细胞周期阶段标志物的制作方法

专利名称：细胞周期阶段标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞周期阶段特异性标志物以及用于确定哺乳动物细胞中细胞周期不同阶段之间的转变的方法。
背景技术：
真核细胞分裂通过高度受控的包括称为G1、S、G2和M的连续阶段的细胞周期来进行。细胞周期或细胞周期控制的破坏可导致细胞异常或疾病状态诸如癌症，这起因于多种遗传改变，其将生长受限的细胞转化成了高度侵入性的细胞，它们对生长的正常控制没有应答。正常细胞到癌细胞的转变可通过DNA复制和DNA修复机制的正确功能的丧失而产生。所有分裂中的细胞都受控于许多控制机制，称为细胞周期关卡，其通过停滞异常细胞或诱导异常细胞的破坏来维持基因组完整。因此对细胞周期进展和控制的研究对于设计抗癌药物来说是有相当重要性的(Flatt，P.M.和Pietenpol，J.A.Drug Metab.Rev.，(2000)，32(3-4)，283-305；Buolamwini，J.K.Current Pharmaceutical Design，(2000)，6，379-392)。
细胞周期进展是通过许多细胞周期调节剂的规定时间和空间表达、定位以及破坏来严格控制的，它们在细胞周期期间呈现高度的动态性(Pines，J.，Nature Cell Biology，(1999)，1，E73-E79)。例如，在特定的细胞周期阶段，一些蛋白质从细胞核易位到细胞质，或者相反，以及一些蛋白质被迅速降解。要了解已知细胞周期控制成分和相互作用的细节，参见Kohn，Molecular Biology of the Cell(1999)，10，2703-2734。
细胞周期状态的准确确定是研究影响细胞周期或依赖于细胞周期位置的细胞过程的关键要求。这些测定在药物筛选应用中是特别至关重要的，其中i)需要直接或间接改变细胞周期进展的物质，例如用于作为潜在的抗癌治疗的研究；ii)检查候选药物对细胞周期进展的有害影响；和/或iii)怀疑试剂对特定细胞周期阶段的细胞是活性的或无活性的。
传统上，细胞群的细胞周期状态是通过流式细胞术确定的，其中使用荧光染料染色细胞核的DNA(Barlogie，B.et al，Cancer Res.，(1983)，43(9)，3982-97)。流式细胞术产生细胞DNA含量的定量信息，因此能够确定处于细胞周期的G1、S和G2+M期的相对细胞数量。然而，该分析是破坏性的非动态的过程，需要细胞群的连续取样来确定随时间变化的细胞周期状态。流式细胞技术的更多缺点涉及根据DNA含量间接的和推断性的确定细胞的细胞周期位置。因为细胞核的DNA含量在整个细胞周期以相当可预期的方式变化，即处于G2或M的细胞具有G1细胞两倍的DNA含量，处于S期进行DNA合成的细胞具有中间量的DNA，因此监测细胞在细胞周期不同阶段之间的相对分布是可能的。然而，该技术不能准确确定任何单个细胞的细胞周期位置，这是由于将细胞归于G2或M期的不确定性以及由于细胞群中细胞与细胞之间DNA含量的固有差异所导致的进一步的不准确，这可能排除了与细胞周期相邻期之间的边界处相接近的细胞之间的准确区分。此外，不同组织或生物的不同细胞类型之间的DNA含量和DNA染色的差异要求该技术对每种细胞类型进行优化，可能使得细胞类型之间或实验之间的直接数据比较复杂化(Herman，Cancer(1992)，69(6)，1553-1556)。因此流式细胞术适合于检查细胞群中细胞的整体细胞周期分布，但是不能用于监测单个细胞随时间变化的准确细胞周期状态。
EP 798386描述了用于分析异质细胞样品中存在的细胞亚群的细胞周期的方法。该方法使用的是用荧光标记的单克隆抗体连续温育样品以鉴别特异性结合核酸的特定细胞类型和荧光染料。这使得能够确定样品中存在的细胞亚群的细胞周期分布。然而，由于该方法利用了流式细胞术，因此它仅产生非动态数据，需要在暴露于所研究的试剂之后，在单独的细胞样品上进行连续测定来确定细胞群的细胞周期状态随时间的变化，以确定对细胞周期进展的影响。
许多研究者已经使用了需要将细胞固定或溶胞的常规报道酶来研究细胞周期。例如，Hauser&Bauer(Plant and Soil，(2000)，226，1-10)使用了β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)来研究植物分生组织中的细胞分裂，Brandeis&Hunt(EMBO J.，(1996)，15，5280-5289)使用了氯霉素乙酰转移酶(CAT)融合蛋白来研究细胞周期蛋白水平的变化。US 6048693描述了用于筛选影响细胞周期调节蛋白的化合物的方法，其中将报道基因的表达与控制元件连接，这些元件通过细胞周期蛋白或其它细胞周期控制蛋白起作用。在该方法中，报道基因产物的时间性表达是以细胞周期特异的方式被驱动的，作用于一种或多种细胞周期控制成分的化合物可以增加或降低表达水平。
US 6159691描述了源自细胞周期阶段特异性转录因子DP-3和E2F-1的核定位信号(NLS)，要求保护用于分析细胞周期进展的推定调节剂的方法。在该方法中，源自细胞周期阶段特异性转录因子DP-3和E2F-1的核定位信号(NLS)可用于分析化合物活性，该化合物用来增加或减少融合到可检测标记上的来自DP-3和E2F-1的特定NLS序列的核定位。
Jones et al(Nat Biotech.，(2004)，23，306-312)描述了有丝分裂的荧光生物传感器，其基于质膜靶向信号和融合到EYFP上的SV40大T抗原NLS。在整个细胞周期，报道基因都位于细胞核中，但是在有丝分裂期间、核膜分解和再形成之间易位到了质膜上。
WO 03/031612描述了DNA报道构建体以及用于确定活哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，其依靠细胞周期阶段特异性表达控制元件和破坏控制元件。
Gu et al.(Mol Biol Cell.，2004，15，3320-3332)最近已经研究了人DNA解旋酶B(HDHB)的功能，表明它在G1期基本在细胞核，在S和G2期基本在细胞质，DNA损伤诱导它位于核点，该核点模式需要HDHB活性，HDHB定位受CDK磷酸化控制。
上述方法都没有明确描述可被稳定整合到基因组中用于指示细胞周期的G1、S和G2期的传感器。因此，需要一种方法，它使得这些细胞周期阶段能够在单个活哺乳动物细胞中被非破坏性地确定，使得同一细胞能够随时间而被重复检测，以及使得能够研究对细胞周期具有潜在的期望或不期望影响的试剂的影响。也需要能够对多种试剂的这些影响进行平行评价的方法。
发明概述本发明描述了一种方法，它以规定的组合利用细胞周期控制机制的关键成分提供新的手段，以提供动态读数的非破坏性过程来确定个体活细胞的细胞周期状态。
本发明进一步提供蛋白质、DNA构建体、载体以及表达这些蛋白质的稳定细胞系，它们以细胞周期阶段特异性方式呈现出可检测报道分子的易位，其通过将报道信号直接连接到G1/S细胞周期阶段依赖性定位控制序列。这极大改善了确定细胞周期阶段状态的准确性，并使得能够连续临测单个细胞中的细胞周期进展。而且，已经发现可由细胞周期控制机制的功能元件分离并提取关键控制元件，这使得能够设计动态受控的细胞周期阶段报道分子，并能够与内源细胞周期控制成分一致地但是独立地进行操作，从而提供了用于监测细胞周期状态的手段，其不影响或干扰细胞周期的自然进展。
根据本发明的第一方面，提供了多肽构建体，其包括可检测的活细胞报道分子，该分子通过具有小于112,000道尔顿分子量的基团连接到至少一个细胞周期阶段依赖性定位控制元件，所述元件的定位在G1和S期期间改变，其中所述构建体在哺乳动物细胞中的易位表明细胞周期位置。
要理解的是，易位被定义为报道分子从一个亚细胞定位可检测地移动到另一个，典型地是从细胞核到细胞质或者相反。要进一步理解的是，当涉及报道分子时，术语“活细胞”定义了在活细胞中产生可检测信号的报道分子，或者诸如抗原性标志这样的报道分子，其在活细胞中表达并可在通过免疫学方法固定后被检测到，这样就适合用于成像系统中，诸如IN Cell Analyzer(GE Healthcare)。
合适地，所述基团具有小于100,000道尔顿的分子量。
合适地，基团具有小于50,000道尔顿的分子量。
合适地，基团具有小于25,000道尔顿的分子量。
合适地，基团具有小于10,000道尔顿的分子量。
合适地，基团具有小于1,000道尔顿的分子量。
合适地，基团具有小于700道尔顿的分子量。
合适地，基团具有小于500道尔顿的分子量。
优选地，基团是多肽。多肽基团应相对小，并且包括允许报道分子相对于细胞周期阶段依赖性定位控制元件具有柔性和/或能够旋转的氨基酸。更优选地，多肽基团是七肽。最优选地，所述七肽基团是甘氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-丝氨酸(GNGGNAS)。如上所述，在多肽中可使用允许报道分子相对于定位控制元件具有柔性和/或能够旋转的任何氨基酸。
合适地，细胞周期阶段特异性定位控制元件选自由Rag2、Chaf1B、Fen1、PPP1 R2、解旋酶B、sgk、CDC6或其基序组成的肽组，所述基序诸如解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)。已知解旋酶B引起不受控的DNA许可并可能在过量表达时对细胞存活有害。因此，优选地，细胞周期阶段依赖性定位控制元件是解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)。
已经报道和表征了人解旋酶B同源物(Taneja et al J.Biol.Chem.，(2002)，277，40853-40861)；核酸序列(NM 033647)和相应的蛋白质序列分别示于SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。报道证明在G1期间需要解旋酶活性来促进G1/S转变。Gu et al(Mol.Biol.Cell.，(2004)，15，3320-3332)已经表明，称为磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)的解旋酶B基因的小C末端区是由Cdk2/细胞周期蛋白E磷酸化的，含有NLS和NES序列。Gu et al(Mol.Biol.Cell.，(2004)，15，3320-3332)在用由CMV启动子表达的编码EGFP-βGal-PSLD融合物(在构建体中包括β-半乳糖苷酶(βGal)作为惰性基团以使整个融合蛋白在大小上类似于解旋酶B)的质粒瞬时转染的细胞上进行了研究。处于G1的细胞主要在细胞核中显示EGFP信号，而处于其它细胞周期阶段的细胞主要显示细胞质EGFP信号。这些研究者断定，在细胞周期的G1/S期转变前后，PSLD引导了报道分子从细胞核到细胞质的易位。
合适地，活细胞报道分子选自包括荧光蛋白、酶和抗原性标志。优选地，荧光蛋白源自Aequoria Victoria、Renilla reniformis或者水螅纲和珊瑚纲的其它成员(Labas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，(2002)，99，4256-4261)。更优选地，荧光蛋白是EGFP(BD Clontech)、Emerald(Tsien，Annu.Revs.Biochem.，(1998)，67，509-544)或者J-Red(Evrogen)。最优选地，荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Emerald和J-Red。
优选地，报道分子是诸如halo-tag(Promega)的酶报道分子。
合适地，报道分子是EGFP或J-Red，并且细胞周期阶段依赖性定位控制元件是PSLD。
合适地，报道分子是串联的(即呈现为串联重复)。
多肽构建体，包括SEQ ID No.5的氨基酸序列。
根据本发明的第二方面，提供了编码如上所述任何多肽构建体的核酸构建体。
合适地，所述核酸构建体额外包括并可操作地连接到并且受控于至少一个细胞周期非依赖性表达控制元件。
术语“可操作地连接”表示元件的排列使得它们与其预期目的一致地起作用，例如在启动子中起始转录，进行通过编码本发明报道分子的DNA序列。
合适地，表达控制元件在长期的时间段中控制转录，整个细胞周期的转录水平有限可变。优选地，表达控制元件是遍在蛋白C或CMVI/E启动子，它提供稳定细胞系生产所需要的长期转录。
优选地，核酸构建体包括遍在蛋白C启动子以及编码PSLD和EGFP或J-Red的序列。
任选地，核酸构建体包括CMV启动子以及编码PSLD和EGFP或J-Red的序列。
在本发明的第三方面，提供了包括如上所述任意核酸构建体的载体。合适地，所述载体是病毒载体或质粒。合适地，所述病毒载体是腺病毒载体或慢病毒载体。
任选地，载体额外包含在真核细胞中有功能的抗药性基因，优选在哺乳动物细胞中有功能的抗药性基因。
表达载体也可包含其它核酸序列，诸如聚腺苷信号、剪接供体/剪接受体信号、间插序列、转录增强子序列、翻译增强子序列等等。任选地，抗药性基因和报道基因可通过内部核糖体进入位点(IRES)(Janget al.，J.Virology，(1988)，62，2636-2643)可操作地连接，而不是由分开的启动子驱动两个基因。可以使用从Clontech商业获得的pIRES-neo和pIRES载体。
本发明的第四方面，提供了用如上所述的核酸构建体转染的宿主细胞。在其中引入了该构建体或含有这种构建体的表达载体的宿主细胞可以是任何能够表达该构建体的哺乳动物细胞。
可以使用本领域技术人员公知的技术将制备好的DNA报道分子构建体转染到宿主细胞中。这些技术可包括电穿孔(Tur-Kaspa et al，Mol.Cell Biol.(1986)，6，716-718)，基于磷酸钙的方法(例如Graham和Vander Eb，Virology，(1973)，52，456-467)，直接显微注射，基于阳离子脂质的方法(例如使用Superfect(Qiagen)或Fugene6(Roche)以及使用轰击介导的基因转移(Jiao et al，Biotechnology，(1993)，11，497-502)。用于将DNA构建体转染到细胞中的更多备选方法利用病毒的天然能力来进入细胞。这些方法包括的载体和转染方案是基于例如单纯疱疹病毒(美国专利5288641)、巨细胞病毒(Miller，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，(1992)，158，1)、痘苗病毒(Baichwal和Sugden，1986，于Gene Transfer，ed.R.Kucherlapati，New York，Plenum Press，p117-148)、以及腺病毒和腺伴随病毒(Muzyczka，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，(1992)，158，97-129)。
合适重组宿主细胞的例子包括HeLa细胞、Vera细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、U2OS、COS、BHK、HepG2、NIH 3T3 MDCK、RIN、HEK293以及其它体外培养的哺乳动物细胞系。优选宿主细胞是人细胞。这些细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Bethesda，Maryland，U.S.A。本发明也预期包括来自原代细胞系的细胞，这些细胞系是从哺乳动物取下细胞后接着培养细胞有限的一段时间而被建立的。
在优选的实施方案中，细胞系是包括根据第四方面的多种宿主细胞的稳定细胞系。
也可使用标准方法将表现出细胞周期位置报道分子的稳定表达的细胞系用来在宿主动物中建立工程化细胞的异种移植物(Krasagakis，KJ et al，Cell Physiol.，(2001)，187(3)，386-91；Paris，S.et al，Clin.Exp.Metastasis，(1999)，17(10)，817-22)。工程化以表达细胞周期位置报道分子的肿瘤细胞系异种移植物将使得能够建立模型系统来研究肿瘤细胞分裂、停滞和转移以及筛选新的抗癌药物。
在本发明的第五方面，提供了如上所述的多肽的用途，用于确定哺乳动物细胞的细胞周期位置。
将表达细胞周期位置报道分子的工程化细胞系或转基因组织用作宿主动物中的同种异基因移植物，这将能够研究影响组织移植的耐受或排斥的机制(Pye&Watt，J.Anat.，(2001)，198(Pt 2)，163-73；Brod，S.A.et al，Transplantation(2000)，69(10)，2162-6)。
根据本发明的第六方面，提供了用于确定哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，所述方法包括
a)在细胞中表达如上所述的核酸构建体；以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置。
为进行根据第六方面的用于确定细胞的细胞周期位置的方法，可将转染了DNA报道分子构建体的细胞在一定条件下培养一段时间，其足以使得在细胞周期的特定阶段表达报道分子。典型地，报道分子的表达将发生在转染后16到72小时，但是可能根据培养条件而变化。如果报道分子是基于绿色荧光蛋白序列的，报道分子可能需要确定的时间来折叠成有荧光的构象。这个时间取决于所使用的绿色荧光蛋白衍生物的一级序列。荧光报道蛋白也可随时间而改变颜色(参见例如Terskikh，Science，(2000)，290，1585-8)，这需要在转染后以特定的时间间隔成像。
如果报道分子产生了第六方面的方法中的荧光信号，就可以使用常规的荧光显微镜或者基于共焦的荧光显微镜来监测发射的信号。使用这些技术，就能够确定表达报道分子的细胞比例，以及报道分子的定位。在根据本发明的方法中，可合适地通过光学手段在例如分光光度计、荧光计、荧光显微镜、冷却式电荷耦合器件(CCD)成像仪(诸如扫描成像仪或者面积成像仪)、荧光激发的细胞分选仪、共焦显微镜或者扫描共焦设备中测定转化了或转染了DNA构建体的细胞的荧光，其中可通过扫描光激发和发射来确定培养基中细胞的光谱性质。
在本发明的实施方案中，其中的核酸报道分子构建体包括抗药性基因，在转染和表达抗药性基因后(通常1-2天)，可通过将细胞在抗生素存在下生长来选择表达修饰过的报道基因的细胞，由于选择标志物基因的存在使转染的细胞对抗生素有抗性。加入抗生素的目的是选择表达报道基因的细胞，这些细胞在一些情况下将报道基因连同它所缔合的启动子整合到细胞系的基因组中。选择之后，可使用标准技术来分离表达构建体的克隆细胞系。然后克隆细胞系可在标准条件下生长，并将在细胞周期的特定点表达报道分子以及产生可检测的信号。
可以在缺少和/或存在待研究的测试试剂的情况下培养转染了根据本发明的核酸报道分子构建体的细胞，所述试剂对细胞的细胞周期的影响是待确定的。通过确定表达报道分子的细胞的比例以及细胞中的信号的定位，确定测试试剂对细胞的细胞周期的影响是可能的，例如测试系统是否在细胞周期的特定阶段使细胞停滞，或者影响是加速还是减速细胞分裂。
因此，根据本发明的第七方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，该方法包括a)在缺少和存在测试试剂的情况下表达如上所述的核酸报道分子构建体；以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置，其中在缺少和存在测试试剂时所测得的发射信号之间的差异指示了测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
术语“测试试剂”应被理解为电磁辐射的形式或者是化学实体。优选地，测试试剂是选自药物、核酸、激素、蛋白质和肽的化学实体。测试试剂可以是外源应用到细胞的，或者可以是在进行研究的细胞中所表达的肽或蛋白质。
在本发明的第八方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，该方法包括a)在存在所述测试试剂的情况下在所述细胞中表达如上所述的核酸报道分子构建体；b)通过监测报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置，以及c)比较存在测试试剂时所发射的信号与缺少测试试剂时所发射的信号的已知值；其中在存在测试试剂时所测得的发射信号与缺少测试试剂时的已知值之间的差异指示了测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
在本发明的第九方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期状态的影响的方法，该方法包括a)提供含有如上所述核酸报道分子构建体的细胞；b)分别在存在和缺少测试试剂以及允许表达核酸报道分子构建体的条件下培养第一和第二细胞群；以及c)测定第一和第二细胞群中的报道分子所发射的信号；其中第一和第二细胞群中所测得的发射信号之间的差异指示了测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
根据本发明的第十方面，提供了确定哺乳动物细胞周期对细胞过程的影响的方法，所述过程可通过已知反应于测试试剂而改变的第一可检测报道分子来测定，该方法包括
a)在存在测试试剂的情况下在细胞中表达如上所述的第二核酸报道分子构建体；b)通过监测第二报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置；以及c)监测第一可检测报道分子所发射的信号，其中步骤b)所确定的细胞周期位置与第一可检测报道分子所发射的信号之间的关系指示了所述细胞过程是否是细胞周期依赖性。
在本发明的第十一方面，提供了如上所述的多肽用于测定细胞中的CDK2活性的用途。
根据本发明的第十二方面，提供了测定细胞中CDK2活性的方法，所述方法包括以下步骤a)在如上所述的细胞中表达核酸构建体，以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定CDK2活性。
根据本发明的第十三方面，提供了用于确定测试试剂对哺乳动物细胞的CDK2活性的影响的方法，所述方法包括a)在缺少和存在所述测试试剂的情况下在所述细胞中表达如上所述的核酸构建体；以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定CDK2活性，其中在缺乏和存在所述测试试剂时所测得的发射信号之间的差异指示了测试试剂对CDK2活性的影响。
在本发明的第十四方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞CDK2活性的影响的方法，所述方法包括a)在存在所述测试试剂的情况下在所述细胞中表达如上所述的核酸构建体；以及b)通过监测报道分子发射的信号来确定细胞周期位置，c)比较存在测试试剂时所发射的信号与缺少测试试剂时所发射信号的已知值；其中存在测试试剂时所测得的发射信号与缺少测试试剂时的所述已知值之间的差异指示了测试试剂对细胞CDK2活性的影响。
附图简述参考下面的实施例和附图进一步阐述本发明，其中

图1-HDHB在细胞核或细胞质中的定位。
(A)分析U2OS细胞的细胞质和细胞核提取物，其通过变性凝胶电泳以及用抗重组HDHB、α-微管蛋白和PCNA的抗体进行的western印迹。通过化学发光检测免疫活性蛋白质。
(B)通过荧光显微术观察显微注射到U2OS细胞中并瞬时表达的GFP标记的HDHB。用Hoechst染料染色细胞核。比例尺寸，10μm。
(C)通过荧光显微术观察显微注射到U2OS细胞中并瞬时表达的FLAG标记的HDHB。
图2-GFP-HDHB的亚细胞定位是细胞周期依赖性。
(A)定量不同步、G1和S期U2OS细胞中瞬时表达的GFP标记的HDHB的亚细胞定位。将具有特定分布模式的GFP阳性细胞的数量表达为GFP阳性细胞总数(＞100个细胞)的百分比。
(B)分析同步U2OS细胞(G1和S期)细胞质和细胞核提取物，其通过变性凝胶电泳以及用抗重组HDHB、α-微管蛋白和PCNA的抗体进行的western印迹。通过化学发光检测免疫活性蛋白质。
图3-HDHB细胞核定位所需结构域的确认。
(A)HDHB蛋白质的示意图，显示了七个潜在的CDK磷酸化位点(SP或TP)、推定的亚细胞定位结构域(SLD)和磷酸化SLD(PSLD)、walker A和walker B解旋酶基序。蛋白质下面显示了氨基酸残基数。
(B)研究中产生的GFP和FLAG标记的HDHB以及C末端截短突变体。将HDHB SLD(残基1040-1087)和PSLD(残基957-1087)的C末端融合到GFP-βGal报道分子上以分别形成GFP-βGal-SLD和GFP-βGal-PSLD。
(C)定量不同步、G1和S期U2OS细胞中瞬时表达的GFP-HDHB-ΔSLD的亚细胞定位，并表达为GFP阳性细胞总数的百分比。
图4-GFP-βGal-PSLD亚细胞定位模式随细胞周期的变化。
(A)定量不同步、G1和S期U2OS细胞中瞬时表达的GFP-βGal、GFP-βGal-SLD和GFP-βGal-PSLD的亚细胞定位，并表达为GFP阳性细胞总数的百分比。
图5-HDHB的SLD中的功能性rev型核输出信号(NES)的鉴别。
(A)HDHB中的推定NES与其它细胞周期相关蛋白质中鉴定的NES(Henderson和Eleftheriou，2000；Fabbro和Henderson，2003)的比对。氨基酸序列上部的上标表示残基数。粗箭头指向NES中的保守脂肪族残基。HDHB中推定NES中的两对残基被突变为丙氨酸，如细箭头所示，形成Mut1和Mut2。
(B)用(+)或不用(-)LMB在不同步生长的U2OS细胞中瞬时表达GFP和FLAG标记的HDHB以抑制CRM1介导的核输出。定量不同步、G1和S期细胞中GFP-HDHB和FLAG-HDHB的亚细胞定位，并表达为该样品中GFP阳性细胞总数的百分比。
(C)定量不同步的USOS细胞中野生型和突变的GFP-HDHB和GFP-βGal-PSLD的亚细胞定位，并表达为该样品中GFP阳性细胞总数的百分比。
图6-细胞周期依赖性体内FLAG-HDHB磷酸化。
(A)用[32P]正磷酸盐标记瞬时表达FLAG-HDHB(泳道1)及其截短突变体1-1039(泳道2)和1-874(泳道3)的U2OS细胞。用抗FLAG树脂免疫沉淀细胞提取物。经7.5％SDS-PAGE分离沉淀的蛋白质，转移道PVDF膜上，通过放射自显影(上)或western印迹(下)检测。已知分子量的标志蛋白质的位置指示在左边。
(B)用抗FLAG树脂免疫沉淀U2OS细胞中表达的FLAG-HDHB，在存在(+)或缺少(-)磷酸酶抑制剂的情况下用(+)或不用(-)λ-磷酸酶(λ-PPase)温育，如所指示那样，经SDS-PAGE分析并用抗HDHB抗体免疫印迹。
(C)将表达FLAG-HDHB的U2OS细胞停滞在G1/S(上)或G2/M(下)，然后解除阻断。在指示的时间点收获FLAG-HDHB，用抗FLAG树脂免疫沉淀，用(+)或不用(-)λ-PPase处理，如(B)中那样分析。
图7-确认S967为HDHB中主要的体内磷酸化位点。
(A)二维分离磷酸氨基酸标志物(左)和来自体内32P标记的FLAG-HDHB的磷酸氨基酸(右)，通过放射自显影观察。一些不完全水解的磷酸肽保留在原处附近(+)。
(B)用正磷酸盐体内放射标记野生型和突变体FLAG-HDHB蛋白质，免疫沉淀，经SDS-PAGE分离，通过放射自显影(上)以及用抗HDHB免疫印迹(下)分析。
(C)二维分离32P标记的野生型和S967A突变体FLAG-HDHB的胰蛋白酶水解的磷酸肽，通过放射自显影观察。
图8-确认细胞周期蛋白E/CDK2为HDHB S967潜在的G1/S激酶。
(A)二维分离来自如图7C中体内磷酸化的FLAG-HDHB或者经纯化的细胞周期蛋白E/CDK2或细胞周期蛋白A/CDK2体外磷酸化重组HDHB的胰蛋白酶水解的磷酸肽，要么单独分离要么作为混合物，通过放射自显影观察。
(B)通过用抗HDHB(泳道1-6)、细胞周期蛋白E(泳道1-3)或细胞周期蛋白A(泳道4-6)的抗体免疫印迹来分析U2OS细胞中表达的与FLAG载体(泳道1、4)或FLAG-HDHB(泳道2、5)免疫共沉淀的蛋白质。将用于免疫沉淀的细胞溶胞物的十分之一作为阳性对照进行平行分析(泳道3、6)。
图9-HDHB的亚细胞定位受S967磷酸化的控制。
(A)定量不同步、G1和S期U2OS细胞中表达的GFP-HDHBS967A和S967D的亚细胞定位。
图10-显示pCORON1002-EGFP-C1-PSLD载体的稳定表达的不同步U2OS细胞中EGFP-PSLD的定位是细胞周期依赖性。对细胞的同一部分视野进行荧光显微术，其中(A)用Hoechst染料染色细胞核，(B)观察EGFP-PSLD，(C)将细胞核暴露于BrdU 1小时，然后固定，用Cy-5标记的抗体检测，以指示S期细胞。(D)完整视野中存在的单个细胞的红色(BrdU的Cy-5免疫荧光检测)和绿色(EGFP-PSLD)的细胞核荧光强度图。
图11-pCORON1002-EGFP-C1-PSLD载体图谱。
图12-pCORON1002-EGFP-C1-βGal-PSLD载体图谱。
图13-流式细胞数据，比较了用pCORON1002-EGFP-C1-PSLD、pCORON1002-EGFP-C1-βGal-PSLD开发的代表性稳定细胞系以及亲本U2OS细胞系的信号的亮度和均匀性。
发明详述方法质粒通过将全长HDHB cDNA作为BglII/NotI片段(Taneja et al.，J.Biol.Chem.，(2002)277，40853-40861)插入到pEGFP-C1载体(Clontech，PaloAlto，CA)的NotI位点形成pGFP-HDHB和突变体衍生物(见图4和6)。通过将含有全长HDHB cDNA的HindIII/NotI片段插入到pFlag-CMV2载体(Eastman Kodak Co.，Rochester，NY)的NotI位点构建pFLAG-HDHB。标记的HDHB-SLD(1-1039)的构建是通过用残基1034编码序列之后的NruI以及用多聚接头中的NotI裂解标记HDHB质粒，通过带有编码残基1035到1039的平端、终止密码子以及突出的NotI相容的5’末端的双接头寡核苷酸来取代小片段。为形成pFLAG-HDHB(1-874)，用Klenow聚合酶处理StuI消化的pFLAG-HDHB DNA以形成平末端，连接到pFLAG-CMV2载体中。为形成pEGFP-βGal，通过PCR由pβGal-control(Clontech)扩增编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶(βGal)的DNA片段，插入到pEGFP-C1中的GFP编码序列的3’末端，其中使用HindIII位点。PCR扩增氨基酸残基1040-1087(SLD)和957-1087(PSLD)的HDHB序列，插入到pEGFP-βGal中的βGalcDNA的3’末端，分别形成pGFP-βGal-SLD和pGFP-βGal-PSLD。通过定点诱变(QuikChange，Stratagene，La JoIIa，CA)在HDHB cDNA中形成NES突变体和磷酸化位点突变体。
通过从DNA构建体pGFP-C1-βGal-PSLD中PCR扩增390bpPSLD区域来构建pCORON1002-EGFP-C1-PSLD。将5’NheI和3’SalI限制酶位点引入到PSLD片段中，使得能够亚克隆到载体pCORON1002-EGFP-C1(GE Healthcare，Amersham，UK)中。所得到的6704bp DNA构建体pCORON1002-EGFP-C1-PSLD，含有遍在蛋白C启动子、细菌氨苄青霉素抗性基因以及哺乳动物新霉素抗性基因(图11)。载体的核酸序列示于SEQ ID No.3。使用标准克隆技术(Sambrook，J.et al(1989))形成该载体的三个更多的形式；用J-Red(Evrogen)首先取代EGFP基因，用潮霉素抗性基因取代新霉素抗性基因，用CMV I/E启动子取代遍在蛋白C启动子。
pCORON1002-EGFP-C1-βGal-PSLD的构建是通过NheI和Xmal限制酶消化pEGFP-C1-βGal-PSLD，将4242bp EGFP-βGal-PSLD片段插入到pCORON1002载体(GE Healthcare)中。所得到的9937bpDNA构建体pCORON1002-EGFP-C1-βGal-PSLD(图12)含有遍在蛋白C启动子、细菌氨苄青霉素抗性基因以及哺乳动物新霉素抗性基因。载体的核酸序列示于SEQ ID No.4。
EGFP-PSLD融合蛋白的蛋白质和核酸序列分别示于SEQ ID No.5和6。
通过DNA测序来确认所有构建体和取代突变体的正确DNA序列。
抗体针对纯化的重组HDHB(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)产生抗HDHB抗体，在固定的HDHB上亲和纯化(Harlow&Lane，AntibodiesA laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory)。
细胞培养、同步化、显微注射、电穿孔、转染以及稳定细胞系形成将U2OS细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals，Norcross，GA)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(Gibco BRLLifetechnologies，Carlsbad，CA)中于37℃培养成指数生长的单层。通过在含有5mM胸苷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的DMEM中温育24h使指数生长的U2OS细胞停滞在G1/S。为将细胞释放到S期中，吸出培养基，用加温的DMEM加上10％FBS漂洗细胞三次，在新鲜的DMEM加上10％FBS中温育。在含有30ng/ml洛可达唑(Sigma-Aldrich)的DMEM中将指数生长的U2OS细胞停滞在G2/M 16h。为释放细胞进G1，通过轻轻摇出来收集有丝分裂细胞，用DMEM加上10％FBS漂洗三次，然后平铺在玻璃盖玻片上用于显微注射或者平铺在培养皿中用于进一步操作。
通过如前所述的流式细胞术(Taneja et al.，J.Biol.Chem.，(2002)277，40853-40861)验证细胞周期同步化。在阻断核蛋白输出的实验中，将细胞在含有10ng/ml的leptomycin B(LMB)和10μM放线菌酮(Calbiochem，San Diego，CA)的DMEM中培养3h以阻止新蛋白合成。如所述(Herbig et al.，1999)将平铺在玻璃盖玻片上的细胞进行显微注射，但注射的是质粒DNA而不是蛋白质。
对于电穿孔来说，将不同步生长的U2OS细胞(5×106)胰蛋白酶化，离心收集，重悬浮于800μl的20mM HEPES(pH 7.4)，0.7mMNa2HPO4/NaH2PO4，137mM NaCl，5mM KCl，6mM葡萄糖，最终pH7.4。加入10μg的DNA，转移到0.4cm电穿孔杯(BioRad，Hereules，CA)中，使用Gene Pulser Il设备(BioRad)进行电穿孔。将细胞平铺在组织培养皿中1h，用新鲜培养基漂洗，再培养23h。
用瞬时转染细胞的工作证明，由于低转染效率、表达不均匀以及这些数据的高通量分析所产生的问题，多孔平板形式是很难的。因此筛选大量siRNA或试剂对细胞周期的影响就需要均质的稳定细胞系的产生。由于HDHB长期过量表达时的毒性作用，用连接到报道分子的PSLD区域产生了稳定细胞系。用pCORON1002-EGFP-C1-PSLD(图11)、pCORON1002-EGFP-C1-βGal-PSLD(图12)或者上述载体的J-Red衍生物瞬时转染U2OS细胞。在合适的情况下，使用1mg/ml G418(Sigma)或潮霉素选择表达重组融合蛋白的稳定克隆。通过流式细胞术分析分离的原代克隆(每个构建体约60个)以确认传感器表达的水平和均匀性，以及在合适的情况下，使用上述方法开发继代克隆。
荧光显微术对于间接免疫荧光染色来说，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗细胞三次，用PBS中的3.7％甲醛固定20min，在0.2％Triton X-100中透化5min，用PBS中的10％FBS温育45min。用PBS中的1∶100小鼠单克隆抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich)加上10％FBS于室温检测FLAG-HDHB 2h。漂洗之后，用PBS中1∶100的缀合了得克萨斯红的山羊抗小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)加上10％FBS于室温温育1h。三次漂洗之后，用Hoechst 33258(2μM于PBS中)温育细胞10min。将盖玻片安放在ProLong Antifade(Molecular Probes，Eugene，OR)上。用Hamamatsu数码相机使用Openlab 3.0软件(Improvision，Lexington，MA)在Zeiss Axioplan 2成像系统(Carl Zeiss Inc.)上获得图象。对表现出每种模式的亚细胞定位的细胞数进行计数，表示为所评价的细胞总数(每个实验中100到150个细胞)的百分比。在至少两个独立实验中定量评估每种蛋白质的亚细胞分布。
对于GFP荧光来说，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗细胞三次，用含有2μM Hoechst 33258的3.7％甲醛固定20min，如上述进行成像和评估。
对于Triton X-100提取来说，用冷的细胞骨架缓冲液(CSK，10mMHEPES[pH 7.4]，300mM蔗糖，100mM NaCl，3mM MgCl2)漂洗细胞两次，用CSK缓冲液(补充1X蛋白酶抑制剂)中的0.5％Triton X-100在冰上提取5min，然后如上所述固定。
在合适的情况下，对于高通量成像来说，在稳定细胞系荧光显微术的多孔平板形式中的动态成像(24hr)和分析是使用高通量共焦成像系统(IN Cell Analyzer 1000或IN Cell Analyzer 3000，GE Healthcare，Amersham，UK)在转染了pCORON1002-EGFP-C1-PSLD、pCORON1002-EGFP-C1-βGal-PSLD或这些载体的红色荧光蛋白(redFP)衍生物的细胞上进行的。使用细胞周期阶段标志物算法(GEHealth Care)来分析图象。
代谢性磷酸盐标记用野生型或突变体FLAGHDHB瞬时转染U2OS细胞(2.5×106)。24h后，将细胞在除去磷酸盐的DMEM(Gibco BRL Lifetechnologies)中温育15min，用32P-H3PO4(0.35mCi/ml培养基；ICN PharmaceuticalsInc.，Costa Mesa，CA)放射标记4h。从提取物中免疫沉淀磷酸盐标记的FLAG-HDHB，经7.5％SDS/PAGE分离，转移到如下所述的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。
细胞提取、免疫沉淀以及westrern印迹转染后24h，将欲通过免疫沉淀和免疫印迹进行分析的FLAG-HDHB转染的培养物在溶胞缓冲液(50mM Tris-HCI pH 7.5，10％甘油，0.1％NP-40，1mM DTT，25mM NaF，100μg/ml PMSF，1μg/ml抑酶肽，1μg/ml亮抑酶肽)(每个35mm培养皿中0.5ml，或者每个60mm培养皿或75cm烧瓶中1ml)中溶胞。从培养皿上刮掉提取物，在冰上温育5min，14000g离心10min。用10μl抗FLAG琼脂糖(Sigma)在旋转器上于4℃温育上清液样品(0.5到1mg蛋白质)2h。用溶胞缓冲液漂洗琼脂糖珠三次。将免疫沉淀的蛋白质转移到PVDF膜上，用抗HDHB肽血清(1∶5000)、抗细胞周期蛋白E抗体(1∶1000)、抗细胞周期蛋白A抗体(1∶1000)(Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA)以及化学发光剂(SuperSignal，Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)经western印迹分析。
对于选择性细胞核和细胞质蛋白提取来说，通过胰蛋白酶消化收获80-90％汇合的U2OS细胞，用PBS漂洗。将它们重悬浮并在10mMTris-HCl[pH 7.5]，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.25M蔗糖，10％甘油，75μg/ml毛地黄皂苷，1mM DTT，10mM NaF，1mM Na3VO4，100μg/ml PMSF，1μg/ml抑酶肽以及1μg/ml亮抑酶肽中于冰上溶胞10min，在1000×g离心5min。将上清液级分作为胞质溶胶提取物进行收集。将沉淀漂洗，重悬浮在高盐缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 7.5]，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1％NP-40，100μg/ml PMSF，1μg/ml肽抑酶以及1μg/ml亮抑酶肽)中，在4℃摇动10min。超声处理之后，将含有可溶性的并结合染色质的蛋白质的悬浮物作为细胞核提取物进行分析。通过8.5％SDS-PAGE分析细胞核和细胞质提取物中的蛋白质，接着用抗α微管蛋白、PCNA(均来自Santa Cruz Biotechnology)以及重组HDHB的抗体进行wester印迹。
蛋白质磷酸酶反应在30℃用100U的于磷酸酶缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.5]，0.1mM EDTA，0.01％NP-40)中的λ-磷酸酶(New England Biolabs，Beverly，MA)温育结合到抗FLAG珠的FLAG-HDHB 1h。在存在或缺少磷酸酶抑制剂(5mM Na3VO4，50mM NaF)的情况下进行反应。通过7.5％SDSPAGE(丙烯酰胺-双丙烯酰胺比例，30∶0.36)分离蛋白质，用抗HDHB血清和化学发光经western印迹检测HDHB。
胰蛋白酶水解的肽作图以及磷酸氨基酸分析转染后24h，如上处理将用于免疫沉淀以及磷酸氨基酸或磷酸肽作图的放射标记的FLAG-HDHB转染的培养物，但是用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.5]，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸，1％SDS，50mM NaF，1mM EDTA，5mM Na3VO4，100μg/ml PMSF，1μg/ml抑酶肽以及1μg/ml亮抑酶肽)代替溶胞缓冲液。经7.5％SDS-PAGE分离免疫沉淀的蛋白质并转移到PVDF膜上。用去离子水充分冲洗含有放射标记的HDHB的膜两次，然后经放射自显影观察磷酸蛋白质。然后将磷酸蛋白质切下，用甲醇接着用水重新润湿膜碎片。用含有0.1％Tween 20(Sigma-Aldrich)的50mM NH4HCO3在室温封闭膜30min，用50mM NH4HCO3漂洗三次，然后用L-(甲苯磺酰胺基-2-苯基)乙基氯甲基酮处理的牛胰腺胰蛋白酶(Worthington，Lakewood，NJ)将磷酸蛋白质从PVDF上酶切下来。然后如其它地方详述的那样(Boyleet al.，Meth.Enzymology，(1991)，201，110-149)进行肽的二维磷酸肽作图或磷酸氨基酸分析。
细胞周期蛋白依赖性体外激酶反应使用纯化的细胞周期蛋白/CDK(200pmol/h)(由R.Ott和C.Voitenleitner提供)和纯化的重组HDHB(Taneja et al.，J.Biol.Chem.，(2002)277，40853-40861)作为底物按照以前所述那样进行激酶反应(Voitenleitner et al.，MoI.Cell.Biol.，(1999)，19，646-56)。
BrdU标记、在稳定细胞系上的化学细胞周期阻断和RNAi实验的确认使用无抗生素的培养基(100μl/孔)将表达pCORON1002-EGFP-C1-PSLD构建体的稳定细胞以0.3×105/ml接种在96孔Greiner平板中，温育16小时。
为证实EGFP-PSLD在S期中的分布，使用细胞扩增试剂盒(Amersham Biosciences，GE Health Care)用BrdU标记稳定细胞1hr。将细胞在2％福尔马林中固定，用Cy-5标记的第二抗体系统(细胞扩增试剂盒；GE Health Care)通过免疫荧光检测掺入的BrdU。用hoechst(2μM)染色细胞核。
对于化学阻断研究来说(表1)，将稳定细胞暴露于olomoucine、roscovitine、洛可达唑、含羞草碱、秋水仙胺或秋水仙碱(Sigma)。将细胞在2％福尔马林中固定，用hoechst(2μM)染色细胞核。
对于siRNA研究来说，将抗某些细胞周期蛋白、MCM蛋白、CDK、polo样激酶(PLK)的siRNA集合(Dharmacon)以及随机对照双链体(表2)在lipofectamine/optimem I(Invitrogen)中稀释到25nM，加入到稳定细胞中4hr。替换培养基，温育平板48hr。将细胞在2％福尔马林中固定，用hoechst(2μM)染色细胞核。
在IN Cell Analyzer系统(GEHC)上进行高通量成像和分析之后，使用hoescht作为细胞核标志物以及IN Cell Analyzer 3000细胞周期阶段标志物算法(GEHC)来获得视野中的单个细胞总数的平均核密度和N∶C比(EGFP信号)、核大小(hoescht信号)以及合适情况下的核信号强度(BrdU)的数据。对每个孔来说，将每个视野的细胞总数分类成G1期(主要是核EGFP分布；高的EGFP-PSLD核密度以及N∶C比)、S期(核BrdU信号＞背景之上3SD；EGFP-PSLD N∶C比约1)以及G2期(较大的核大小；较低的EGFP-PSLD N∶C比)。尽管区分M期细胞(根据较小的核大小以及非常强的EGFP信号)是可能的，但是在用福尔马林固定的孔中极少看见这样的细胞，因为它们在漂洗和固定过程中被去除了。
结果HDHB存在于核点或者细胞质中为确定内源HDHB的亚细胞定位，从人U2OS细胞中选择性提取核和细胞质蛋白，通过变性凝胶电泳分离，通过western印迹分析(图1)。首先监测每种提取物中的PCNA和α-微管蛋白的存在来评估提取程序。PCNA在核提取物中富集，而不在细胞质级分中富集，而α-微管蛋白主要发现于细胞质级分中，证实了分级分离。在核和细胞质级分中都检测到了HDHB(图1)。细胞质HDHB比核级分移动更慢(图1)，暗示了翻译后修饰的可能性。
这些结果可能表明要么HDHB分布在整个细胞中，要么混合细胞群在细胞核或细胞质中都含有HDHB。为区别这些选项，将HDHB在单个细胞中原位定位；通过瞬时转染在人U2OS细胞中表达GFP和FLAG标记的HDHB。由于标记或未标记HDHB的长期过量表达是细胞毒性的，所有实验都在可能的最短时期中进行(通常24h)。通过荧光显微术分析单个细胞中的标记HDHB定位。GFP-HDHB和FLAG-HDHB都显示了两种主要定位模式，要么在细胞核中分散的核点中，要么在细胞质中(图1)。在细胞核或细胞质中也都观察到了GFP-HDHB在原代人成纤维细胞中的瞬时表达。
HDHB中细胞周期依赖性亚细胞定位结构域的确认用洛可达唑将U2OS细胞停滞在G2/M，释放到G1三小时，然后用pGFP-HDHB DNA显微注射到它们的细胞核中。六小时之后GFP-HDHB的表达是很容易检测的，此时大约70％的G1期细胞主要在细胞核累积融合蛋白(图2)。相反，当用胸苷将细胞同步化在G1/S时，释放到S期，然后用pGFP-HDHB DNA显微注射，超过70％的S期细胞主要在细胞质中累积融合蛋白(图2)。G1和S期U2OS细胞的选择性提取显示，内源HDHB大部分在G1的核和S期的细胞质(图2b)。然而，内源HDHB在两种亚细胞级分中都可明显地检测到。与G1期蛋白相比，S期HDHB的迁移率被轻微延缓了。这些结果表明，HDHB的亚细胞定位在细胞周期中受到调节，GFP标记的HDHB反映了内源未标记解旋酶的定位。
受到Bloom氏综合征解旋酶以及其它RecQ家族解旋酶(Hickson，Nature Rev.Cancer，(2003)3，169-178)中C末端核定位信号鉴别的提示，将可能的亚细胞定位结构域(SLD)鉴别在HDHB的最C末端(图3)。为确定这个推定的SLD对于HDHB定位是否重要，制备了缺少含有SLD的C末端48个残基的HDHB截短突变体(GFP-HDHB-.SLD)(图3)。将表达载体显微注射到G1或S期U2OS细胞中，六小时后通过荧光显微术检查融合蛋白的亚细胞定位。超过95％的细胞在细胞质中累积了融合蛋白，不管HDHB表达的细胞周期时间如何(图3c)。这个结果表明HDHB可能带有NLS，其在GFP-HDHB-ΔSLD中通过C末端缺失而被削弱或消除了。
为确定HDHB的C末端结构域对于核定位是否足够，使用细菌β-半乳糖苷酶(βGal)作为报道蛋白，因为它具有接近HDHB的分子量(112kDa)，并且不含亚细胞定位信号(Kalderon et al.，Cell，(1984)，39，499-509)。作为对照，制备GFP-βGal表达载体(图3)，将表达载体显微注射到U2OS细胞后监测融合蛋白的亚细胞定位。如所预期的，GFP-βGal主要累积在细胞质中(图4)。相反，在不同步或同步化的U2OS细胞的细胞核和细胞质中都发现了GFP-βGal-SLD(图4)，表明SLD含有NLS，但是对于报道蛋白的核定位是不够的。推理出或许邻近的潜在CDK磷酸化位点可能影响了细胞周期中的亚细胞定位(图3)，就构建了GFP-βGal-PSLD，其中将含有推定的SLD和潜在CDK磷酸化位点簇的HDHB的C末端131个残基附加到GFP-βGal的C末端(图3)。当GFP-βGal-PSLD质粒DNA在不同步和同步U2OS细胞中瞬时表达时，在超过90％的G1期细胞的细胞核中以及超过70％的S期细胞的细胞质中发现了GFP-βGal-PSLD(图4)。与对G1中的核GFP-HDHB观察到的共焦模式相比，GFP-βGal-PSLD和EGFP-PSLD蛋白在G1中的整个细胞核中均匀分布，仅仅在核仁是少量的。对已经用BrdU标记的表达pCORON1002-EGFP-C1-PSLD的稳定细胞系的分析强调了S期细胞(等于大约60％的不同步群)显示EGFP-PSLD信号的均匀分布或者主要在细胞质的分布(图10)。S期细胞不显示与G1细胞相关的EGFP-PSLD主要的核分布。发现一些细胞显示出EGFP-PSLD报道分子的绝对核排斥(图10)，然而这些细胞不掺入BrdU。我们假设，显示细胞核中绝对清除EGFP-PSLD的细胞是G2。超过24小时的EGFP-PSLD稳定细胞系的动态成像显示出EGFP-PSLD主要在有丝分裂后的G1核中，表明了G1/S转变前后(胞质分裂后约3.5小时)迅速由核到细胞质移动，并进一步地从G1/S直到G2末期(大约19小时)逐渐从细胞核易位到细胞质；此时，在再次分裂之前发生细胞变圆。这些观察结果似乎证实了G2细胞显示出EGFP-PSLD报道分子的绝对细胞质分布。当与U2OS细胞或G2M细胞周期阶段标志物细胞系(GEHC)相比，没有发现表达EGFP-PSLD融合物的稳定细胞系影响细胞周期的总长(大约24小时)。总之，这些数据表明HDHB的亚细胞定位是依赖于细胞周期的，HDHB的C末端PSLD结构域在以细胞周期依赖方式调节蛋白质的亚细胞定位方面起着主要作用，HDHB在G1的核中，但是在S期和可能地G2期间逐渐易位到细胞质。
HDHB中功能性rev型NES的鉴别已经证实在细胞核和细胞质之间穿梭的许多蛋白质包含类似于HIV rev蛋白的原型NES的NES(图5)。含有rev型NES的蛋白质需要输出因子CRM1(也称为核输出蛋白1)去结合蛋白质并将其从细胞核运输到细胞质(由Weis，Cell，(2003)，112，441-451评述)。Leptomycin B(LMB)特异性抑制核蛋白输出中的CRMl活性(Wolff etal.，Chem.Biol.，(1997)，4，139-147；Kudo et al.，Exp.Cell.Res.，(1998)，242，540-547)。对HDHB中的PSLD序列的检查显示了推定的rev型NES(LxxxLxxLxL；图5)。为确定HDHB的细胞质定位是否需要功能性NES，将GFP-HDHB或FLAG-HDHB DNA的表达质粒在存在或缺少LMB的情况下显微注射到不同步的、G1和S期细胞中。通过荧光显微术检查融合蛋白的定位，并进行定量。在存在LMB时，两种融合蛋白都累积在细胞核中，与细胞周期无关(图5)，这与HDHB含有通过CRMl起作用的rev型NES的可能性一致。然而也可能的是，HDHB可能不是CRMl的直接运送物，它的输出可能是通过一些其它蛋白质间接介导的。为评估HDHB中的推定NES是否是功能性的，我们将NES基序的Val/Leu和Leu/Leu突变成丙氨酸以产生NES突变体1和2(图5)。包括这些NES突变体的GFP-HDHB和GFP-βGal-PSLD在不同步或同步化的U2OS细胞中瞬时表达。两种NES突变融合蛋白在超过80％的细胞中都累积在细胞核中，无论它们何时在不同步或同步化细胞中表达(图5)。该结果表明，NES突变特异性削弱了GFP-HDHB和GFP-βGal-PSLD两者的输出，证明HDHB的PSLD区域含有功能性NES。
FLAG-HDHB在体内以细胞周期依赖性方式被磷酸化。
HDHB的PSLD结构域中的潜在CDK磷酸化位点簇(图3)表明，HDHB的磷酸化可能调节它在细胞周期中的亚细胞定位。如果是这样，人们将预期HDHB的PSLD区域以细胞周期依赖性方式被磷酸化。为测试HDHB是否经历PSLD中的磷酸化，用FLAG-HDHB的野生型和C末端截短形式的表达质粒瞬时转染U2OS细胞，用磷酸盐放射标记，然后将FLAG-HDHB从细胞提取物中免疫沉淀出来，通过变性凝胶电泳、免疫印迹和放射自显影分析免疫沉淀的蛋白质(图6)。在免疫活性HDHB条带的同一位置检测到了FLAG-HDHB的放射标记条带(图6A，泳道1)。缺少SLD的截短FLAG-HDHB也在体内被强磷酸化了(泳道2)，而缺少PSLD的截短FLAG-HDHB(1-874)没有被显著磷酸化(泳道3)。这些结果表明，SLD不是HDHDB磷酸化所必需的，而PSLD是必需的，并且表明磷酸化位点可能位于PSLD。
为检查HDHB磷酸化在细胞周期中的时间，不使用放射标记检测磷酸化将是方便的。因为磷酸化经常降低了蛋白质在变性凝胶中的电泳迁移率，将瞬时表达的FLAG-HDHB免疫沉淀，在用λ-磷酸酶(λ-Ppase)处理之前和之后检查它的迁移率(图6B)。没有λ-Ppase处理时，在western印迹中两个非常接近的迁移带中检测到了FLAG-HDHB(泳道1)，而磷酸化的FLAG-HDHB作为单一条带以双条带的较快条带的迁移率进行迁移(泳道2)。当反应中存在λ-Ppase抑制剂时，FLAG-HDHB作为与假处理的蛋白质相同的双条带进行迁移(泳道3)。这些数据表明，FLAG-HDHB的电泳迁移率被磷酸化降低了，这个分析法可能适用于追踪HDHB在细胞周期中的磷酸化。
为确定HDHB是否是以细胞周期依赖方式被磷酸化的，通过加入胸苷到培养基中将瞬时表达FLAG-HDHB的U2OS细胞停滞在G1/S或者通过加入洛可达唑到培养基中将其停滞在G2/M。将细胞从阻断中释放不同的时间段，从细胞提取物中免疫沉淀出FLAG-HDHB。
用或不用λ-Ppase温育免疫沉淀物，然后通过变性凝胶电泳和western印迹分析(图6C)。来自停滞于G1/S的细胞的FLAG-HDHB迁移率被λ-Ppase处理增加了，表明蛋白质在G1/S被磷酸化(图6C，上图)。从G1/S阻断中释放之后，磷酸酶处理FLAG-HDHB至少九小时后检测到了类似的迁移率改变(上图)，在阻断于G2/M的细胞中也是(图6C，下图)。然而，在细胞被释放到G1中四和八小时之后，FLAG-HDHB作为单一条带迁移，受磷酸酶处理的影响就更小了(图6C，下图)。从G2/M阻断中释放之后到十二小时，当大多数细胞正进入S期时(数据未显示)，FLAG-HDHB的迁移率又被磷酸酶处理增加了，恢复了洛可达唑停滞的细胞中所观察到的模式(下图)。这些结果强烈表明，FLAG-HDHB的磷酸化是细胞周期依赖性，从G1/S直到G2/M期间最大磷酸化，在G1期间最少磷酸化。
丝氨酸967是异位表达的HDHB主要的磷酸化位点为绘制FLAG-HDHB中的磷酸化位点图谱，我们首先希望确定哪些氨基酸残基被修饰了。体内放射标记的FLAG-HDHB的磷酸氨基酸分析显示磷酸丝氨酸是FLAG-HDHB在体内的主要磷酸氨基酸(图7A)。假定HDHB的细胞周期依赖性磷酸化位点位于残基874和1039之间的PSLD中(图3A)，这些位点被CDK修饰，磷酸丝氨酸是被修饰的主要氨基酸(图7A)，那么七个潜在CDK位点只有四个将仍然作为候选位点。为单独测试每个这些位点，构建了带有相应的丝氨酸变为丙氨酸的突变的FLAG-HDHB表达质粒。将用这些质粒瞬时转染的细胞在体内用正磷酸盐放射标记，将FLAG-HDHB免疫沉淀，通过放射自显影和western印迹进行分析(图7B)。这些结果表明，FLAG-HDHB和三种突变蛋白被近似同等地磷酸化，而S967A突变蛋白仅仅被弱磷酸化(图7B)。这个结果暗示，S967可能是HDHB体内磷酸化的主要位点。与这个解释相一致，用三种突变蛋白检测到了免疫沉淀的FLAG-HDHB在磷酸酶处理之后的电泳迁移率改变，但是用S967A蛋白没有检测到。
为证实S967是HDHB的主要体内磷酸化位点，用野生型和S967A突变FLAG-HDHB进行胰蛋白酶水解的磷酸肽绘图，它们已经用正磷酸盐代谢性地放射标记了(图7C)。用野生型蛋白质观察到了一种优势放射标记的肽和一种弱标记的肽(左图)。在S967A蛋白中缺少优势标记的磷酸肽，但是仍然可检测到弱标记的肽(图7C，右图)。这些结果提供了额外的证据，证明丝氨酸967是HDHB体内的显著磷酸化位点。
细胞周期蛋白E/CDK2作为潜在修饰G1/S中HDHB的激酶的确认为测试CDK能否实际上修饰HDHB，如通过细胞周期中的HDHB磷酸化时间以及S967作为修饰的主要位点的确认所提示的，用纯化的重组HDHB和放射标记ATP体外温育纯化的细胞周期蛋白E/CDK2或细胞周期蛋白A/CDK2。在激酶反应之后，通过变性凝胶电泳分离蛋白质，转移到PVDF膜上，通过放射自显影检测。结果显示，重组HDHB可被细胞周期蛋白E/CDK2和细胞周期蛋白A/CDK2两者强磷酸化。然后进一步对放射标记的HDHB条带进行加工，用于胰蛋白酶水解的磷酸肽绘图。将每种消化的肽二维分离，要么单独分离，要么与体内磷酸化FLAG-HDHB的胰蛋白酶水解肽混合之后分离，通过放射自显影观察(图8A)。被细胞周期蛋白E/CDK2和细胞周期蛋白A/CDK2磷酸化的HDHB肽产生了与体内标记肽图谱中所观察到的基本相同的模式，有一个主要斑点和一个较小斑点(图A)。当混合体外和体内标记的肽并在一种层析图上分离时，它们共迁移(图8A，右)。这些数据证明，在纯化的重组HDHB中被细胞周期蛋白E/CDK2和细胞周期蛋白A/CDK2体外修饰的主要磷酸肽是FLAG-HDHB中被体内修饰的同一种。
由于人细胞中的细胞周期蛋白E活性是在晚G1期发生的，而细胞周期蛋白A活性是随后与S期出现一起发生的(Pines，1999；Erlandssonet al.，2000)，所以尝试辨别一下这些激酶之一是否可优先修饰HDHB是重要的。细胞周期蛋白亚基经常形成与底物蛋白质的复合物，它们靶向磷酸化(Endicott et al.，1999；Takeda et al.，2001)。为测试细胞周期蛋白E或细胞周期蛋白A是否能与HDHB缔合，从转染了FLAG-HDHB表达载体或作为对照的空FLAG载体的细胞提取物中免疫沉淀FLAG-HDHB和缔合的蛋白质。通过western印迹分析细胞提取物和免疫沉淀物(图8B)。细胞周期蛋白E明显与FLAG-HDHB共沉淀，但是细胞周期蛋白A不这样(图8B，泳道2和5)，表明FLAG-HDHB在体内可能与细胞周期蛋白E优先相互作用。这种相互作用可能是HDHB被细胞周期蛋白E/CDK2体内磷酸化所必需的，这是可以想象的，如果是这样，HDHB中防止它与细胞周期蛋白E缔合的突变将中止细胞周期蛋白E/CDK2所进行的磷酸化。为测试FLAG-HDHB突变体S967A由于不能结合细胞周期蛋白E而在体内不被磷酸化的可能性(图7B、C)，从转染细胞提取物中免疫沉淀FLAG-HDHB-S967A和缔合的蛋白质，通过western印迹进行分析。细胞周期蛋白E与突变蛋白的共沉淀是与野生型FLAG-HDHB一样强的。
丝氨酸967的磷酸化对于控制HDHB定位来说是关键性的。
上述数据显示异位表达的HDHB的亚细胞定位和磷酸化是以细胞周期依赖性方式受到控制的，从G1/S到G2/M具有最大磷酸化，这与HDHB累积于细胞质中的时期是一致的。这些结果以及S967作为HDHB中的主要体内磷酸化位点的确认一起，表明S967的磷酸化可能调节HDHB的亚细胞定位。为测试这个想法，将野生型GFP-HDHB以及突变体S967A、S984A、S1005A和S1021A的表达质粒显微注射到同步化的U2OS细胞中。如所预期的，野生型GFP-HDHB累积在G1细胞的核点，但是在S期细胞的细胞质中。然而，无论周期时间如何，GFP-HDHB-S967A定位于大约70％荧光细胞的核点(图9)。其它三种取代突变体要么定位于细胞核，要么象野生型GFP-HDHB那样定位于细胞质中。在尝试模拟S967磷酸化的努力中，将丝氨酸967突变成天冬氨酸，在不同步的和同步化的U2OS细胞中表达GFP-HDHB-S967D，检查突变融合蛋白的亚细胞分布。
表达GFP-HDHB-S967D的大约60％的细胞在不同步的、G1期和S期细胞中显示了细胞质荧光(图9A)，证明S967D突变模拟了磷酸化的S967。这些数据有力地表明了丝氨酸967的磷酸化在调节HDHB的亚细胞定位方面是关键性的。
HDHB的C末端结构域赋予了细胞周期依赖性定位131残基的结构域PSLD足够将HDHB、EGFP或βGal报道分子以细胞周期依赖性方式靶向细胞核或细胞质(图4和10)。rev-型NES位于这个结构域中(图5)，但是它的活性或对核输出机制的可接近性依赖于PSLD主要是丝氨酸967在G1/S转变时的磷酸化(图6-9)。S967完美匹配于共有CDK底物识别基序(S/T)PX(K/R)。细胞周期蛋白E/CDK2和细胞周期蛋白A/CDK2两者都可体外修饰HDHB，但是细胞周期蛋白E/CDK2与细胞提取物中的HDHB复合的能力表明它可能是在G1/S转变时修饰HDHB的起始激酶(图8)。对于EGFP-PSLD稳定细胞系来说，已知的Cdk2抑制剂olomoucine和roscovitin的加入(表1)或者针对细胞周期蛋白E的siRNA的加入(表2)导致了EGFP-PSLD主要地在核分布并停滞在G1，这进一步支持了Cdk2/细胞周期蛋白E负责控制所观察到的基于细胞周期的磷酸化依赖性亚细胞定位的可能性。PSLD的磷酸化看来似乎持续到细胞周期的较后部分，这与HDHB在S和G2中主要是细胞质定位非常相关。用olomoucine处理稳定细胞系超过24小时的动力学图象表明，对于停滞在G2的细胞来说，EGFP-PSLD信号在大约4-8小时中从细胞质重新分布到细胞核超过(没有细胞通过有丝分裂)，这表明在缺乏cdk2活性的情况下，EGFP-PSLD要么变成脱磷酸化的并重新进入细胞核，要么被破坏了并且新合成的蛋白质由于cdk2抑制而不被磷酸化，从而位于细胞核中。
表1

表2

不可能辨别HDHB是否在M/G1转变时经历了脱磷酸化(图6C)或者可能被靶向进行蛋白水解并在G1早期迅速重新合成，那时它将进入细胞核。然而，超过24小时的稳定细胞系动力学成像表明，EGFP-PSLD信号在M期期间或者M/G1分界时没有被很大降低，但是在胞质分裂后大约30分钟就变成主要在核中了(然后这个状态在G1期间持续约3小时)，这与核膜形成是一致的。这表明EGFP-PSLD构建体被脱磷酸化了，而不是在M/G1分界处前后经历显著破坏。
这些数据提供了有力证据，证明PSLD含有不依赖于蛋白质环境的活性靶向信号(图2-5、10)。由于带有失活NES的突变HDHB即使当它在S期期间表达时也在核中，这样推测起来就是被磷酸化了(图5)，可能NES不被磷酸化所灭活，CDK控制的主要目标是NES。延伸一下这个推理，NES可能在G1期间被掩蔽了，此时PSLD中的CDK基序未被修饰，当S967被磷酸化时NES就被释放了，引起了经核输出因子的NES识别(图3-5)。对rev型NES的结构研究已经表明它形成了两亲性的α-螺旋，亮氨酸排列在螺旋的一侧上，带电荷的残基排列在另一侧(Rittinger et al.，MoI.Cell.Biol.(1999)，4，153-166)。由于HDHB的SLD含有rev型NES和NLS两者，可能作为NLS起作用的碱性残基散布在NES中，NES和NLS可能位于两亲性螺旋的相对面。PSLD中的额外序列将在分子内掩蔽NES，这使得只有NLS才能被识别。S967的磷酸化将改变PSLD中的掩蔽构象以暴露NES，而不影响NLS的暴露。
用EGFP-PSLD稳定细胞系来高通量筛选细胞周期的抑制剂如上所述，用瞬时转染细胞进行的工作证明了多孔平板形式的困难，这是由于低转染效率、表达不均匀以及这些数据的高通量分析所产生的问题。因此对于大量siRNA或试剂对细胞周期影响的筛选就需要均质的稳定细胞系的产生。用连接到报道分子(EGFP)上的PSLD区域产生稳定细胞系，所述连接是通过柔性的七个氨基酸的接头(使用pCORON1002-EGFP-C1-PSLD)。如从图13可看出的，用pCORON1002-EGFP-C1-βGal-PSLD所建立的稳定细胞系所产生的荧光信号比具有柔性的七个氨基酸的接头的细胞系所产生的信号明显更小一些(大约十倍)。这可能是由于βGal蛋白的大小而较多地需要细胞的转录和翻译机制。
用pCORON1002-EGFP-C1-PSLD建立的稳定细胞系(见图13)在本质上是均质的(平均的总细胞RFU 435，SD 58；n＝271；见图10)，提供了灵敏的、稳定的和一致的分析法用于以多孔平板形式研究细胞周期以及迅速筛选试剂对细胞周期的影响(表1和2；图10)。
本发明上文所披露的某些方面已经在Molecular Biology of theCell(153320-3332，2004年7月)中公开了，并于2004年5月14日电子公开于待发表的MBC，10.1091/mbc.E04-03-0227，题目为″CellCycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizesin DNA Damage Foci″，将这些公开内容整体引入这里作为参考。
上述内容是说明本发明，不要理解为对它的限制。尽管已经描述了本发明的一些例证性的实施方案，但是本领域技术人员将很容易理解的是，例证性实施方案中不实质上背离本发明的新的教导和优点的许多修改是可能的。因此，所有的这些修改都被确定为包括在本发明的范围内，如权利要求中所定义的。所以要理解的是，上述内容是说明本发明，不要理解为被限定到所披露的特定实施方案，对所披露实施方案的修改以及其它实施方案都被确定为包括在所附权利要求的范围内。本发明通过下面的权利要求来限定，权利要求的等同方案被包括在其中。
序列表SEQ ID NO1atggccaggt cgagtccgta cctgcgccaa cttcagggac ctctgctccc acccagggat60ctggtggagg aggacgacga ctacctaaac gacgacgtgg aggaggatga agagtccgtg120ttcatcgacg ccgaggagct ctgcagtggg ggcgtaaagg ctggcagcct ccccgggtgc180ctccgcgttt ctatttgtga tgaaaacaca caagagacat gtaaagtgtt tggacgtttt240ccgataacag gtgcttggtg gagagtgaag gtacaagtaa agcctgtggt gggatcaagg300agctatcaat atcaagttca aggatttccg tcttactttt tgcagtctga tatgtcacca360ccaaatcaaa aacatatctg tgctctcttt cttaaagagt gtgaggtctc cagtgatgat420gttaataaat ttttaacatg ggtaaaggag gtatcaaact acaaaaacct aaactttgaa480aatcttaggg aaacactaag aactttccac aaggaaactg gaaggaaaga tcaaaagcag540cctacacaga atggtcagga agagttgttc ctagacaatg agatgagtct tcctctggaa600aacacaattc catttagaaa tgtaatgaca gctttgcagt ttccgaagat aatggaattc660cttccagttc ttctgcctcg acactttaaa tggatcatag ggtcaggttc taaagagatg720ttgaaagaga tagaagagat tttaggtaca catccgtgga aacttggatt tagtaaaata780acctacagag agtggaaact cctgcgatgt gaggcaagtt ggatagcatt ttgtcagtgt840gagtctcttc tccagctgat gactgatttg gagaagaatg cattaataat gtattccaga900ctgaagcaga tatgtagaga agatgggcac acatatgttg aagtgaatga cttaactttg960acattgtcaa atcatatgtc atttcatgct gcttcagagt ctctgaagtt tttgaaggat1020attggtgtgg tgacatatga gaagtcctgt gtcttccctt atgaccttta ccatgctgaa1080agagccatcg ccttttcaat ttgtgacctg atgaagaaac ctccttggca tttatgtgtc1140gatgtcgaaa aggtgcttgc ctctattcac accacaaaac ctgagaattc aagcgatgat1200gcattgaatg agagcaaacc tgatgaagta agattagaaa atcctgtgga tgttgtggac1260acacaggaca atggtgacca tatttggact aatggtgaaa atgaaattaa tgcagaaata1320agtgaagttc agctggatca ggatcaggtt gaagttccac tggatcggga tcaggtggct1380gctttggaaa tgatttgctc caatcctgtg acagtcataa gtgggaaagg tggatgtggg1440aagaccacaa tcgttagccg tctttttaag catatagagc agttggaaga aagagaagta1500aaaaaagcct gtgaagattt tgaacaagac cagaatgctt cagaagaatg gattaccttt1560actgagcaaa gtcaactaga ggcggacaag gctatagaag ttttgctcac agcacctaca1620gggaaagcag ctggcttact aagacagaaa actggtcttc atgcctacac actgtgtcag1680gtcaattata gcttctattc atggactcaa acaatgatga ccacaaacaa accatggaaa1740ttttcttcgg ttagagttct ggttgtggat gaagggagtt tggtatctgt aggaatcttc1800aaatcggtct taaatttatt gtgtgagcac tccaaacttt ctaagcttat tatccttggt1860gacattagac agttacccag tattgaacct ggtaacttgc tgaaagatct ttttgagact1920cttaagtcaa gaaattgtgc tattgagcta aagacaaacc atagagcaga atctcagctc1980attgtggaca atgctacaag aatctcaaga cgccaatttc caaaatttga tgcagaacta2040aatatctctg ataatccaac attacccatc tcaattcaag ataagacatt tatttttgtc2100aggctcccag aagaggatgc cagttctcag tcatctaaaa ctaatcatca ctcttgttta2160tattctgcag ttaaaacttt actacaagaa aataacttac aaaatgcaaa aacatcacaa2220tttattgcat ttagaaggca agactgtgat ctaattaatg actgctgctg caaacactac2280acaggccacc tcaccaaaga ccatcagagt agacttgttt ttggaattgg tgataaaatt2340tgttgtacca ggaatgcata cctctcagac ttactacctg aaaatatctc tggaagtcag2400caaaataatg atctagatgc cagtagtgaa gacttttctg gtacgcttcc tgattttgct2460aaaaataagc gtgactttga aagtaacgtt cgactgtgca atggagagat atttttcata2520
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权利要求
1.多肽构建体，其包括可检测的活细胞报道分子，该分子通过具有小于112,000道尔顿分子量的基团连接到至少一个细胞周期阶段依赖性定位控制元件，所述元件的定位在G1和S期期间改变，其中所述构建体在哺乳动物细胞中的易位表明细胞周期位置。
2.根据权利要求1的多肽构建体，其中所述基团具有小于100,000道尔顿的分子量。
3.根据权利要求1的多肽构建体，其中所述基团具有小于50,000道尔顿的分子量。
4.根据权利要求1的多肽构建体，其中所述基团具有小于25,000道尔顿的分子量。
5.根据权利要求1的多肽构建体，其中所述基团具有小于10,000道尔顿的分子量。
6.根据权利要求1的多肽构建体，其中所述基团具有小于1,000道尔顿的分子量。
7.根据权利要求1的多肽构建体，其中所述基团具有小于700道尔顿的分子量。
8.根据权利要求1的多肽构建体，其中所述基团具有小于500道尔顿的分子量。
9.根据权利要求1的多肽构建体，其中基团是多肽。
10.根据权利要求9的多肽构建体，其中所述多肽基团是七肽。
11.根据权利要求10的多肽构建体，其中所述七肽是甘氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-丝氨酸(GNGGNAS)。
12.根据前述权利要求任一项的多肽构建体，其中细胞周期阶段特异性依赖性定位控制元件选自Rag2、Chaf1B、Fen1、PPP1 R2、解旋酶B、sgk、CDC6或其基序组成的肽组，所述基序诸如解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)。
13.根据权利要求1到12任一项的多肽构建体，其中活细胞报道分子选自荧光蛋白、酶报道分子以及抗原性标志。
14.根据权利要求13的多肽构建体，其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Emerald和J-Red。
15.根据权利要求13的多肽构建体，其中所述酶报道分子是halo-tag(Promega)。
16.根据前述任一项权利要求的多肽构建体，其中细胞周期阶段依赖性定位控制元件是PSLD。
17.根据前述任一项权利要求的多肽构建体，其中报道分子是EGFP并且细胞周期阶段依赖性定位控制元件是PSLD。
18.多肽构建体，包括SEQ ID No.5的氨基酸序列。
19.编码根据前述任一项权利要求的任何多肽构建体的核酸构建体。
20.权利要求19的核酸构建体，其中所述构建体额外包括并且可操作地连接到并且受控于至少一个细胞周期非依赖性表达控制元件。
21.权利要求20的核酸构建体，其中所述表达控制元件是遍在蛋白C启动子或CMV启动子。
22.根据权利要求19到21任一项的核酸构建体，其包括CMV启动子以及编码PSLD和EGFP或J-Red的序列。
23.根据权利要求19到21任一项的核酸构建体，其包括遍在蛋白C启动子以及编码PSLD和EGFP或J-Red的序列。
24.包括权利要求19到23任一项的任何核酸构建体的载体。
25.根据权利要求24的载体，其中所述载体是病毒载体或质粒。
26.根据权利要求25的载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体或慢病毒载体。
27.用根据权利要求19到23任一项的核酸构建体转染的宿主细胞。
28.根据权利要求27的宿主细胞，其中所述细胞是人细胞。
29.包括根据权利要求27或28之一的一种或多种宿主细胞的稳定细胞系。
30.根据权利要求1到18任一项的多肽构建体用于确定哺乳动物细胞的细胞周期位置的用途。
31.用于确定哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，所述方法包括a)在细胞中表达根据权利要求19到23任一项的核酸构建体；以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置。
32.确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括a)在缺少和存在所述测试试剂的情况下，在所述细胞中表达根据权利要求19到23任一项的核酸构建体；以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置，其中在缺少和存在所述测试试剂时所测得的发射信号之间的差异指示了测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
33.确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括a)在存在所述测试试剂的情况下，在所述细胞中表达根据权利要求19到23任一项的核酸报道分子构建体；以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置，c)比较存在测试试剂时所发射的信号与缺少测试试剂时所发射信号的已知值；其中在存在测试试剂时所测得的发射信号与缺少测试试剂时的已知值之间的差异指示了测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
34.确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括a)提供含有根据权利要求19到23任一项的核酸构建体的细胞；b)分别在存在和缺少测试试剂以及允许表达核酸报道分子构建体的条件下培养所述细胞的第一和第二细胞群；以及c)测定所述第一和第二细胞群中的报道分子所发射的信号；其中所述第一和第二细胞群中所测得的发射信号之间的差异指示了所述测试试剂对所述细胞的细胞周期位置的影响。
35.确定哺乳动物细胞周期对细胞过程的影响的方法，所述过程可通过已知反应于测试试剂而改变的第一可检测报道分子来测定，所述方法包括a)在存在所述测试试剂的情况下，在所述细胞中表达根据权利要求19到23任一项的第二核酸报道分子构建体；b)通过监测第二报道分子所发射的信号来确定细胞周期位置；以及c)监测所述第一可检测报道分子所发射的信号，其中步骤b)所确定的细胞周期位置与第一可检测报道分子所发射的信号之间的关系指示了所述细胞过程是否是细胞周期依赖性。
36.根据权利要求1到18任一项的多肽构建体用于测定细胞中的CDK2活性的用途。
37.测定细胞中CDK2活性的方法，所述方法包括以下步骤a)在细胞中表达根据权利要求19到23任一项的核酸构建体，以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定CDK2活性。
38.用于确定测试试剂对哺乳动物细胞的CDK2活性的影响的方法，所述方法包括a)在缺少和存在所述测试试剂的情况下，在所述细胞中表达根据权利要求19到23任一项的核酸构建体；以及b)通过监测报道分子所发射的信号来确定CDK2活性，其中在缺乏和存在所述测试试剂时所测得的发射信号之间的差异指示了测试试剂对CDK2活性的影响。
39.确定测试试剂对哺乳动物细胞CDK2活性的影响的方法，所述方法包括a)在存在所述测试试剂的情况下，在所述细胞中表达根据权利要求19到23任一项的核酸构建体；以及b)通过监测报道分子发射的信号来确定细胞周期位置，c)比较存在测试试剂时所发射的信号与缺少测试试剂时所发射信号的已知值；其中存在测试试剂时所测得的发射信号与缺少测试试剂时的所述已知值之间的差异指示了测试试剂对细胞CDK2活性的影响。
40.根据权利要求37到39任一项的方法，其中所述测试试剂是电磁辐射的形式或者是化学实体。
全文摘要
本发明涉及多肽和核酸构建体，其可用于确定哺乳动物细胞的细胞周期状态。用这些核酸构建体转染的宿主细胞可用于确定测试试剂对哺乳动物细胞周期的影响。
文档编号C12N15/62GK101052646SQ200580032223
公开日2007年10月10日 申请日期2005年7月22日 优先权日2004年7月23日
发明者S·汉库克, S·斯塔布斯, N·托马斯, E·范宁, J·古 申请人:通用电气医疗集团英国有限公司, 范德比尔特大学