实施方案，可开始就对油料种子粗粉实施溶剂提取以从中除去酚类化合物和着色物。所述溶剂萃取可通过使用酚类化合物和/或可见着色物的水溶性有机溶剂，例如水溶性醇，优选乙醇而实施。
提取可通过将卡诺拉油料种子粗粉约1∶3～约1∶10，优选约1∶5的w/v比例分散在溶剂中而实施。浆体可在约15℃～约45℃，优选约30℃～约35℃的温度下被搅拌约5～约60分钟，优选约15～约30分钟。一组适宜的条件是35℃提取30分钟，可多次重复所述提取直至不能再提取到酚类化合物和/或可见颜色。
在本发明的方法中，将卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质物质溶解。该蛋白质物质可以是卡诺拉种子中天然存在的蛋白质，或是经遗传操作的、但具有天然蛋白质的疏水性和极性特征的蛋白质物质。卡诺拉粗粉可以是通过热己烷提取法或冷榨提油法将卡诺拉油从卡诺拉油料种子中除去而得到的、含有多种水平的非变性蛋白质的任何卡诺拉粗粉。种子的处理(当用于实施从卡诺拉油料种子中除去卡诺拉油时)通常作为与此处所述本发明的蛋白质分离物回收方法分离的操作实施。
由于盐的存在可以促进可溶性蛋白质从油料种子粗粉中分离，故使用食品级盐溶液可以最有效地实现蛋白质溶解。当卡诺拉蛋白质分离物意在用于非食品用途时，可以使用非食品级的化学物质。盐通常是氯化钠，但也可以使用其它盐，例如，氯化钾。盐溶液的离子强度为至少约0.10，优选至少约0.15，这可以实现大量蛋白质的溶解。随着盐溶液离子强度的增加，油料种子粗粉中蛋白质的溶解程度也开始增加，直至达到最大值。再增加离子强度则不能增加溶解的蛋白质总量。导致最大蛋白质溶解的食品级盐溶液的离子强度根据有关的盐和所选择的油料种子粗粉而改变。食品级盐溶液的离子强度为约0.25。
考虑到若增加离子强度，就需要进行更大程度的稀释以形成蛋白质沉淀，故一般优选使用的离子强度低于约0.8，更优选为约0.15～约0.6。
在批量过程中，蛋白质的盐溶在至少约5℃，优选达约35℃的温度下实施，优选通过搅拌来缩短溶解时间，溶解时间通常为约10～约60分钟。优选按照从油料种子粗粉中基本上最大限度地提取蛋白质来实施溶解，以便获得高的总产量。
选择约5℃的温度下限是因为低于这一温度会减缓蛋白质的溶解，而选择约35℃的优选温度的上限是因为在更很高温度下进行批量加工在经济上不合算。
在连续过程中，通过包含实施从卡诺拉油料种于粗粉中连续提取蛋白质的任何方法从卡诺拉油料种子粗粉提取蛋白质。在一个实施方案中，将卡诺拉油料种子粗粉与食品级盐溶液持续混合，将混合物从管或导管中输送，所述管或导管的长度和流量应能提供足以按照此处描述的参数实施所需提取的停留时间。在所述连续过程中，快速(在约10分钟的时间内)实施盐溶解步骤，优选实施溶解以基本上尽可能多地从卡诺拉油料种子粗粉中提取蛋白质。连续过程中的溶解优选在升高温度下，优选高于约35℃，通常达约65℃或更高的温度下实施。
含水的食品级盐溶液和卡诺拉油料种子粗粉具有约5～约6.8的天然pH值，该pH值可以使蛋白质分离物通过微胶粒途径形成，如下文更详细的描述。
当pH位于和接近pH范围的上下限时，只能部分通过微胶粒途径形成蛋白质分离物，产量比pH位于pH范围内其它位置时低。由于这些原因，优选约5.3～约6.2的弱酸性pH值。
可以根据需要，使用任何适宜的酸(通常是盐酸)或碱(通常是氢氧化钠)将盐溶液的pH值调整至用于提取步骤中的约5～6.8之间的值。
在溶解步骤中，油料种子粗粉在食品级盐溶液中的浓度可以有很大变化。典型的浓度值为约5％～15％(w/v)。
根据本发明的一个实施方案，存在于食品级盐溶液中的抗氧剂抑制卡诺拉油料种子粗粉中的酚氧化为能与蛋白质反应并导致颜色变暗的成分。可以使用任何所需的食品级抗氧剂，例如亚硫酸钠和维生素C.用于含水的食品级盐溶液的抗氧剂的量依赖于使用的物质，并可在约0.01～约1wt％，优选约0.05～约0.1wt％之间变化。通过使用抗氧剂抑制酚类化合物的氧化导致提取颜色(420nm吸光度)的降低，而酚类化合物的浓度(330nm吸光度)大多保持不变。
在加入亚硫酸钠时，即使在0.05M这样低的盐浓度，在pH6.3下提取物中的蛋白质浓度仍与0.15M无亚硫酸钠的盐相当。
经过提取步骤所得到的蛋白质溶液的蛋白质浓度通常为约5～约40g/L，优选约10～约30g/L。
在选择提取步骤的参数时，对尽可能多地从卡诺拉油料种子粗粉中提取蛋白质的需要应与对将所得提取液的颜色最小化的需要相平衡。根据此处提供的数据，30分钟的提取时间通常足以在优选的pH和盐摩尔浓度下提取全部蛋白质。更高的pH能增加蛋白质的提取量并导致蛋白质溶液在颜色上视觉上变暗(按A420吸光度测定)。
在pH8.0用0.1M的盐提取10分钟所提取的蛋白质可能与在pH6.3用0.15M的盐提取30分钟所提取的蛋白质一样多。当与在较低pH下的提取比较时，pH9.8的提取在A330出现显著的降低，虽然随着pH增加颜色在视觉上降低。对该现象的一个解释可能是酚类化合物发生反应而产生不能在A330吸收，而在A360和A400之间的更高的值吸收的黄色着色物。由于这些原因，在低于8的pH下实施卡诺拉蛋白质粗粉提取。
可采用任何适宜的方式，例如通过使用真空过滤将从提取步骤中得到的水相与残余的卡诺拉粗粉分离，随后通过离心和/或过滤而除去残余的粗粉。可将分离的残余卡诺拉粗粉干燥备用。
当卡诺拉种子粗粉包含大量脂肪时(如Murray II专利所述)，则可对分离的蛋白质水溶液和下述蛋白质浓缩水溶液实施此处所述的脱脂步骤。
虽然单独使用水从卡诺拉油料种子粗粉中提取的蛋白质会比盐水溶液少，但作为用盐水溶液从卡诺拉油料种子粗粉中提取蛋白质的可选方案，可单独使用水实施所述提取。当使用该可选方案时，则在分离残余油料种子粗粉后将盐(以上述浓度)加入蛋白质溶液中，以便在下述浓缩步骤其间保持蛋白质。当实施第一除脂步骤时，盐通常在所述操作完成后加入。
另一可选的步骤是用食品级盐溶液以高于约6.8，通常达约11的相对高的pH值提取卡诺拉油料种子粗粉。然而，如上所述，通常要避免在高于约8的pH值下的提取，因为在该pH值时会产生大量可见颜色。通过使用任何适宜的食品级碱，例如氢氧化钠溶液可将食品级盐溶液的pH调整至需要的碱性pH值。可选地，可以采用盐溶液以低于约5，通常达约3的相对低的pH值从卡诺拉油料种子粗粉中提取蛋白质。当使用该可选方案时，则可采用任何适宜的方式，例如通过使用真空过滤将从卡诺拉油料种子粗粉提取步骤中得到的水相与残余的卡诺拉粗粉分离，随后通过离心和/或过滤而除去残余的粗粉。可将分离的残余卡诺拉粗粉干燥备用。
然后在如下述主要通过微胶粒途径进一步加工以回收卡诺拉蛋白质分离物之前，可将获自高或低pH提取步骤的蛋白质水溶液的pH调整为约5～约6.8，优选约5.3～约6.2(如上述)。这种pH调整可以使用任何适宜的酸，或碱如氢氧化钠来实现。
根据本发明的另一实施方案，在提取蛋白质后，对蛋白质溶液实施一个或多个除色步骤，包括超滤/渗滤以及与吸色剂接触。在超滤步骤中，蛋白质水溶液的蛋白质含量增加，而盐浓度保持不变。超滤可通过采用具有符合能使酚类化合物和着色物通过具有渗透物的膜而留下蛋白质的分子量截至值的膜来实施，通常超滤膜的截至分子量为约3,000～约50,000道尔顿，优选约5000～约10,000道尔顿(根据不同膜材料和构型)。膜可以是中空纤维膜或卷绕膜。对于连续操作，可改变膜的尺寸以便能在蛋白质水溶液经过膜时实现所需的浓缩程度。
通过超滤步骤将蛋白质溶液浓缩约4～约20倍，优选经实施浓缩后产生蛋白质浓度为至少约200g/L，更优选为至少约250g/L的浓缩的蛋白质溶液。
然后采用具有与提取液相同摩尔浓度和pH的盐水溶液对浓缩的蛋白质溶液实施渗滤步骤。所述渗滤可通过采用约2～约20体积的渗滤液，优选约5～约10体积的渗滤液来实施。在渗滤操作中，通过经过带有渗透物的膜从蛋白质水溶液中除去更多量的酚类化合物和可见颜色。实施渗滤操作直至渗透物中无显著更多量的酚类化合物和可见颜色。所述渗滤可通过采用截至分子量为约3,000～约50,000道尔顿，优选约5000～约10,000道尔顿(根据不同膜材料和构型)的膜来实施。
根据本发明该实施方案的方面，抗氧剂可存在于至少部分渗滤步骤所使用的渗滤介质中。抗氧剂可以是任何适宜的食品级抗氧剂，例如亚硫酸钠或维生素C。渗滤介质中使用的抗氧剂的量依赖于所使用的物质且可存在约0.01～约1wt％，优选约0.05wt％的变化。抗氧剂用以抑制存在于卡诺拉蛋白质分离物浓缩液中酚类化合物的氧化。
浓缩步骤和渗滤步骤可在任何适宜的温度(通常为约20℃～约60℃)实施一段时间以实现所需的浓缩程度。用于某程度的温度和其它条件依赖于用于实现溶液的浓缩和所需蛋白质浓度的膜装置。
在实施超滤/渗滤操作时，根据需要选择条件以便产生具有最高蛋白质浓度和最少颜色的蛋白质溶液。根据下述实验，超滤/渗滤(UF/DF)步骤能有效降低(根据pH和盐含量)约28％～约74％的A330值(酚类化合物浓度)。超滤/渗滤操作还具有除去抗营养因子的作用，由此改善了卡诺拉蛋白质分离物的营养特性。
在pH8.0和6.3时UF/DF渗透物的A330值最高。这些高渗透物的A330值可能是由于在未结合的酚类化合物能够通过膜进入渗透物中，而在pH9.8和pH11.0时，酚类化合物已经反应生成着色物而不能在A330强烈吸收。
在较高pH和盐水平的提取的起始A330读数最高，在大多数情况下最终渗余物A330读数最低。在较高的pH和盐水平，渗透物包括较高水平的氮，这提示蛋白质丢失。
最终渗余物的A330与蛋白质的比例显示出在pH6.3～8.0的pH时可得到最佳的比率，这提示通过UF/DF步骤，A330组分/蛋白质比更高的pH试验更低和更有效的去除。在除0M和0.25M盐浓度外的所有浓度中，pH6.3具有最佳的A330与蛋白质的比例。据此，在用最佳盐水平0.25M盐将颜色从蛋白质溶液中渗滤出以通过最高蛋白质水平的实验中，pH6.3表现出最佳的pH水平。
超滤/渗滤操作后，可以用吸色剂进行处理。在上述共同未决的US专利Nos.60/288,415，60/326,987，60/331,066，60/333,494，60/374,801和10/137,391(WO 02/089597)中描述了使用粉状活性炭实施减色。
如所述申请所述，在浓缩之前对卡诺拉蛋白质溶液实施所述减色步骤，导致产品卡诺拉蛋白质分离物中与无所述步骤时相比呈现较亮的颜色和较弱的黄色。根据本发明的另一实施方案，优选对浓缩和渗滤的卡诺拉蛋白质溶液施用颜色成分吸附物。此处可使用粉状活性炭以及颗粒活性炭(GAC)。可作用吸色剂另一物质是聚乙烯吡咯烷酮。可选地，根据本发明的另一实施方案，可在超滤和任选的渗滤之前，和/或直接在提取步骤中对卡诺拉蛋白质溶液施用颜色成分吸附物。当在超滤步骤之前施用颜色吸附物时，可省略渗滤，此时所述渗滤不能除去更多的酚类化合物和/或可见颜色。
在下述实验中，聚乙烯吡咯烷酮和GAC在pH6.3和8.0时对A330值的降低要优于在pH9.8和11时，这可能是由于在两个较高pH水平醌与蛋白质结合。聚乙烯吡咯烷酮产生了A330的良好降低，而没有蛋白质的丢失。其它所试验的可能物质均不令人满意，或者导致不能接受的蛋白质丢失，或者不能降低溶液的A330。
颜色吸附剂处理步骤可在任何适宜的条件下实施，通常在卡诺拉蛋白质溶液的室温下。对于粉状活性炭，可以使用约0.025％～约5％w/v，优选约0.05％～约2％w/v的量。当聚乙烯吡咯酮用作吸色剂时，可使用约0.5～约5w/v，优选约2～约3％w/v的量。可通过任何适宜的方法，例如过滤从卡诺拉蛋白质溶液中除去吸色剂。
吸色剂对渗滤的卡诺拉蛋白质溶液的处理后，处理所得蛋白质溶液以从中产生卡诺拉蛋白质分离物。根据蛋白质溶液的参数，可采用任何适宜的方式实施卡诺拉蛋白质分离物的回收。
例如，可通过等电沉淀从碱性溶液中或通过蛋白质微胶粒方法从更为中性的溶液中回收卡诺拉蛋白质分离物。可选地，可通过增加盐浓度而沉淀蛋白质。
处理卡诺拉蛋白质溶液以回收卡诺拉蛋白质分离物的方法优选采用上述US专利所描述的以及下面更详细描述的蛋白质微胶粒方法来实施，因为其提取pH条件能比用于等电沉淀技术所使用的导致更少的颜色形成。
根据对含水卡诺拉蛋白质溶液实施的除色步骤中使用的温度，可将浓缩的蛋白质溶液加热至至少约20℃，达约60℃，优选约25℃～约40℃的温度，以降低浓缩的(任选地渗滤的)蛋白质溶液的粘度以易于实施随后的稀释步骤和微胶粒形成。浓缩的和任选地渗滤的蛋白质溶液不应被加热至的温度不能超过在经冷水稀释时无法形成微胶粒的浓缩的和任选地渗滤的蛋白质溶液的温度。可进一步对浓缩的和任选地渗滤的蛋白质溶实施如Murray II专利所述的脱脂操作(如有需要)。
可对得自除色步骤的浓缩的蛋白质溶液实施巴氏消毒以杀死原始粗粉由于储存而已有的或在提取步骤中从粗粉中被提取至卡诺拉蛋白质分离物溶液中的任何细菌。所述巴氏消毒可在任何需要的巴氏消毒条件下实施。通常，将浓缩的和任选地渗滤的蛋白质溶液加热至约55℃～约70℃，优选约60℃～约65℃的温度，约10～约15分钟，优选约10分钟。然后可以冷却经巴氏消毒的浓缩的蛋白质溶液以用于下述进一步的处理，优选冷却至约25℃～约40℃的温度。
然后将得自除色步骤和任选的脱脂和巴氏消毒步骤的浓缩的蛋白质溶液通过采用浓缩的蛋白质溶液与具有获得所需稀释程度的体积的冷水混合的方法进行稀释而形成微胶粒。根据需要通过微胶粒途径获得的卡诺拉蛋白质的比例和从上清液中的比率，浓缩的蛋白质溶液的稀释程度可有所变化。稀释水平越高(通常)，水相中保留的卡诺拉蛋白质比例就越高。
当需要通过微胶粒途径得到最大比例的蛋白质时，可将浓缩的蛋白质溶液稀释约15倍或更低，优选约10倍或更低。
与浓缩的蛋白质溶液混合的冷水的温度低于约15℃，通常约3℃～约15℃，优选低于约10℃，因为用这些较冷的温度在所用的稀释系数下能得到提高的蛋白质微胶粒形式的蛋白质分离物的产量。
在批量操作中，将浓缩的蛋白质溶液批量加入具有所需体积的静止的冷水体中(如上述)。浓缩的蛋白质溶液稀释和随后离强度的降低导致云状团块的形成，该团块为高度联合的蛋白质分子，其是微胶粒形式的离散蛋白质微滴。在批量过程中，使蛋白质微胶粒在冷水体中沉淀以形成聚集的、并合的、高密度的、无定形的、粘性的、面筋样蛋白质微胶粒团(PMM)。可通过例如离心辅助沉淀。所述诱导的沉淀降低了蛋白质微胶粒的液体含量，由此通常将含水量从微胶粒团总重的约70％～约95％(以重量计)降为约50％～约80％(以重量计)。以这种方式降低微胶粒团的含水量还降低了微胶粒团包含的盐含量，由此降低了干燥分离物的盐含量。
可选地，稀释操作可通过将浓缩的蛋白质溶液连续通过T-形管的一个口而从T-形管的另一入口注入稀释用的水(使其在管中混合)而得以连续地实施。将稀释用的水以足以获得所需稀释程度的速率注入T-形管。
浓缩的蛋白质溶液和稀释用水在管中的混合启动了蛋白质微胶粒的形成，将混合物经T-形管入口持续注入沉淀器中，当充满时，使上清液从其中溢流。优选将混合物以能最小化液体中湍流的方式注入沉淀器中的冷水体中。
在连续过程中，将蛋白质微胶粒在沉淀器中沉淀，形成聚集的、并合的、高密度的、无定形的、粘性的、面筋样蛋白质微胶粒团(PMM)，连续操作直至在沉淀器底部累积所需量的PMM，由此从沉淀器中取出累积的PMM。
将蛋白质溶液浓缩至蛋白质含量为至少约200g/L和稀释率小于约15的加工参数并用，和上述US专利所描述的本领域已知的任何产生蛋白质分离物的方法相比，能产生更高的产量(通常是显著高的产量，指以蛋白质微胶粒团形式从原始粗粉提取物中回收的蛋白质)和更纯的分离物(指蛋白质含量)。
可以通过例如将残余的水相从沉淀物质中倾析或离心，使沉淀的分离物与残余的水相或上清液分离。PMM可以在湿的状态下使用，也可以通过任何适宜的技术，如喷雾干燥、冷冻干燥或真空转鼓式干燥等加以干燥，形成干燥的PMM。干燥的PMM具有高蛋白质含量，超过约100wt％的蛋白质(按N x6.25)，且基本上是非变性的(按差示扫描量热法测定)。当采用Murray II的方法时，从含脂肪的油料种子粗粉获得的干燥PMM分离物中残留脂肪的含量也较低，低于约1wt％。
从PMM形成和沉淀步骤中产生的上清液中含有大量的、在稀释步骤中没有沉淀的卡诺拉蛋白质，对上清液进行处理以从中回收卡诺拉蛋白质分离物。稀释步骤中(除去PMM之后)的上清液可以进行浓缩，以增加其中的蛋白质浓度。这种浓缩使用任何适宜的选择性膜技术，如超滤法进行，该技术使用具有适当截止分子量(允许低分子量的分子，包括盐和其他从蛋白质原料中提取的非蛋白性低分子量物质，通过膜，而截止溶液中的卡诺拉蛋白质)的膜而实施。根据不同的膜材料和构型，可使用截止分子量为约3000～10000道尔顿的超滤膜。通过这种方式对上清液的浓缩还减少了干燥(以回收蛋白质)所需的液体体积。干燥前，上清液通常浓缩至蛋白质含量为约100g/L～400g/L的浓度，优选约200g/L～300g/L。如上述关于蛋白质溶液浓缩步骤的描述，所述浓缩操作可在任何适宜的批量模式或在连续操作中实施。
根据本发明的另一实施方案，在干燥前，用水对浓缩的上清液实施渗率步骤。使用约2～约20体积的渗滤液，优选约5～约10体积的渗滤液实施所述渗滤。在渗滤操作中，通过流经具有渗透物的膜可从浓缩的上清液中除去更多量的酚类化合物和可见颜色。可以实施渗滤操作直至在渗透物中无法再将更多量酚类化合物和可见颜色除去。所述渗滤可采用分子量截至为约3000～约50,000道尔顿，优选约5000～约10,000道尔顿的膜(根据不同的膜材料合构型)来实施。
根据本发明的该实施方案的一个方面，渗滤介质中可存在抗氧剂。抗氧剂可以是任何适宜的食品级抗氧剂，例如亚硫酸钠或维生素C。渗滤介质中所使用的抗氧剂的量依赖于所使用物质，且可在约0.01～约1wt％，优选约0.05wt％附近变化。抗氧剂能够抑制卡诺拉蛋白质分离物浓缩液中存在的酚类化合物的氧化。
浓缩上清液可以湿的形式进行使用或可经任何适宜的技术，例如喷雾干燥、冻干或真空转鼓式干燥而被制为干燥形式从而进一步提供卡诺拉蛋白质分离物。所述进一步的卡诺拉蛋白质分离物具有高蛋白质含量，超过约90wt％，优选至少约100wt％蛋白质(按N x 6.25计算)且为基本上未变性的(按差示扫描量热法测定)。
如果需要，至少可在干燥组合的蛋白质流之前通过任何适宜的技术将部分湿PMM与至少部分浓缩的上清液混合以提供根据本发明的一个实施方案的组合的卡诺拉蛋白质分离物组合物。选择混合在一起的蛋白质物质的相对比率以提供具有2S/7S/12S蛋白质所需图谱的所得卡诺拉蛋白质分离物组合物。可选地，干燥的蛋白质分离物可按任何所需比例组合以在混合物中提供任何所需特定2S/7S/12S蛋白质图谱。组合的卡诺拉蛋白质分离物组合物具有高蛋白质含量，超过约90wt％，优选至少约100wt％蛋白质(按N x 6.25计算)且为基本上未变性的(按差示扫描量热法测定)。
在另一可选的过程中(其中仅部分浓缩上清液与仅部分PMM混合并将所得混合物干燥)，浓缩上清液的残余部分与PMM的任何残余部分同样的干燥。此外如上述，干燥的PMM和干燥的上清液还可以任何需要的相对比例而被混合干燥。
通过用该方法进行操作，可回收大量卡诺拉蛋白质分离物，其形式为干燥的PMM，干燥的上清液以及源自PMM的卡诺拉蛋白质分离物与源自上清液的卡诺拉蛋白质分离物以多种重量比的干燥的混合物(重量比通常为约5∶95～约95∶5)，其可以是获得基于组合物中2S/7S/12S蛋白质的不同比例的不同功能特性和营养特性所需要的。
根据本发明的另一实施方案，可对源自PMM的卡诺拉蛋白质分离物和源自上清液的卡诺拉蛋白质分离物进行处理以除去其递送颜色的成分。所述处理可适宜地采用酚类化合物和/或可见着色物的水可混合性有机溶剂与水混合来实施。
因为水可混合性有机溶剂可以是醇。优选醇和水的混合物，其体积比通常为约2∶1～约1∶2，优选1∶1.通常在室温下，将卡诺拉蛋白质分离物以约5～约25％w/v，优选约8～约23％w/v的量分散于溶剂混合物中。可将卡诺拉蛋白质分离物浆体混合约30～约60分钟，优选约30分钟。提取期后，将浆体沉淀，例如通过离心，然后回收卡诺拉蛋白质分离物。重复提取(如有需要)直至不能再除去其它酚类化合物和/或可见的着色物。可将卡诺拉蛋白质分离物分散在醇，例如乙醇中，以便将水和分离物分离，然后将分礼离物分离并干燥。
实施例
实施例1
该实施例显示了不同参数对蛋白质提取和蛋白质溶液颜色的影响
实施一系列实验过程，其中在20℃下，将37.5g商品化卡诺拉粗粉(AL-016)与包含所需浓度的NaCl的水在所需pH下混合，所得粗粉浓度为7.5％w/v。使用的氯化钠浓度为0、0.05、0.10、0.15和0.25M，使用的pH值为pH6.3、8.0、9.8和11.0。在60分钟提取期间，每10分钟取大约30mL提取物样品，然后将其以10,000×g离心5分钟。在提取期结束时分析每一样品的上清液的蛋白质浓度。将整个批料以10,000×g离心15分钟，采用0.45μM微滤器将上清液真空过滤。分析过滤的上清液的蛋白质含量和游离酚类化合物浓度(330nm吸光度)。
采用Amicon 8400装置用10,000截至分子量的膜以浓缩系数4对取自澄清的上清液的100ml小分实施超滤。测定渗余物和集合的渗透物的蛋白质浓度和A330吸光度。采用150mL具有与提取所使用的相同盐浓度和相同pH的溶液，以渗滤体积6对超滤液实施渗滤(DF)。在渗滤结束时，分析来自渗滤的渗余物和集合的渗透物的蛋白质浓度和A330。
然后将最终渗余物的等分经过包含五种不同吸附剂的柱，再次检测所得蛋白质溶液的蛋白质浓度和A330颜色。吸附剂是AmberliteXAD-16 HP(多聚吸附剂)，Amberlite SF120NA(阳离子交换剂)，Polyclar Super R(聚乙烯吡咯烷酮)，Silica gel(28～200目)和颗粒活性炭(食品级)。
从提取实验中得到的数据显示30分钟的提取时间即足以从粗粉中提取所有可提取的蛋白质。超过30分钟，在任何检测的pH或盐水平均未见提取出的蛋白质的显著增加。下述表I显示了在各pH和盐水平所获得的提取出的蛋白质的量
表I各pH和盐水水平60分钟提取出的蛋白质(g/L)
下述表II～VI显示了作为时间函数的盐浓度在多个pH水平对提取出的蛋白质(量计为g/L)的影响
表II
表III
表IV
表V
表VI
如这些表中所示，在实施的试验中，提取在各个盐水的pH越高平均产生的蛋白质含量越高，而增高盐含量超过0.05M时未增加蛋白质溶解度不再增加。
下述表VII显示了在各pH和盐水平提取出的蛋白质的330nm吸光度
表VII
如表VII中所示，在0.1M，0.15M和0.25M的提取中，在pH9.8下出现提取的A330颜色的降低。在该pH下，颜色在视觉上比其它pH值时的暗，且不存在蛋白质含量的相应降低。如上述，这些提取的蛋白质含量经pH9.8和pH11.0而持续升高。
下述表VIII显示了超滤后和渗滤前的蛋白质的330nm吸光度，而表IX显示了渗滤后蛋白质溶液的330nm吸光度。如这些表所示，在每个过程中，渗余物在经过渗滤后的A330较低。
表VIII渗滤前的渗余物A330
表IX渗滤后的渗余物A330
下述表X显示了采用渗滤获得的A330降低百分数。
表X经渗滤的A330的降低百分数
如表X中所示，UF/DF后，A330值的最大降低在以pH6.3、0.1M的提取中得以实现。在所测试的五个不同的盐水平中，除其中一个外pH6.3下的提取获得最低的A330值。
下述表XI显示考虑了最终渗余物的不同蛋白质浓度的A330/g/L蛋白质比例。以这一比例，由数值低的结果所示的低A330和高蛋白质含量的结果是最令人期望的。
表XI渗滤后渗余物的A330/g/L
如表XI中所示，在所实施的实验中，当考虑A330与蛋白质的比例时，对每一检测的pH水平来说，最佳的结果来自0.25M盐水组分，而全部最低的A330/蛋白质比例来自pH8.0的0.25M条件下的提取。
来自超滤和渗滤的渗透物A330数据(未显示)的检测显示了在比pH9.8和11.0更低的两个pH水平能从渗透物中冲洗出更多的A330。
在吸附剂的测试中，在pH为6.3和8.0时，Polyclar降低了渗余物的游离酚类化合物(A330)而在吸收步骤后蛋白质未出现丢失。然而，pH9.8和11.0时的Polyclar不能回收显著量的游离酚类化合物。Amberlite XAD在大多数情况下降低了A330(在高pH下实施)，当蛋白质在几乎每个情况下均有丢失。
在测试的其它吸附剂中，硅胶在大多数情况下不能降低A330，其基本通常会使样品混浊，而导致较高的A330读数。Amberlite SF120在较低的pH水平表现出A330的一些降低，但在较高pH水平不能再次表现出有效性，其在多种情况下表现出蛋白质的显著丢失。在通过吸附剂后，这些样品也出现一些沉淀。
颗粒活性炭(GAC)在较低pH水平时能良好地降低渗余物的A330，但在pH9.8和11.0时不能有效地降低A330。GAC在大多数测试中也表现出一些蛋白质丢失。因为存在残余碳，故已经通过GAC的样品在处理后必须用0.45μM滤器进行过滤。
实施例2
本实施例举例说明加入抗氧化剂对提取步骤的影响。
重复实施例1的步骤，其中在pH8.0和pH6.3下，于加入维生素C的0.1M盐中进行提取，用氦对提取介质换气以除去99％的溶解氧。同样将A420吸光度作为检测可见颜色进行测定。
下述表XII显示了提取数据
表XII提取数据
如表XII所示，在提取中使用维生素C降低了如A420所示的可见颜色。低水平的维生素C(0.05％)能导致提取A420或可见颜色减少两倍以上。
下述表XIII显示了渗滤渗余物A330和A420读数
表XIII渗余物A330和A420读数
如表XIII所示，在渗滤后仍能反映出提取物中由维生素C导致的A420降低。来自用维生素C提取的渗余物的A420低于提取中不存在维生素C的渗余物。
表XIV显示了Polyclar对渗余物的A330和A420的影响
表XIV
如表XIV中所示，即使是在用吸附剂处理后，仍存在由提取中所使用的维生素C导致的A420降低。Polyclar降低了每个样品的A420，但包含维生素C的两个样品低于不含维生素C的对照。
实施例3
该实施例也例示了盐浓度和pH对采用抗氧剂的提取的影响。
除了在提取步骤开始前将0.5g(0.1％)亚硫酸钠(Na2SO3)加入卡诺拉油料种子粗粉提取液之外，该实施例是实施例1的重复。除了渗滤体积值为5之外，所有其它使用的参数与实施例1中的一样。
下述表XV.1～XV.5显示了在每一pH和盐水平获得的蛋白质的量
表XV.1用0.0M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)实施的提取率
表XV.2用0.05M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)实施的提取率
表XV.3用0.10M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)实施的提取率
表XV.4用0.15M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)实施的提取率
表XV.5用0.25M NaCl和0.1％Na2SO3(g/L)实施的提取率
如这些表中所示，提取在大多数实施过程在约30分钟时达到平衡。当不加盐时，随着pH升高，提取的蛋白质增加。在pH低于8.0时pH的作用显著低于超过9.8的高pH下的作用(表XV.1)。以低水平(低于0.10M)加入盐能显著增加在pH6.3和8.0下的蛋白质可提取性，但低盐浓度浓缩在9.8或11.0的较高pH水平无助于蛋白质提取(表XV.2和XV.3)。
下述表XVI显示了pH和氯化钠溶液浓度对蛋白质提取物的游离酚含量(A330吸光度)的影响
表XVI pH和NaCl浓度对蛋白质提取物(用Na2SO3)的A330影
响
如表XVII中所示，随着将pH升高至pH9.8，A330的值显示出逐渐降低，尽管蛋白质浓度在该范围内还在升高。
当pH升高时，提取物的颜色在视觉上变的较暗。盐浓度对颜色仅有次显著影响。
下述表XVII.1到XVII.4显示了pH和NaCl浓度对渗余物(表XVII.1)和来自超滤的渗透物(表XVII.2)的A330，以及对渗余物(表XVII.3)和来自滤液的渗透物(表XVII.4)的A330的影响。
表XVII.1 pH和NaCl浓度对来自超滤(用Na2SO3)的渗余物的
A330的影响
表XVII.2 pHClNaCl浓度对来自超滤(用Na2SO3)的渗透物的A330
的影响
表XVII.3 pH和NaCl浓度对来自渗滤(用Na2SO3)的渗余物的A330
的影响
表XVII.4 pH和NaCl浓度对来自渗滤(用Na2SO3)的渗透物的A330
的影响
由于超滤将提取物中的蛋白质浓缩了四次，因此渗余物在视觉上非常暗，且其A330读数高于提取物，pH8.0时0.0 NaCl的情况除外(表XVII.1)，但后者可能是异常的结果。与UF前初始提取相似的，最小的A330出现在pH9.8时，其不能得到上述关于实际可见颜色暗度的理由的支持。在A330进行检测，如渗透物中高A330所示，UF从提取物中回收了大量的酚类化合物(参见表XVII.2)。
从表XVII.3中，可以看出渗滤渗余物的A330读数远低于UF渗余物(表XVII.1)。虽然DF渗透物(表XVII.4)的A330度数不与UF渗透物的一样高(表XVII.4)，但尽管如此DF能导致大量残余酚类化合物的更进一步的除去。通过渗滤的该进一步的除去酚类化合物导致DF渗余物的A330(表XVII.3)远低于UF渗余物中的A330(表VII.1)。
下述表XVIII.1～XVIII.4显示了吸附剂和pH对渗余物A330的影响
表XVIII.1吸附剂和pH对来自渗余物(0.05M NaCl和0.1％
Na2SO3)的A330的影响
表XVIII.2吸附剂和pH对来自渗余物(0.10M NaCl和0.1％Na2SO3)
的A330的影响
表XVIII.3吸附剂和pH对来自渗余物(0.15M NaCl和0.1％Na2SO3)
的A330的影响
表XVIII.4吸附剂和pH对来自渗余物(0.25M NaCl和0.1％Na2SO3)
的A330的影响
如表XVIII.1～XVII.4所示，在低pH(＜9.8)时，Polyclar(在所有测试的吸附剂中)降低最终渗余物中A330读数特别有效。如表XVIII.1所示，降低的A330值可高达40％。
虽然其它吸附剂也能在pH和盐浓度的特定条件下降低A330读数，但与Polyclar相比，其效果不甚明显。但使用pH9.8时，Polyclar降低A330的有用性较小。
下述表XVIII.5～XVIII.8显示了吸附剂对渗余物中蛋白质浓度(g/L)的影响
表XVIII.5吸附剂和pH对来自渗余物(0.05M NaCl和0.1％
Na2SO3)的蛋白质浓度的影响
表XVIII.6吸附剂和pH对来自渗余物(0.10M NaCl和0.1％Na2SO3)
的蛋白质浓度的影响
表XVIII.7吸附剂和pH对来自渗余物(0.15MNaCl和0.1％Na2SO3)
的蛋白质浓度的影响
表XVIII.8吸附剂和pH对来自渗余物(0.25M NaCl和0.1％Na2SO3)
的蛋白质浓度的影响
如表XVIII.5～XVIII.8所示，所有测试的吸附剂在盐和pH的所有组合下均对渗余物中的蛋白质浓缩具有相当的惰性，即使通过超滤将蛋白质高度浓缩。
实施例4
该实施例描速了使用较低水平亚硫酸钠和净化提取的影响。
采用Polycla作为吸附剂以较低水平的亚硫酸钠(0.05wt％Na2SO3)于pH8.0将实施例3的步骤重复实施3次。检测A420以及A330。
在另一组实验中，在提取前和提取其间也用氦气对包含0.05wt％Na2SO3的提取液实施净化。
下述表XIX.1显示了这些改变对蛋白质提取的影响
表XIX.1 pH8.0的条件下蛋白质提取(g/L)
如表XIX.1所示，在全部三个加入盐的水平，当使用降低量的亚硫酸钠时，提取物中蛋白质浓度增加了约40wt％。较高的盐浓度导致较高的蛋白质浓度。氮净化对蛋白质提取无作用。
表XIX.2显示了这些改变对A330颜色的影响
表XIX.2提取物在330nm的吸光度
如表XIX.2所示，Na2SO3的降低未显著影响提取物的A330。虽然氦净化除去了99％的溶解氧，但提取物的吸光度在330nm或420nm均未增高(下表XIX.3)
表XIX.3提取物在420nm的吸光度
下述表XX显示膜处理对渗余物的A330和A420的影响
表XX-膜处理对渗余物的A330和A420的影响
*采用氦净化
如表XX所示，渗滤基本上除去了提取物中的有色成分。最终渗余物的A330和A420读数均约为原始提取物的读数的一半。氦净化对A330或A420值无影响.
下述表XXI显示了Polyclar对渗余物的A330和A420的影响
表XXI Polyclar对A330和A420的影响
*括号内的数字是降低百分数
**采用氦净化
实施例5
该实施例例示采用抗氧剂和渗滤从商业化卡诺拉粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物。
在16℃下，将150kg商品化卡诺拉粗粉(高温焙烤粗粉)加入包含0.5kg(0.05wt％)维生素C的1000L 0.15M NaCl溶液中，搅拌30分钟以形成蛋白质含量为20.2g/L的蛋白质水溶液。移出卡诺拉粗粉残渣并在真空过滤带上清洗。产生的蛋白质溶液通过离心使之澄清，产生1040L蛋白质含量为14.6g/L的澄清蛋白质溶液。
利用截止分子量为5000道尔顿的膜，通过超滤系统浓缩使蛋白质提取液体积减小至45L。然后采用截止分子量为5000道尔顿的膜以包含0.05wt％维生素C的450L 0.15M NaCl溶液对蛋白质提取液进行渗滤使其终体积为44L，蛋白质含量为225g/L。
将30℃的浓编和渗滤的溶液以1∶10稀释到4℃的水中。立即形成白色云状蛋白质微胶粒，并使其沉淀。移去上层的稀释用水，从容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的团块物质(PMM)，将其干燥。干燥的蛋白质的蛋白质含量为103.2wt％(N x 6.25)d.b。
利用截止分子量为5000道尔顿的膜，通过超滤系统将620L来自微胶粒形成的上清液的体积减小至30L。然后利用截止分子量为5000道尔顿的膜，通过超滤系统用100L水对浓缩的上清液进行渗滤，使其终体积为27L，蛋白质含量为121.8g/L。
将浓缩的和渗滤的溶液干燥。干燥的蛋白质的蛋白质含量为100.8wt％(N x 6.25)d.b。
采用Minolta(CR-310)比色仪评价源自PMM的卡诺拉蛋白质分离物(CPI)样品和源自上清液的卡诺拉蛋白质分离物样品的亮度(L)和色度。在实验室空间内，其值在0～100之间移动，100表示白色而0表示黑色。色品坐标(a和b)均具有最大值+60和-60，+a为红色方向，-a为绿色方向，+b为黄色方向而-b为蓝色方向。
下述表XXII显示了所得结果
表XXII
与采用本方法但省略了加入维生素C(作为抗氧剂)和渗滤步骤(数据未给出)而制备的分离物相比，卡诺拉蛋白质分离物表现出较亮(L)和较浅的黄色(b)。
实施例6
该实施例例示温度对来自低温焙烤的粗粉和其它脱溶剂的粗粉的蛋白质提取物的颜色的影响。
将75g(a)在低温100℃焙烤的(LT粗粉)或(b)已经在20℃气体脱溶剂的(Marc粗粉)卡诺拉油料种子粗粉样品在室温或室温(RT)、55℃、60℃和65℃下加入500mL 0.15M NaCl溶液的样品中，搅拌30分钟，同时保持温度基本上恒定，产生蛋白质水溶液。在5、10、15、20和30分钟取蛋白质水溶液的样品进行分析。通过10,000×g离心5分钟分离粗粉淤渣并将其冻干。
测定各种蛋白质溶液样品的A330和A420吸光度。如上所述，A330UV吸光度是溶液中酚类化合物浓度的指示物，而A420吸光度是对试剂颜色更直接的检测。下述表XXIII和XXIV中列出了各种样品的数据
表XXIII-低温粗粉的提取物的吸光度读数
表XXIV-Marc粗粉的提取物的吸光度读数
如表XXIII和XXIV所示，对每一测试的粗粉类型来说，提高提取温度对提取的蛋白质溶液的A330没有显著的影响，但在较高温度时出现A420读数的轻微增加。
实施例7
该实施例显示了特定参数对来自特定卡诺拉油料种子粗粉蛋白质提取物的颜色的影响。
在第一组实验中，将50g卡诺拉油料种子粗粉样品，该粗粉已经(a)在低温100℃焙烤(LT粗粉)，或(b)已经在20℃气体脱溶剂(Marc粗粉)在室温(20℃)下加入500mL 0.05 M或0.10M NaCl溶液的样品中，搅拌15分钟。5000×g离心浆体10分钟以除去过剩的粗粉淤渣。
在第二组实验中，首先将未加盐的500mL水在电热板搅拌器上加热至60℃。然后加入50g卡诺拉油料种子粗粉样品，该粗粉已经(a)在低温100℃焙烤(LT粗粉)或(b)已经在20℃气体脱溶剂(Marc粗粉)，搅拌15分钟，同时保持温度。5000×g离心10分钟将提取物与粗粉淤渣分离。
测定各种蛋白质溶液A330和A420的吸光度和蛋白质浓度。下述表XXV.1和XXV.2列出所得结果
表XXV.1提取物的吸光度读数
如表XXV.1和XXV.2中所得结果所示，蛋白质浓度增加，A330值增加，而颜色亮度(如A420所示)不随蛋白质浓度发生显著改变，这与可见观测结果一致。这些结果显示，随著较高的蛋白质产率与比低温焙烤粗粉相比，预期气体脱溶剂的粗粉中得到更亮的产物。
实施例8
该实施例显示了卡诺拉蛋白质分离物的溶剂提取对产物颜色的影响。
从三个分离过程中产生源自PMM的卡诺拉蛋白质分离物的混合物，所述源自PMM的分离物为D29-02A C300(57.9wt％)，D24-02AC300(34.7wt％)和D11-02A C300(7.4wt％)(复合物6)。此外，从三个分离过程中产生源自上清液的分离物的混合物，所述源自上清液的分离物为E29-02A C200(18.7wt％)，D29-02A C200(40.1wt％)和E14-02A C200(41.2wt％)(复合物7)。
制备各卡诺拉蛋白质分离物所使用的的具体过程如下
在室温下，“a”kg商品化卡诺拉粗粉加入“b”L 0.15M NaCl溶液中，搅拌30分钟以形成蛋白质含量为“c”g/L的蛋白质水溶液。移出卡诺拉粗粉残渣并在真空过滤带上清洗。产生的蛋白质溶液通过离心使之澄清，产生“d”L的蛋白质含量为“e”g/L的澄清蛋白质溶液。
利用截止分子量为“h”道尔顿的膜，通过超滤系统的浓缩将“f”L等分的蛋白质提取液的体积减小至“g”L。产生的浓缩蛋白质溶液中蛋白质的含量为“i”“g/L。
温度为“j”℃的浓缩溶液用4℃的水稀释“k”倍。白色云状的蛋白质微胶粒会立即形成，并使其沉淀。移出上层稀释用水，从容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的团块物质(PMM)，提取的蛋白质产量为“1”wt％。干燥的PMM来源的蛋白质的蛋白质含量为“m”％(Nx6.25)d.b。将产物命名为“n”。
下述表XXVI中列出了参数“a”至“m”的值
表XXVI
利用截止分子量为“o”道尔顿的膜，通过超滤将移取的稀释用水的体积减小，使其蛋白质浓度为“p”g/L。将浓缩液干燥。从上清液中回收更多的蛋白质，蛋白质总回收率为提取的蛋白质的“q”wt％。形成的干燥蛋白质的蛋白质含量为“r”％(Nx6.25)d.b。
将产物命名为“s”。下述表XXVII中列出了参数“0”至“r”的值
表XXVII
将1.4kg复合物6分散在3L乙醇的混合物中(变性的85％ 乙醇/15％甲醇，VWR Canlab D和3L反渗透(RO)纯水)。采用顶置式搅拌器将混合物搅拌30分钟。通过将样品批量以8000g离心5分钟而从大量液体中分离出固体物质。
然后将片状沉淀物在另外的3L乙醇和3L RO水中搅拌30分钟而被再次分散和提取。再次离心(8000g/5min。)，收集固体样品。然后将片状沉淀物在4L乙醇中分散以便从样品中除去水。通过离心(8000g/5min。)收集固体物质然后再次分散在4L新乙醇中。
再次离心(8000g/5min。)，收集固体样品。打碎片状沉淀物，在焙烤片上展开，置于通风橱中干燥。
使用分散于4.2L乙醇和1.8L反渗透纯水的混合物中的1.4kg复合物7重复该过程。将片状沉淀物分散于4.2L乙醇和1.8L反渗透纯水的新的混合物中。
通过HPLC分析所得蛋白质粗粉末和溶剂提取样品的总蛋白质含量。还分析了蛋白质粗粉末的含水量。还采用分光光度计对溶剂提取样品进行检测，以给出其酚含量(330nm吸光度)和可见颜色(420nm吸光度)的指示。Minolta CR-310颜色计量器评估干燥的蛋白质产物的颜色。
乙醇/水提取的复合物6的回收率为86wt％，而复合物7的回收率为80wt％。产物的损失是由于在提取溶剂中的溶解性，而下述表XXVIII给出溶剂提取物的蛋白质含量。
表XXVIII溶剂提取物的蛋白质含量
其它损失是由于处理样品时的材料丢失。
下述表XXIX中列出了所得的颜色读数
表XXIX提取前和提取后复合物样品的颜色读数
如表XXIX中的数据所示，对复合物6和复合物7来说，卡诺拉蛋白质分离物的提取导致亮度(L)增加，“a”值降低和“b”值降低。L值增加意味着产物更白和黑色更少。“a”值降低对应于颜色由红色转变为绿色，而“b”值的降低对应于颜色由黄色转变为蓝色。样品红色和黄色的减少指示了酚类化合物和/或其反应产物的除去。
下述表XXX中通过了溶剂提取的吸光度读数
表XXXI-溶剂提取的吸光度读数
如表XXX所示，提取物带有轻微的颜色，这提示从蛋白质分离物中提取出着色物。
表XXHI显示了溶剂提取的蛋白质分离物蛋白质含量(Nx6.25.采用Leco FP52D氮测定仪测定的氮百分数值)和含水量
表XXXI-溶剂提取的蛋白质分离物的特性
如表XXXI所示，溶剂提取的产物的湿度低且具有能使产物被分类为分离物的足够高的蛋白质含量。
实施例9
该实施例例示抗氧剂和吸附剂在卡诺拉蛋白质分离物制备中的使用。
将150kg已经过低温(100℃)脱溶剂的商品化卡诺拉油料种子粗粉加入1000L 0.15M NaCl溶液中，在21℃室温下搅拌30分钟。混合15分钟后，在浆体中加入0.05wt％(500g)维生素C作为抗氧剂。
移出卡诺拉粗粉残渣并在真空过滤带上清洗。产生的蛋白质溶液通过离心使之澄清，产生953.5L蛋白质含量为23.9g/L的澄清蛋白质溶液。该溶液的330nm UV吸光度为61.2。
将21.2kg(2.2wt％)Polyclar Super R加入953.5L的蛋白质溶液，使其在室温下混合1小时。随后，通过将蛋白质溶液分别通过除渣离心机，和然后的包含20和0.2μM滤片的压滤器而除去Polyclar。除去Polyclar后，收集842L卡诺拉蛋白质溶液，其蛋白质含量为19.9g/L，A330吸光度为33.2。因此可获得A330吸光度的显著下降，和蛋白质非常少的丢失。
然后利用截止分子量为5000道尔顿的膜，通过超滤系统将澄清溶液的体积浓缩至30L，其蛋白质含量为338.4g/L，A330为20.4。然后采用截止分子量为5000道尔顿的膜以包含0.05wt％维生素C的300L0.15M NaCl溶液对浓缩的蛋白质提取液进行渗滤。产生的29.0L浓缩和渗滤的卡诺拉蛋白质溶液的蛋白质含量为299.7g/L，A330为25.6。
与实施例1-3和5所示的结果相反，渗滤对A330的影响很小，这可能是因为在浓缩步骤之前Polyclar已经从卡诺拉蛋白质溶液中除去了大部分游离酚。
将31℃的浓缩和渗滤的溶液稀释到15体积6.4℃的水中。立即形成白色云状蛋白质微胶粒，使其沉淀2小时。移去上层的稀释用水，从容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的团块物质(PMM)(40.6kg)，将其喷雾干燥。干燥的蛋白质分离物的蛋白质含量为98.8wt％(N x 6.25)d.b。
利用截止分子量为5000道尔顿的膜，通过超滤系统浓缩将440L来自微胶粒形成的、蛋白质含量为13.3g/L上清液的体积减小至30L。然后利用截止分子量为5000道尔顿的膜，通过超滤系统用5体积的水对浓缩的上清液进行渗滤。所得溶液的蛋白质含量为161.0g/L，A330为10.8。
将浓缩的和渗滤的溶液干燥，干燥的蛋白质的蛋白质含量为95.6wt％(N x 6.25)d.b。
采用Mimolta R-310比色仪分析源自PMM的卡诺拉蛋白质分离物(CPI)样品和源自上清液的卡诺拉蛋白质分离物样品的亮度(L)和色度(a和b)下述表XLI显示了所得结果
下述表XXXII显示了所得结果
表XXXII
实施例10
该实施例例示抗氧剂和吸附剂在提取步骤中的应用。
Bench scale实验，其中将已在100℃下脱溶剂的商业化卡诺拉油料种子粗粉的样品用0.15M NaCl以15wt％的浓度提取30分钟。在以多种水平(即0.5wt％、1.0wt％、1.5wt％、2.0wt％、2.5wt％、3.0wt％、4.0wt％和5.0wt％)加入和不加入Polyclar Super R以及加入和不加入0.5wt％维生素C的情况下实施提取。提取后，离心溶液，然后分析酚类化合物含量(A330吸光度)，可见颜色(A420吸光度)和蛋白质含量。
存在和不存在维生素C的情况下所获得的结果分别示于表XXXIII和XXXIV中
表XXXIII
表XXXIV
如表XXXIII和XXXTV所列结果所示，存在Polyclar时，在存在和不存在维生素C的情况下均可获得A330和A420二者的降低。当在提取中不加入维生素C时，2.5％w/v浓度的Polyclar能实现在对照中检测到A330降低25％而A420降低11％。较高水平的Polyclar能进一步降低A330和A420值。提取期间存在维生素C，则当使用2.5％w/v Polyclar时可检测到A330降低12％而A420降低34％。存在或不存在Polyclar对溶液的蛋白质含量没有影响。
实施例11
该实施例例示乙醇冲洗卡诺拉油料种子粗粉对颜色的影响。
将10g脱壳卡诺拉油料种子粗粉的样品与100mL乙醇混合，使其在45℃，40℃和室温(用循环式水浴和加套管调节)下混合30分钟。
混合30分钟后，将粗粉/溶剂浆体经过滤器倾倒以分开粗粉和提取物。重复该步骤直至不能再除去颜色或直至A330和A420吸光度读数开始进入平台期。将来自每一溶剂冲洗/提取步骤的粗粉干燥，然后在室温下用0.15M NaCl蛋白质提取30分钟。
对每一提取样品检测提取液的UV吸光度。表XXXV，XXXVI和XXXVII显示了分别室温，40℃和45℃下完成的提取的A330和A420值
表XXXV
表XXXVI
表XXXVII
如该数据所示，较低温度下的溶剂不能除去与在40℃～45℃之间的温度一样度的颜色和酚类化合物，室温提取仅在6次提取后就停止了除去着色物，而较高温度下每一提取均能除去着色物直至第10次提取。
测定蛋白质提取液的蛋白质含量和330nm和420nm的吸光度，结果示于下述表XXXVIII中
表XXXVIII
如该表所示，通过用乙醇在40℃的预提取避免了蛋白质丢失同时除去了大约40％的酚类化合物和30％的A420吸收物质。
实施例12
该实施例例示采用乙醇粗粉提取来制备卡诺拉蛋白质分离物。
对11个600g等分的脱壳油料种子粗粉以粗粉和乙醇w/v比例为1∶5实施四次3L乙醇提取。提取在35℃下经30分钟完成。
混合30分钟后，使浆体沉淀，倾出上清液。对每一提取测定A330和A420的UV吸光度，检测对被提取粗粉的第一等分的第一次提取的蛋白质含量。
在第四次提取后，将粗粉在通风橱中于浅盘中展开，使其干燥过夜。在5.4kg干燥的经提取的粗粉用于50L批量提取之前，将整批经冲洗的粗粉在通风橱中经过超过一夜的时间进行脱溶剂。
随着对样品的每次提取，上清液的颜色发生渐进性变浅，而A330和A420降低。平均起来，可以发现A330降低了5倍而A420降低了6倍。下述表XXXIX和XL分别显示了不同提取的A420和A330的吸光度值
表XXXIXA420吸光度
表XLA330吸光度
将5kg经乙醇提取的粗粉加入50L 0.15M NaCl溶液中，在20℃室温下搅拌30分钟，15分钟后加入0.05wt％维生素C作为抗氧剂。
移出卡诺拉粗粉残渣并在真空过滤带上清洗。产生的蛋白质溶液经20μm袋滤器过滤，然后6500rpm离心5分钟使之澄清，产生39.6L蛋白质含量为23.7g/L的澄清蛋白质溶液。
然后利用截止分子量为10,000道尔顿的膜，通过超滤系统将37.55L澄清蛋白质溶液的体积浓缩至3L。然后采用截止分子量为10,000道尔顿的膜以包含0.05wt％维生素C的24L(＝8渗余物体积)0.15M NaCl溶液对浓缩的蛋白质溶液进行渗滤。产生的3L浓缩和渗滤的卡诺拉蛋白质溶液的蛋白质含量为184g/L。
将30℃的浓缩和渗滤的溶液稀释到30体积4℃的水中。立即形成白色云状蛋白质微胶粒，使其沉淀。移去上清液，从容器的底部回收沉淀的、粘稠的、粘性的团块物质(PMM)(5.78kg)，将其喷雾干燥。干燥的蛋白质分离物的蛋白质含量为101.2wt％(N x 6.25)d.b。
利用截止分子量为10,000道尔顿的膜，通过超滤系统浓缩将26L来自微胶粒形成的上清液的体积减小至3L。然后利用截止分子量为10,000道尔顿的膜，通过超滤系统用6L的水对浓缩的上清液进行渗滤。
将浓缩的和渗滤的溶液干燥，干燥的蛋白质的蛋白质含量为101.3wt％(N x 6.25)d.b。
采用Minolta R-310比色仪分析源自PMM的卡诺拉蛋白质分离物(CPI)样品和源自上清液的卡诺拉蛋白质分离物样品的亮度(L)和色度(a和b)下述表XLI显示了所得结果
表XLI
这些产物的“a”和“b”值非常小，这提示红色和黄色水平相对较低。
总结
综上所述，本发明提供了通过在通过在分离制备期间实施目的在于除去能引起着色的组分，抑制能引起着色的组分的氧化和除去着色物的一个或多个步骤来回收颜色淡化的卡诺拉蛋白质分离物。在本发明的范围之内可以进行修改。
权利要求
1.一种制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，其中
处理卡诺拉种子，产生卡诺拉蛋白质粗粉，
提取卡诺拉蛋白质粗粉，产生蛋白质水溶液，
浓缩蛋白质水溶液，和
从浓缩的蛋白质水溶液中回收卡诺拉蛋白质分离物，其改进在于在所述方法中实施至少一个最终得到颜色淡化的卡诺拉蛋白质分离物的加工步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一个加工步骤包括加工所述种子。
3.权利要求2的方法，其中所述种子的加工包括所述种子中黑芥子酶的失活。
4.权利要求1的方法，其中所述至少一个加工步骤包括提取步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述提取步骤采用下述的至少一种提取，即抗氧剂存在下的卡诺拉蛋白质粗粉的提取，低温脱溶剂的粗粉的提取，气体脱溶剂的粗粉的提取，以及用至少一种着色成分吸收剂处理卡诺拉蛋白溶液来实施。
6.权利要求1的方法，其中所述至少一个加工步骤包括浓缩步骤。
7.权利要求6的方法，其中在浓缩步骤之后是浓缩的蛋白质水溶液的渗滤。
8.权利要求1的方法，其中所述至少一个加工步骤包括碾碎。
9.权利要求8的方法，其中所述卡诺拉蛋白质粗粉经溶剂提取。
10.权利要求1的方法，其中所述至少一个加工步骤包括回收卡诺拉蛋白质分离物。
11.权利要求10的方法，其中所述卡诺拉蛋白质分离物经溶剂提取。
12.权利要求1的方法，其中通过将浓缩的含水溶液加至冷水中形成蛋白质微胶粒团，再从上清液中分离蛋白质微胶粒团，来从浓缩的蛋白质水溶液中回收所述卡诺拉蛋白质分离物。
13.权利要求12的方法，其中通过浓缩上清液，对浓缩的上清液实施渗滤，再从经渗滤的上清液中回收卡诺拉蛋白质分离物，由此加工所述上清液以从中回收另外的卡诺拉蛋白质分离物。
14.一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，该方法包括
(a)通过使用含抗氧剂的盐水溶液提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，形成pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，
(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，
(c)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，由此提供浓缩的蛋白质溶液，
(d)将经浓缩的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，
(e)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和
(f)从上清中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N×6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
15.权利要求14的方法，其中所述抗氧剂是亚硫酸钠或维生素C。
16.权利要求15的方法，其中所述抗氧剂存在于所述盐水溶液中，抗氧剂的量为约0.01～约1wt％。
17.权利要求14的方法，其中卡诺拉油料种子粗粉是已经在低于约50℃的温度下经过气体脱溶剂除去残余的油提取剂的卡诺拉油料种子粗粉。
18.权利要求14的方法，其中卡诺拉油料种子是已经在低于约100℃的升高温度下经过脱溶剂除去残余的油提取剂的卡诺拉油料种子粗粉。
19.一种由卡诺拉油料种子粗粉制备卡诺拉蛋白质溶液的方法，包括
(a)用醇洗涤所述卡诺拉油料种子粗粉，
(b)提取经洗涤的卡诺拉油料种子粗粉，使经洗涤的卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，
(c)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，
(d)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中的蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，以提供浓缩的蛋白质溶溶液，
(e)将经浓缩的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，
(f)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和
(g)从上清中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N×6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
20.权利要求16的方法，其中所述的醇是乙醇。
21.权利要求19的方法，其中的洗涤步骤是通过下述方式实施的，即将卡诺拉油料种子粗粉以约1∶3～约1∶10w/v比例分散在溶剂中，在约15℃～约45℃的温度下将所得浆体混合约5～约60分钟，然后从浆体中分离洗涤的卡诺拉蛋白质分离物。
22.权利要求21的方法，其中所述浆液在约30～约75℃的温度下搅拌约15～约30分钟。
23.权利要求19的方法，其中实施多次所述洗涤直至无法再回收道酚类和/或无形着色剂。
24.权利要求19的方法，其中所述卡诺拉油料种子粗粉是已经在低于约50℃的温度下经过气体脱溶剂除去残余的油提取剂的卡诺拉油料种子粗粉。
25.权利要求19的方法，其中所述卡诺拉油料种子粗粉是已经在低于约100℃的升高温度下经过脱溶剂除去残余的油提取剂的卡诺拉油料种子粗粉。
26.一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括
(a)提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，形成pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，
(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，
(c)通过对蛋白质水溶液实施超滤提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，提供浓缩的蛋白质溶液，
(d)对浓缩的蛋白质溶液实施渗滤，
(e)将经渗滤的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，
(f)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和
(g)从上清中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N×6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
27.权利要求26的方法，其中使用约2～约20体积的渗滤液实施所述渗滤。
28.权利要求28的方法，其中使用约5～约10体积的渗滤液实施所述渗滤。
29.权利要求27的方法，其中使用pH为约5～约6.8的盐水溶液实施所述提取步骤，所述渗滤液是具有与所述提取步骤中所用溶液相同浓度和pH的盐水溶液。
30.权利要求27的方法，其中通过使用截留分子量为约3000～约50,000道尔顿的膜实施所述渗滤。
31.权利要求30的方法，其中所述膜的截留分子量为约5000～约10,000道尔顿。
32.权利要求27的方法，其中在至少部分所述渗滤步骤中，所述渗滤液包含抗氧剂。
33.权利要求32的方法，其中所述抗氧剂是亚硫酸钠或维生素C。
34.权利要求33的方法，其中所述抗氧剂的使用量为约0.01～约1wt％。
35.权利要求26的方法，其中使用pH为约5～约6.8且包含抗氧剂的盐水溶液实施所述提取步骤。
36.权利要求26的方法，其中用醇洗涤所述卡诺拉油料种子粗粉。
37.权利要求26的方法，其中干燥所述蛋白质微胶粒，用醇水溶液提取干燥的卡诺拉蛋白质分离物。
38.权利要求36的方法，其中通过超滤上清液对上清液进行浓缩以产生浓缩的上清液，并对经浓缩的上清液实施渗滤。
39.权利要求38的方法，其中使用约2～约20体积的渗滤液实施所述渗滤。
40.权利要求39的方法，其中使用约5～约10体积的水实施所述渗滤。
41.权利要求39的方法，其中通过使用截留分子量为约3000～约50,000道尔顿的膜实施所述渗滤。
42.权利要求39的方法，其中所述膜的分子量为约5000～约10,000道尔顿。
43.权利要求39的方法，其中在至少部分所述渗滤步骤中，所述渗滤液包含抗氧剂。
44.权利要求43的方法，其中所述抗氧剂是亚硫酸钠或维生素C。
45.权利要求44的方法，其中所述抗氧剂的使用量为约0.01～约1wt％。
46.权利要求26的方法，其中在所述稀释步骤前将所述经渗滤蛋白质溶液与吸色剂接触。
47.权利要求46的方法，其中所述吸色剂是聚乙烯吡咯酮。
48.权利要求47的方法，其中所述聚乙烯吡咯酮的使用量为约0.5～约6wt％。
49.权利要求48的方法，其中所述聚乙烯吡咯酮的使用量为约2～约3wt％。
50.权利要求26的方法，其中卡诺拉油料种子粗粉的制备通过灭活卡诺拉油料种子中的黑芥子酶和从经处理的油料种子中回收卡诺拉油以形成卡诺拉油料种子粗粉。
51.权利要求40的方法，其中将卡诺拉油料种子粗粉在低于约50℃的温度下经过气体脱溶剂除去残余的油提取剂。
52.权利要求50的方法，其中将卡诺拉油料种子在低于约100℃的升高温度下经过脱溶剂除去残余的油提取剂。
53.权利要求26的方法，其中在所述稀释步骤前，对所述经渗滤的蛋白质溶液实施巴氏消毒步骤。
54.权利要求53的方法，其中通过在约55℃～约70℃的温度加热经渗滤的蛋白质溶液约10～约15分钟实施所述巴氏消毒步骤。
55.一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括
(a)提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种于粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，
(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，
(c)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，形成浓缩的蛋白质溶液，
(d)将所述浓缩的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，
(e)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，
(f)将蛋白质微胶粒和上清液分离，
(g)干燥蛋白质微胶粒，得到以干重(N×6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％的诺拉蛋白质分离物，和
(h)用醇水溶液提取所述卡诺拉蛋白质分离物。
56.权利要求55的方法，其中所述醇水溶液是乙醇水溶液，其中乙醇∶水体积比为约2∶1～约1∶2。
57.权利要求55的方法，其中所述提取步骤是通过下述方式进行的，即将量为约5～约25wt％的卡诺拉蛋白质分离物分散在醇水溶液中，将所得浆体混合约30～约60分钟，然后从浆体中分离提取的卡诺拉蛋白质分离物。
58.权利要求55的方法，其中重复所述提取步骤直至从卡诺拉蛋白质分离物中无法再除去酚类和/或无形着色剂。
59.一种从卡诺拉油料种子粗粉中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括
(a)提取卡诺拉油料种子粗粉，使卡诺拉油料种子粗粉中的蛋白质溶解，产生pH为约5～约6.8的蛋白质水溶液，
(b)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，
(c)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，形成浓缩的蛋白质溶液，
(d)对浓缩的蛋白质溶液实施巴氏消毒，形成巴氏消毒的蛋白质溶液，
(e)将巴氏消毒的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，
(f)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和
(g)从上清液中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N×6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
60.权利要求59的方法，其中通过在约55℃～约70℃的温度加热浓缩的蛋白质溶液约10～约15分钟实施所述巴氏消毒。
61.权利要求60的方法，其中在约60℃～约65℃的温度加热所述浓缩的蛋白质溶液约10分钟。
62.一种从卡诺拉油料种子中制备卡诺拉蛋白质分离物的方法，包括
(a)加工卡诺拉油料种子，灭活油料种子所包含的黑芥子酶以制备经加工的油料种子，
(b)加工所述油料种子，从中除去卡诺拉油以制备卡诺拉油料种子粗粉，
(c)提取卡诺拉油料种子，使卡诺拉油料种子中的蛋白质溶解，形成pH为约5～约6.8的水溶液，
(d)将蛋白质水溶液和残余的油料种子粗粉分离，
(e)利用选择性膜技术提高所述蛋白质水溶液中蛋白质浓度，同时保持离子强度基本恒定，提供经浓缩的蛋白质溶液，
(f)将浓缩的蛋白质溶液在温度低于约15℃的冷水中稀释，在水相中形成离散的蛋白质微胶粒，
(g)使蛋白质微胶粒沉淀形成无定形的、粘性的、凝胶状、面筋样蛋白质微胶粒团，和
(h)从上清液中回收蛋白质微胶粒团，以干重(N×6.25)计，蛋白质微胶粒团的蛋白质含量为至少约90wt％。
63.权利要求62的方法，其中在所述提取步骤之前将卡诺拉油料种子粗粉在低于约50℃的温度下经过气体脱溶剂除去残余的油提取剂。
64.权利要求62的方法，其中在所述提取步骤之前将卡诺拉油料种子在低于约100℃的升高温度下经过脱溶剂除去残余的油提取剂。
全文摘要
在从卡诺拉油料种子回收蛋白质分离物过程中，实施抑制着色化合物，降低易于形成着色成分的物质的存在的步骤，获得较亮和较浅黄色的卡诺拉蛋白质分离物。
文档编号A23J1/14GK1688205SQ0381986
公开日2005年10月26日 申请日期2003年6月20日 优先权日2002年6月20日
发明者B·E·格林, L·徐, R·米拉诺瓦, K·I·塞加尔 申请人:伯康营养科学(Mb)公司