专利名称：一种混合菌固定化颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及混合菌固定化颗粒的制备方法，具体地说是釆用沸石为载 体对混合菌进行固定化及固定化颗粒对底泥中硝基苯类污染物进行去除。
背景技术：
微生物固定化技术的发展始于上世纪70年代，在医药、食品、化工以 及点源污水治理方面取得了很多成果，但在污染地表水体修复特别是底泥 修复方面的研究还未见报道。
微生物固定化技术是指利用化学或物理的方法，将游离细胞(微生物) 定位于限定的空间区域内，并保持活性，且能反复使用的基本技术。固定 化技术可对完整细胞进行固定，可最大限度地维持生物酶活性和稳定性， 提高单位体积内微生物密度和流动速率，修复过程不受稀释率高于微生物
生长率的限制，固定化微环境有利于屏蔽外界环境的不利影响，固定化颗 粒的水力性质和沉降性能可灵活控制，是一项高效实用的污染环境修复技 术。
硝基苯、苯胺类污染物，它们在水体和底泥中具有较高的稳定性。其 密度分别为1.205、 1.022,其密度>水，进入水体的硝基苯、苯胺会沉入 水底，使底泥遭受污染。它们在水中又都有一定的溶解度，随时间延长又 会造成水体污染。
2005年11月13日吉林双苯厂苯胺车间发生爆炸，引发大量硝基苯泄 漏。双苯厂的含硝基苯废水流入松花江，导致江水和底泥污染。
松花江污染区域大、土著微生物很难自发形成优势降解菌群，污染底 泥的特殊性质无疑对生物修复提出更高的要求，必须筛选组合优势降解菌 群，而且微生物固定化颗粒其密度>水，才能使优势降解微生物菌群接触 到污染底泥，达到去除有机污染物的目的。
为了实现上述微生物固定化修复技术对硝基苯类污染底泥的有效修 复，本技术发明了一种沸石为载体的微生物混合菌固定化沸石颗粒制备方 法。
发明内容
本发明的目的是提供一种沉积效果好、应用方便的混合菌固定化颗粒 的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是用沸石为载体将对数生长 期的混合菌进行吸附固定，即为将15-25ml的菌液和30-40g的沸石混合加 入到含有硝基苯类溶液中的培养基，在兼性厌氧条件下，恒温培养4-6天， 取出40-50ml菌悬液，而后补充相同体积的含有硝基苯的培养基，在兼性
厌氧条件下、恒温培养2-3天即为增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有
混合菌的沸石颗粒。
所述含有硝基苯类污染物的培养基中硝基苯类污染物的浓度为25-35 mg/L。
所述沸石为粒度在0.05-0.15 cm3，用水洗涤3-5次，浸泡过夜后风干 的沸石。所述培养基为葡萄糖0.05-0.2%、蛋白胨0.02-0.06%、酵母嗇 0.03-0.06 %、 NaCl 0.3-0.6%、 K2HPO40.4-0.5% 、 KH2P04 0.1-0.4 %、 MgS04.7H20 0.02-0.06 0/o 、 pH7.2 ~ 7.5
原理用于修复污染底泥以无机载体沸石作为载体材料，釆用吸附固 定方法。对选择的高效降解硝基苯的混合微生物进行固定化，制备混合菌 颗粒；将制备的固定化生物产品对硝基苯和苯胺污染的底泥进行修复。
本发明可修复污染底泥中的硝基苯、苯胺类污染物及密度〉水的有机
5亏_^物
本i:明具有如下优点
1. 本发明选择沸石为载体，沸石平均比重为2.12g/cr^，体积在0.05-0.15
cm3范围较合适，其孔隙度适合微生物的吸附固定，可对完整的微生物细胞 进行固定，避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性；增殖速度快、 效果好。
2. 本发明选择的微生物为兼性厌氧混合菌，固定化后的微生物能长期 保持活性；固定化细胞颗粒的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物 质对微生物体的恶性竟争、吞噬和毒害，使其在复杂环境条件下稳定地发 挥高效能。
3. 沸石为载体的固定化细胞颗粒对于静止或缓流污染水体中的底泥， 可根据污染程度直接投加，操作简单，无需改变自然环境和修筑大规模构 筑物，不产生二次污染。
4. 沸石来源丰富，价格便宜。节省投资，简化流程，实践上安全可靠， 经济上费用低廉，工程投资仅为物理法、化学法修复的30-50%。
5. 本发明采用生物修复主要指微生物修复，具体为无机载体沸石吸附 固定微生物，对混合菌吸附速度快、增殖效果好。将其制备的固定化 细胞颗粒投放到硝基苯类污染水体-底泥环境中，可使底泥中硝基苯和 苯胺得到有效去除，当底泥中硝基苯、苯胺初始浓度为4.41 mg/kg、 37.84mg/kg时，硝基苯的降解率可达100%，苯胺降解率为52. 51%。
图1为本发明固定化微生物沸石颗粒降解底泥中硝基苯的处理图。 图2为本发明固定化微生物沸石颗粒降解底泥中苯胺的处理图。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。 实施例i
沸石固定微生物的方法，具体步骤为先制备种子液，同时处理无机
载体沸石；然后混合菌株在沸石中进行吸附固定增殖。具体步骤如下
U)种子液的制备
在兼性厌氧条件下，所述兼性厌氧条件，将160ml富集培养基加入到 250ml厌氧瓶中，灭菌，冷却后加入18 ml种液，放入28'C的培养箱中恒 温静止培养一周，使其微生物处于对数生长期，备用。
所述厌氧瓶为医用输液瓶；培养基按重量百分比计为葡萄糖0.1%、 蛋白胨0.05 % 、酵母膏0.05 % 、 NaCl 0.5%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04'7H20 0.05 % 、 pH7.2。灭菌条件为0.1Mpa湿热灭菌30分屏。所述 种液为含有1. 5ml浓度为3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厌氧混合微生物，兼 性厌氧混合微生物包括施氏假单胞菌(尸化wA/wo"os WMteerO、粪产碱菌 (」/ea/Zge""々eca/zS )、巨大芽孢杆菌(5ac/〃船)和阴沟肠杆菌 (五"fera^"erc/oacae),(上述菌种均可通过巿购得到)，其体积份数比为1: 1: 1: 1 ,加入的硝基苯溶液使其浓度达到26. 25mg/L。
(2) 载体的预处理
沸石(购自辽宁省法库沸石矿)，将大块沸石破碎，使粒度范围为 0.05-0.15 cm3。用自来水洗涤3次，并用自来水浸泡过夜，次日除水后风干， 然后称沸石30g加入到100ml具塞的广口瓶中，瓶口用8层纱布包好，放 入灭菌锅中灭菌，备用。灭菌条件为0.1Mpa湿热灭菌30分钟。
(3) 混合菌株在沸石无机载体中的固定
将上述装有30g沸石的100ml广口瓶中分别加入45ml富集培养基、 0. 45ml硝基苯溶液(硝基苯的浓度为3 mg/ml )和20ml种子液，在兼性厌 氧条件下、28'C恒温培养箱内静止培养。所述富集培养基与种子液制备所 用的培养基相同，所述种子液为上述已制备好的兼性厌氧混合菌液。
(4) 固定化细胞的增殖
从上述装有沸石载体的广口瓶中倒出40ml残余菌体悬浮液，然后加入 同样体积的新鲜培养基及0. 35ml硝基苯溶液，使硝基苯的浓度为 "."mg/L。在兼性厌氧条件下、28'C恒温培养箱内培养约3天即为增殖一 次，共增殖三次，分别增殖69h 、 51 h和48h;所述培养基与种子液制备 所用的培养基相同。完成每次增殖时瓶中增殖液呈现浑浊，有气体逸出， 苦杏仁味消失并产生臭味，此时需更换新鲜的培养基即为一次增殖。用上 述方法制得的固定化沸石-混合菌，空隙合适、表面积大、吸附性好，为混 合菌提供了更多的吸附固定点，提高了固定化效率，使单位质量细胞数量 增多、密度增大，经过三批增殖后固定化沸石颗粒吸附固定的微生物细胞 数可达到l.lxl08cfu/g。
(5) 对底泥的修复效果
实验采用3L的广口玻璃瓶，泥水重量份数比为l: 4,所述泥为吉林石
化二苯厂污水排放明渠中的底泥，水为自来水。其处理目标为泥水混合物，
即600g泥，2400g水，共3. OL.投加NaH2P041.5g K2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后将重量百分比为5%固定化沸石颗粒投入到 上述污染水体和底泥环境中。处理前首先测定底泥中硝基苯的初始浓度为 4.41 mg/kg干泥。而后在兼性厌氧条件，室温(13°C-23°C)静止放置。固 定化沸石颗粒对底泥中硝基苯的处理效果参见图1。从图1看出经过5天处 理，底泥中硝基苯污染物的浓度从4.41 mg/kg (干泥)降低到0.95mg/kg， 降解率为78.46%。 7天后测定底泥中硝基苯的含量，为未检出，全部被降 解，说明固定化沸石颗粒对底泥中硝基苯污染物修复效果是另人满意的。 实施例2
与实施例l不同之处在于
(1) 种子液的制备
在兼性厌氧条件下，将180ml富集培养基加入到250ml厌氧瓶中，灭 菌，冷却后加入16 ml种液，放入28'C的培养箱中恒温静止培养一周，使 其微生物处于对数生长期，备用。
所述培养基按重量百分比计为葡萄糖0.2%、蛋白胨0.06%、酵母 膏0.06%、 NaC10.6%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04.7H20 0.05 % 、 pH7.2。灭菌，灭菌条件为0.1Mpa湿热灭菌30分钟。所述种液为含有2ml 浓度为3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厌氧混合微生物，硝基苯的浓度为 30mg/L。
(2) 载体的预处理
沸石(购自辽宁省法库沸石矿)，将大块沸石破碎，使粒度范围为 0.05-0.15 cm3。用自来水洗涤3次，并用自来水浸泡过夜，次日捞出风干， 然后称沸石40g加入到100ml具塞的广口瓶中，瓶口用8层纱布包好，放 入灭菌锅中灭菌，备用。灭菌条件为0. 1Mpa湿热灭菌30分钟。
(3) 混合菌株在沸石无机载体中的固定
将上述装有40g沸石的100ml广口瓶中分别加入40ml富集培养基、 0. 40ml硝基苯溶液(硝基苯的浓度为3mg/ml)和20ml种子液，在兼性厌 氧条件下、28X:恒温培养箱内静止培养。
(4) 固定化细胞的增殖
从上述装有沸石载体的广口瓶中倒出50ml残余菌体悬浮液，然后加入 同样体积的新鲜增殖培养基及0.5ml硝基苯溶液，使硝基苯的浓度为 30mg/L。在兼性厌氧条件下、28X:恒温培养箱内培养约2天即为增殖一次， 共增殖三次，分别增殖60h 、 50 h和48h;所述培养基与种子液制备所用 的培养基相同。完成每次增殖时瓶中增殖液呈现浑浊，有气体逸出，苦杏 仁味消失并产生臭味，此时需更换新鲜的培养基即为一次增殖。用上述方 法制得的固定化沸石-混合菌，空隙合适、表面积大、吸附性好，为混合菌 提供了更多的吸附固定点，提高了固定化效率，使单位质量细胞数量多、 密度大，经过三批增殖后固定化沸石颗粒吸附固定的微生物细胞数可达到
1.4xl010cfb/g。
(5)固定化沸石颗粒使用方法及对底泥的修复效果 实验釆用3L的广口玻璃瓶，泥水重量份数比为1: 2，所述泥为吉林石 化二苯厂污水排放明渠中的底泥，水为自来水。其处理目标为泥水混合物， 1000 g泥，2000g水，共3. OL.投加NaH2PO41.5gK2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后将重量百分比为5%固定化沸石颗粒投入到 上述污染水体和底泥环境中。处理前首先测定底泥中苯胺的初始浓度分别 为37.84 mg/kg干泥。而后在兼性厌氧条件，室温(13°C-23°C)静止放置。 固定化混合菌沸石颗粒对底泥中苯胺的处理效果参见图2。苯胺较难处理， 从图2可以看出处理5天后，降解率仅为41.70%。经过2个月的处理，底 泥中苯胺污染物的浓度从37.84 mg/kg降低到17.97mg/kg，降解率为52. 51%。 结果说明混合菌固定化沸石颗粒能够抗底泥中的不同毒物，在不良环境中 可发挥多种菌的协同作用，使底泥中污染物含量不断降低，能够逐渐达到 彻底去除的目标，固定化混合菌沸石颗粒修复底泥中苯胺污染物也是可行 的。
权利要求
1.一种混合菌固定化颗粒的制备方法，其特征在于用沸石为载体将对数生长期的混合菌固定，即为将15-25ml的菌液和30-40g的沸石混合加入到含有硝基苯类溶液中的培养基，在兼性厌氧条件下，恒温培养4-6天，取出40-50ml菌悬液，而后补充相同体积的含有硝基苯的培养基，在兼性厌氧条件下、恒温培养2-3天即为增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有混合菌的沸石颗粒。
2. 按权利要求1所述的混合菌固定化颗粒的制备方法，其特征在于 所述含有硝基苯类污染物的培养基中硝基苯类污染物的浓度为25-35 mg/L。
3. 按权利要求1所述的混合菌固定化颗粒的制备方法，其特征在于 对数生长期的混合菌为施氏假单胞菌、粪产碱菌、巨大芽孢杆菌和阴沟肠 杆菌，其按体积份数比计1: 1: 1: 1，在含有硝基苯类污染物的培养基中 恒温培养4-6天得到的混合菌。
4. 按权利要求1所述的混合菌固定化颗粒的制备方法，其特征在于 沸石为用水洗涤3-5次，浸泡过夜后风干的。
全文摘要
本发明涉及混合菌固定化颗粒的制备方法，具体地说是采用沸石为载体对混合菌进行固定。具体为将制备好的种子液接种到处理过的沸石载体上，并在兼性厌氧条件下、恒温培养4-6天条件下进行吸附、培养和增殖2-3次，得到固定有混合菌的沸石颗粒。本发明具体采用无机载体沸石吸附固定混合菌，对多种菌吸附速度快、增殖效果好，操作简单，无需改变自然环境和修筑大规模构筑物，不产生二次污染。将其制备的固定化细胞颗粒投放到硝基苯类污染水体-底泥环境中，可使底泥中硝基苯和苯胺得到有效去除，当底泥中硝基苯、苯胺初始浓度为4.41mg/kg、37.84mg/kg时，硝基苯的降解率可达100％，苯胺降解率为52.51％。本发明的沸石来源丰富，价格便宜。
文档编号C12N11/00GK101177680SQ200610134238
公开日2008年5月14日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者张春桂, 张海荣, 李培军, 许华夏, 鞠京丽 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所