专利名称：用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种含有两种功能因子大豆异黄酮苷元和多聚糖混合物的制备方法。具体地说是一种用酶水解的方法制备含有两种功能因子大豆异黄酮苷元和多聚糖混合物的方法。
背景技术：
大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物。大豆中天然存在的大豆异黄酮总共有12种，可以分为3类，即黄豆苷(daidzin)类、染料木苷(genistin)类、黄豆黄素苷(glycitin)类，分别以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在。染料木黄酮和黄豆苷元是大豆异黄酮的功能因子，其化学结构式为 染料木黄酮(genistein) 黄豆苷元(daidzein)大豆异黄酮葡萄糖苷化学结构式为 很多研究表明，在大豆中存在的12种大豆异黄酮中，两种游离形式的异黄酮即染料木黄酮(genistein)和黄豆苷元(daidzein)具有较高的生物活性，是大豆异黄酮保健食品中真正的功能因子。它们能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多种疾病的发生。但是这两种苷元形式的异黄酮在大豆中其含量非常少，不足大豆异黄酮总量的3％。同时，在我国许多生产大豆异黄酮的厂家生产的多是大豆异黄酮糖苷产品，其中苷元含量极少。
我国有人利用酸水解来获得游离形式大豆异黄酮，但强酸条件不易进行工业化。由于强酸水解副产物多，且水解产物主要应用于食品或药品，因此也存在潜在的不安全因素。
酶水解条件温和。我国目前该方面的研究专利有蛋白质技术国际公司中国专利ZL97120435.7公开了使用酶水解制备异黄酮苷元的方法。该专利使用可裂解1，4糖苷键的酶制备异黄酮苷元。所裂解1，4糖苷键的酶来源于黑曲霉、米曲霉、乳克鲁威氏酵母和脆壁克黑曲霉。金凤燮申请的中国专利(申请号CN03133637.X)公开了用微生物发酵的方法水解大豆异黄酮糖苷，以制备大豆异黄酮苷元。在其实施例中使用的微生物包括高温耗氧霉菌、黑曲霉、米曲霉、假丝酵母和大肥菇菌。该方法的转化率为50～80％。他们用的水解酶来源于微生物发酵。王哲申请的中国专利(申请号CN200410058379.8)公开了用β-葡萄糖苷酶和膜技术生产大豆异黄酮苷元的方法。该方法以大豆异黄酮粉为基本原料，以大豆蛋白和大豆异黄酮作诱导剂，用培养霉菌释放的胞外酶β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮，并利用选自超滤和透析的膜技术进行酶水解液的后处理，得到大豆异黄酮苷元。
发明内容
本发的目的在于提供一种适合于工业化生产，大豆异黄酮的回收率高，生产成本低的用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法。
本发明的目的是这样实现的a.以大豆异黄酮粉、脱脂豆粕或大豆糖蜜为原料制备大豆异黄酮糖苷提取物；b.从天然食用原料中提取水解酶液；c.将前两者混合后反应1～48小时，反应条件为温度30～65℃、pH值为3.5～6.5；总体积调至60～1800mL/g底物。
d.分离纯化大豆异黄酮苷元。
本发明还可以包括这样一些特征1、所述的天然食用原料是香菇、金针菇、小麦种子、小麦芽、大麦种子或大麦芽。
2、所述的从天然中提取水解酶液的方法是用水、磷酸盐缓冲溶液、磷酸盐和柠檬酸缓冲溶液进行提取，料液比为1∶1～1∶10。
3、所述的大豆异黄酮糖苷提取物与水解酶液的混合比例为每克大豆异黄酮糖苷提取物，添加3.0～1000.0mL水解酶液。
4、所述的大豆异黄酮糖苷提取物与水解酶液的混合反应总体积调至60～1800mL/g底物。
5、所述的分离纯化方法包括离心、抽滤、微滤、超滤、冻干、真空干燥或喷雾干燥。
本发明是一种应用从天然食用原料中提取的水解酶水解制备大豆异黄酮苷元产品的方法。该方法是以大豆异黄酮粉、脱脂豆粕提取物或大豆糖蜜为原料，应用多种从天然食用原料提取的酶液，水解制备富含大豆异黄酮苷元产品。本发明主要原料都来源于食品，有很高的食用安全性。大豆异黄酮糖苷水解率高，大豆异黄酮回收率高。本发明是一种适合于产业化生产富含大豆异黄酮苷元的一种实用技术。使用纯度较高的原料可进一步制备应用于医药行业的大豆异黄酮苷元产品。因此，本发明的方法更适合于工业化生产。
同现有技术相比，本发明具有如下优点1.本发明采用的都是天然食用植物中提取的水解酶。有很高的食用安全性。
2.本发明采用水解酶含量高，水解能力强。在水解时间少于48小时的情况下，水解率可以超过95％。不用发酵培养，生产成本低。
3.本发明不仅水解率高，而且异黄酮回收率高，超过80％。
4.工艺简单，生产成本较低，以市售30％大豆异黄酮粉末为原料，按最佳工艺计算，生产成本为4.5元/克产品；与发酵产酶相比，整个生产周期短，不超过两天，人工耗费少。
5.产品中含有具有对人们有益的多聚糖，它与大豆异黄酮的功能相辅相乘。
总之，本发明的方法所用主要原料都来源于食品，大豆异黄酮糖苷水解率高，大豆异黄酮回收率高，是适合于产业化生产富含大豆异黄酮苷元系列保健食品原料的一种实用技术。该原料也可进一步提纯，用于制备较纯的大豆异黄酮苷元产品，用于医药行业。
(四)具体实施方案下面举例对本发明作更详细地描述以下各实施例中酶水解苷元得率的确定为 异黄酮总量＝糖苷型异黄酮含量+丙二酰基型异黄酮含量+乙酰基大豆异黄酮含量大豆异黄酮含量测定采用高效液相色谱法。
蛋白质测定方法为凯氏定氮方法。
可溶性糖类测定方法为蒽酮比色法。
大豆异黄酮回收率 实施例1a.市售30％大豆异黄酮粉(黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限公司)为大豆异黄酮糖苷原料，简称“底物A”。
b.在4～20℃下，取市售香菇子实体，用水或浓度0.025～0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液或磷酸盐和柠檬酸缓冲溶液提取，料液比为1∶1，离心收集清液，调pH值为4.0～5.0。得到含多聚糖和水解酶提取液，简称“香酶液”。
c.底物A 2.5g，每克底物A添加3.7～100.0mL香酶液。用pH值为4.0～5.0的缓冲溶液溶解将该酶水解大豆异黄酮糖苷反应总体积调至60～1800mL/g底物A。反应2～24小时，反应条件为温度50～60℃，pH值为4.0～5.0。
d.反应混合液超滤浓缩1～50倍后，离心，收集沉淀冻干，冻干粉即产品，得到产品约1.6g，称为001号产品，成份见表一。大豆异黄酮糖苷水解率超过95％。大豆异黄酮回收率约为80～87％。
实施例2a.市售30％大豆异黄酮粉(黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限公司)为大豆异黄酮糖苷原料，简称“底物A”。
b.在4～20℃下，取市售金针菇子实体，用水或浓度0.025～0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液或磷酸盐和柠檬酸缓冲溶液提取，料液比为1∶1，离心收集清液，调pH值为5.0～6.0。得到含多聚糖和水解酶提取液，简称“金酶液”。
c.底物A 2.5g，每克底物A添加8.0～100.0mL金酶液。用pH值为5.0～6.0的缓冲溶液溶解将该酶水解大豆异黄酮糖苷反应总体积调至60～1800mL/g底物A。反应3～24小时，反应条件为温度50～60℃，pH值为5.0～6.0。
d.反应混合液超滤浓缩1～50倍后，离心，收集沉淀冻干，冻干粉即产品，得到产品约1.9g，称为002号产品，成份见表二。大豆异黄酮糖苷水解率超过95％。大豆异黄酮回收率约为80～89％。
表一 001号产品成分表表二 002号产品成分表
实施例3a.市售30％大豆异黄酮粉(黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限公司)为大豆异黄酮糖苷原料，简称“底物A”。
b.取小麦种子，用过量水浸泡过夜，在4～10℃下，用浓度0.025～0.1mol/L，pH6.6磷酸盐缓冲溶液研磨提取，料液比为1∶2，离心收集清液，调pH值为5.0～6.0。再离心收集清液，得到含多聚糖和水解酶提取液，简称“小酶液”。
c.底物A 2.5g，每克底物A添加8.0～100.0mL小酶液。用pH值为5.0～6.0的缓冲溶液溶解将该酶水解大豆异黄酮糖苷反应总体积调至60～1800mL/g底物A。反应12～48小时，反应条件为温度35～45℃，pH值为5.0～6.0。
d.反应混合液超滤浓缩1～50倍后，离心，收集沉淀冻干，冻干粉即产品，得到产品约1.7g，称为003号产品，成份见表三。大豆异黄酮糖苷水解率超过95％。大豆异黄酮回收率约为80～90％。
实施例4a.市售30％大豆异黄酮粉(黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限公司)为大豆异黄酮糖苷原料，简称“底物A”。
b.取大麦芽(发芽3到14天)，在4～10℃下，用浓度0.025～0.1mol/L，pH6.6磷酸盐缓冲溶液研磨提取，料液比为1∶2，离心收集清液，调pH值为5.0～6.0。再离心收集清液，得到含多聚糖和水解酶提取液，简称“大酶液”。
c.底物A 2.5g，每克底物A添加8.0～100.0mL大酶液。用pH值为5.0～6.0的缓冲溶液溶解将该酶水解大豆异黄酮糖苷反应总体积调至60～1800mL/g底物A。反应12～48小时，反应条件为温度30～40℃，pH值为5.0～6.0。
d.反应混合液超滤浓缩1～50倍后，离心，收集沉淀冻干，冻干粉即产品，得到产品约1.8g，称为004号产品，成份见表四。大豆异黄酮糖苷水解率超过95％。大豆异黄酮回收率为80～92％。
比较上述四个实施例，实施例1中香菇水解酶活力最强，水解时间最短，因此，选用该酶做了实施例5和6。
表三 003号产品成分表 表四 004号产品成分表
实施例5a.从150g脱脂豆粕中用450mL，10～95％的乙醇提取大豆异黄酮，减压浓缩后，冻干，约17g，该大豆异黄酮苷提取物，简称“底物B”。
b.在4～20℃下，取市售香菇子实体，用水或浓度0.025～0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液或磷酸盐和柠檬酸缓冲溶液提取，料液比为1∶1，离心收集清液，调pH值为4.0～5.0。得到含多聚糖和水解酶提取液，简称“香酶液”。
c.底物B约17.5g，每克底物B添加3.7～70.0mL香酶液。用pH值为4.0～5.0的缓冲溶液溶解将该酶水解大豆异黄酮糖苷反应总体积调至60～500mL/g底物B。反应2～24小时，反应条件为温度50～60℃，pH值为4.0～5.0。
d.反应混合液超滤浓缩1～50倍后，离心，冻干后产品约1.0g，称为005号产品，成份见表五。大豆异黄酮糖苷水解率超过95％。大豆异黄酮回收率约为80～85％。(注总回收率较低，约15％。主要原因是该a步提取率低。而本方法采用的水解技术的水解率和回收率都较高。)实施例6a.将150克大豆糖蜜(黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限公司)和300ml水混合，调pH值4.5，冰箱放置过夜，离心，收集沉淀，约92.6g，该大豆异黄酮苷提取物，简称“底物C”。
b.在4～20℃下，取市售香菇子实体，用水或浓度0.025～0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液或磷酸盐和柠檬酸缓冲溶液提取，料液比为1∶1，离心收集清液，调pH值为4.0～5.0。得到含多聚糖和水解酶提取液，简称“香酶液”。
c.底物C约92.6g，每克底物C添加3.7～50.0mL香酶液。用pH值为4.0～5.0的缓冲溶液溶解将该酶水解大豆异黄酮糖苷反应总体积调至50～200mL/g底物C。反应1～24小时，反应条件为温度50～60℃，pH值为4.0～5.0。
d.反应混合液超滤浓缩1～50倍后，离心，冻干后产品约12.0g，称为006号产品，成份见表六。大豆异黄酮糖苷水解率超过95％。大豆异黄酮回收率约为80～85％。(注总回收率比实施例5高。原因是该a步提取损失较小，本方法采用的水解技术的水解率和回收率都较高。)表五 005号产品成分表 表六 006号产品成分表
权利要求
1.一种用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法，其特征在于a.以大豆异黄酮粉、脱脂豆粕或大豆糖蜜为原料制备大豆异黄酮糖苷提取物；b.从天然食用原料中提取水解酶液；c.将前两者混合后反应1～48小时，反应条件为温度30～65℃、pH值为3.5～6.5；d.分离纯化大豆异黄酮苷元。
2.权利要求书1所述的用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法，其特征是所述的天然食用原料是香菇、金针菇、小麦种子、小麦芽、大麦种子或大麦芽。
3.权利要求书2所述的用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法，其特征是所述的从天然食用原料中提取纯化水解酶液的方法是用水、磷酸盐缓冲溶液或磷酸盐和柠檬酸缓冲溶液进行提取，料液比为1∶1～1∶10。
4.权利要求书3所述的用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法，其特征是所述的大豆异黄酮糖苷提取物与水解酶液的混合比例为每克大豆异黄酮糖苷提取物，添加3.0～1000.0mL水解酶液。
5.权利要求书5所述的用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法，其特征是所述的大豆异黄酮糖苷提取物与水解酶液的混合反应总体积调至60～1800mL/g底物。
6.权利要求书5所述的用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法，其特征是所述的分离纯化方法包括离心、抽滤、微滤、超滤、冻干、真空干燥或喷雾干燥。
全文摘要
本发明提供的是一种用天然食用原料中的酶水解制备大豆异黄酮苷元的方法。包括如下步骤制备大豆异黄酮糖苷提取物；从天然植物原料中提取水解酶；将前两者按比例混合反应1～48小时，反应条件为温度30～65℃、pH值为3.5～6.5；纯化大豆异黄酮苷元产品。本发明易于操作，转化率较高(＞95％)，大豆异黄酮回收率高，产品中大豆异黄酮苷元总含量较高。使用来源于天然食用原料提取的酶可以克服微生物发酵制酶，食用安全性差的问题，可以使产品更加安全，可以降低生产成本。本发明是一种适合于产业化生产富含大豆异黄酮苷元的一种实用技术。使用纯度较高的原料可进一步制备应用于医药行业的大豆异黄酮苷元产品。因此，本发明的方法更适合于工业化生产。
文档编号C12P17/02GK1928105SQ20061001051
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月8日 优先权日2006年9月8日
发明者张永忠, 孙艳梅, 许晶, 李木子 申请人:东北农业大学