专利名称：：使用含有非常规碱基的引物的等温链置换扩增的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于在无热循环下扩增核酸分子的方法。
背景技术：
：用于从核酸序列群内扩增特定序列的使用最广泛的方法是聚合酶链式反应(PCR)法(DieffenbachC和DvekslerG编辑.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPress,PlainviewNY)。在这种扩增方法中，使用通常在互补链上具有15至30个核苷酸长度并且位于待扩增区域两末端的任意末端上的寡核香酸以便在变性的单链DNA模板上引发DNA合成。变性、引物杂交和使用热稳定性DNA聚合酶合成DNA链的连续循环允许以指数方式扩增在引物之间的序列。RNA序列可以通过首先使用逆转录酶复制以产生cDNA拷贝而得到扩增。可以通过多种手段检测扩增的DNA片段，其中所述手段包括凝胶电泳、与标记探针杂交、利用允许后续鉴定(例如通过酶联测定法)的标记性引物(taggedprimer)、利用与靶DNA杂交时产生信号的焚光标记性引物(例如Beacon和TaqMan系统)。PCR的一个不利之处是需要加热和冷却扩增混合物的热循环仪以使DNA变性。因此，扩增不能在原始位点上实施或不能在实验室环境之外轻易地搡作。除PCR以外，已经开发用于检测和扩增特定序列的多种其它技术。一个实例是连4妄酶链式反应(BaranyF,GeneticdiseasedetectionandDNAamplificationusingclonedthermostableligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193(1991))。除依赖于扩增反应期间靶热变性的常规DNA扩增方法之外，在扩增反应期间不需要模板变性的众多方法已经得到描述并且因此称作等温扩增技术。等温扩增首先于1992年得到描述(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG和ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992))并被称作链置换扩增法(SDA)。从那时以来，已经描述众多其它的等温扩增技术，包括使用RNA聚合酶来拷贝RNA序列而不拷贝对应基因组DNA的转录介导性扩增法(TMA)和基于核酸序列的扩增法(NASBA)(GuatelliJC、WhitfieldKM、KwohDY、BarringerKJ、RichmannDD和GingerasTR.Isothermal,invitroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodeledafterretroviralreplication.PNAS87:1874-1878(1990);KievitsT、vanGemenB、vanStrijpD、SchukkinkR、DircksM、AdriaanseH、MalekL、SooknananR、LensP.NASBAisothermalenzymaticinvitronucleicacidamplificationoptimizedforthediagnosisofHIV-1infection.JVirolMethods.1991年12月；35(3):273-86)。基于DNA的其它等温技术包括其中DNA聚合酶延长针对环状模板的引物的滚环扩增法(RCA)(FireA和XuSQ.Rollingreplicationofshortcircles.PNAS92:4641-4645(1995)、使用用于輩巴^r测的环状4笨针的分枝扩增法(RAM)(ZhangW,CohenfordM、LentrichiaB、lsenbergHD、SimsonE、LiH、YiJ、ZhangDY.DetectionofChlamydiatrachomatisbyisothermalramificationamplificationmethod:afeasibilitystudy.JClinMicrobiol.2002年1月；40(l):128-32.)以及最近的使用解螺旋酶替代加热以解开DNA链的解螺旋酶依赖性等温DNA扩增法(HDA)(VincentM，XuY,KongH.Helicase-dependentisothermalDNAamplification.EMBO2004年8月接收；5(8):795-800)。近来，已经描述了DNA扩增的等温方法(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG和ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992)。传统扩增技术依靠在扩增反应的每个循环中靶分子变性和复性的连续循环。DNA的热处理在某种程度上导致DNA分子剪切，因此当DNA有限的时候，如在从源于发育胚泡内的少数细胞中分离DNA时，或特别是在DNA已经是片段化形式的情况下，如在组织切片、石蜡块和远古DNA样品内，这种加热-冷却循环可能进一步损伤DNA并引起扩增信号损失。等温方法不依赖于模板DNA的连续变性以产生充当用于进一步扩增的模板的单链分子，而依靠由特异限制性内切核酸酶在恒定温度下对DNA分子的酶切割。称作链置换扩增(SDA)的技术依靠某些限制酶切开半修饰DNA中的未修饰链的能力以及5'-3'外切核酸酶缺损的聚合酶延长并置换下游链的能力。随后通过有义反应及反义反应的偶联实现指数性扩增，在所述的反义反应中来自有义反应的置换链充当反义反应的模板(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG和ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992)。此类才支术已经用于成功地扩增结核分枝杆菌(綺coZ^c欲/謹励e腦/節'5)(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG禾口ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992)、HIV-1、丙型肝炎肝病毒和HPV-16(NuovoG.J.,2000)、沙眼衣原体(C/z/画j^加c/zo廳fe)(SpearsPA、LinnP、WoodardDL和WalkerGT.SimultaneousStrandDisplacementAmplificationandFluorescencePolarizationDetectionofChlamydiatrachomatis.Anal.Biochem.247:130-137(1997)。SDA的使用迄今依赖修饰的硫代磷酸核苦酸以便产生半-硫代磷酸DNA双链体，其中所述的双链体在修饰的链上耐酶切割，导致非酶消化的酶切割以推动置换反应。然而，最近已经设计数种"切口，，酶。这些酶不以传统方式切割DNA，而在DNA链的一条链上产生切口。"切口"酶包括N.Alwl(XuY、LunnenKD和KongH.EngineeringanickingendonucleaseN.Alwlbydomainswapping.PNAS98:12990-12995(2001)、N.BstNBl(MorganRD、CalvetC、DemeterM、AgraR、KongH.CharacterizationofthespecificDNAnickingactivityofrestrictionendonucleaseN.BstNBl.BiolChem.2000Nov;381(ll):1123-5.)和Mlyl(BesnierCE、KongH.ConvertingMlylendonucleaseintoanickingenzymebychangingitsoligomerizationstate.EMBO2001年9月4妄受;2(9):782画6.电子版2001年8月23日)。此类酶的使用因而将简化SDA方法。此外，已经通过使用热稳定性限制酶(Aval)和热稳定性Exo-聚合酶(Bst聚合酶)的组合改良了SDA。该组合已经证实增加反应的扩增效率，从108倍扩增至101()倍扩增，以致有可能使用该项技术来扩增独特的单拷贝分子。使用热稳定性聚合酶/热稳定性酶组合的所得扩增系数(factor)是109数量级(MiIIaM.A.、SpearsP.A.、PearsonR.E.和WalkerG.T.UseoftheRestrictionEnzymeAvalandExo-BstPolymeraseinStrandDisplacementAmplification.Biotechniques199724:392-396)。迄今，全部等温DNA扩增技术均需要在启动扩增之前加以变性的初始双链模板DNA分子。此外，扩增仅从每一个引发事件(primingevent)中启动一次。本发明的发明人现在已开发利用酶和引物并且不需要反复温度循环的扩增方法。
发明内容在第一方面，本发明提供了用于等温DNA扩增的方法，该方法包括向待扩增的DNA提供扩增混合物，该扩增混合物包含与DNA的区域至少部分互补并含有非常-见碱基的第一引物，与DNA的区域至少部分互补并含有非常规碱基的第二引物，DNA聚合酶，能够进行链置换的酶，识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除石咸基的酶；以及在基本上无热循环下扩增DNA。任选地，DNA可以在添加扩增混合物之前、期间或之后进行变性。优选地，第一引物与DNA的第一链的区域至少部分互补并且第二引物与DNA的第二链的区域至少部分互补。第一引物和第二引物可以是寡核苷酸、寡核苷酸类似物、具有嵌合特征的寡核苷酸如PNA/寡核苷酸或INA/寡核苷酸。优选地，引物是脱氧寡核苷酸。优选地，寡核苷酸类似物选自嵌入核酸(INA)、肽核酸(PNA)、己糖醇核酸(HNA)、MNA、阿卓糖S孚核酸(altritolnucleicacid,ANA)、锁核酸(lockednucleicacid，LNA)、环己基核酸(CAN)、CeNA、苏糖核酸(TNA)、(2'-NH)-TNA、基于核酸的缀合物、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、(3-D-木糖隱LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、二环-DNA、6-氨基-二环-DNA、5-epi画二环画DNA、a-二环誦DNA、三环-DNA、二环[4.3.0]-DNA、二环[3.2.1]-DNA、二环[4.3.0]酰胺-DNA(Bicyclo[4.3.0]amide-DNA)、β-D-吡喃核糖基-NA(β-D-Ribopyranosyl-NA)、a-L-吡喃来苏糖基-NA((3-D-Lyxopymnosyl-NA)、2'-R-RNA、2'-OR-RNA、a-L-RNA和P-D-RNA及它们的混合物和它们的杂交体(hybrid),以及它们的磷原子修饰物，例如但不限于硫代磷酸酯、磷酸甲基酯、亚磷酰胺、二碌u代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯。此外，不含磷的化合物可以用来与核苷酸(例如但不限于曱基亚胺甲基(methyliminomethyl)、formacetate、thioformacetate)及包含酰胺的接头基团(linkinggroup)连接。尤其，核酸和核酸类似物可以包含一个以上嵌入剂假核苷酸(intercalatorpseudonucleotide)。INA意指根据此处引入作为参考的WO03/051901、WO03/052132、WO03/052133和WO03/052134(UnestA/Sj受予HumanGeneticSignaturesPtyLtd)所教导的嵌入核酸。INA是包含一个以上嵌入剂假核苷酸(IPN)分子的寡核苦酸或寡核苦酸类似物。当含有非常规碱基的引物与DNA结合时，该引物形成由酶识别的位点。非常规碱基(即非常规的DNA碱基)此处定义为除腺噤呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟。票呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能够插入DNA主链内的化学实体。非常规碱基的实例包括，但不限于脱氧次黄苷、8-脱氧鸟噤呤、羟基尿嘧啶、5-曱基-dC、5-羟基尿苷、5陽溴-dU、含有胞嘧啶的肌苷(lnosinewithC)、核糖核苷酸和尿嘧啶。更优选地，非常规碱基是脱氧次黄苷。然而，可以理解的是非常规碱基实际上不必需具有核苷酸的结构。引物可以具有一个以上非常规碱基。在一些情况下，两个以上非常规石成基可以改善扩增过程。非常规碱基可以定位密及或由至少几个常规碱基隔开。DNA聚合酶可以是任何合适的聚合酶，如Taq聚合酶Stoffel片段、Taq聚合酶、AdvantageDNA聚合酶、AmpliTaq、AmplitaqGold、TitaniumTaq聚合酶、KlenTaqDNA聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、AccuprimeTaq聚合酶、Pfu聚合酶、PfU聚合酶turbo、Vent聚合酶、VentExo-聚合酶、Pwo聚合酶、9。NmDNA聚合酶、Therminator、P&DNA聚合酶、ExpandDNA聚合酶、rTthDNA聚合酶、DyNAzymeT"EXT聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶1、DNA聚合酶、T7聚合酶、SequenaseTM、T4DNA聚合酶、BstB聚合酶、phi-29DNA聚合酶和DNA聚合酶Beta。链置换酶可以是任意合适的酶，如解螺旋酶、AP内切核酸酶、能够进行链置换的错配修复酶或能够进行链置换的遗传(或另外)修饰的酶。在优选的形式中，DNA聚合酶还具有链置换能力。DNA聚合酶可以是具有链置换能力的任何合适的聚合酶。这种DNA聚合酶的实例包括，但不限于KlenowExo-(NewEnglandBiolabs(NEB)目录号M0212S)、BstDNA聚合酶大片段(NEB目录号M0275S)、VentExo-(NEB目录号M0257S)、DeepVentExo國(NEB目录号M0259S)、M-MuLV逆转录酶(NEB目录号M0253S)、9。NmDNA聚合酶(NEB目录号M0260S)和Phi29DNA聚合酶(NEB目录号M0269S)ThermoPhi(Prokariaehf)。优选地，DNA聚合酶是KlenowExo-。优选地，DNA聚合酶是外切核酸酶缺损的。酶可以是任意合适的酶，其中所述的酶能够识别双链DNA内的非常规石咸基并可以产生切口或切除在非常规碱基处或其附近的碱基。所述酶的实例包括，但不限于内切核酸酶V(脱氧次黄苦3'内切核酸酶XNEB目录号M0305S)、Fpg(NEB目录号M0240S)、hOGGl(NEB目录号M0241S)、RNA酶H(NEB目录号M0297S)、APE1(NEB目录号M0282S)、内切核酸酶III(NEB目录号M0268S)、内切核酸酶IV(NEB目录号M0304S)、内切核酸酶VIII(NEB目录号M0299S)、T7内切核酸酶I(NEB目录号M0302S)、USER酶(NEB目录号M5505S)、McrBC(NEB目录号M0272S)和尿嘧啶DNA糖基化敏NEB目录号M0280S)。优选地，所述酶是内切核酸酶V。将理解的是在本发明方法中可以制造或获得识别双链DNA内的非常规碱基并根据需要通过切割或造成碱基除去而起作用的其它合适的酶。用于DNA扩增所需要的添加剂包括本领域已知的核苷酸、緩沖液或稀释剂如镁离子或锰离子、辅助因子等。所述扩增混合物还可以含有核苷酸、緩冲液或稀释剂如镁离子或锰离子、辅助因子和合适的添加剂，如单链结合蛋白如T4gp32或RecA。扩增可以在其中酶具有所需要活性的任何合适温度下实施。通常，温度可以是约20。C至约75t:、约25。C至6(TC或约3(rC至45i:。对于本研究中所用的酶，发现约42。C是特别适合的。将理解的是可以使用较高或较低的其它温度并将包括环境温度或室温。重要的是，本发明不需要热循环以扩增核酸。在一个优选形式中，DNA用修饰剂预处理，其中所述的修饰剂在形成单链修饰的DNA的条件下修饰胞嘧咬碱基，但不修饰5'-曱基-胞嘧咬碱基。优选地，修饰剂选自亚硫酸氢盐、乙酸盐或柠檬酸盐并且处理未造成大量的DNA片段化。更优选地，修饰剂是亚硫酸氢钠，其中亚硫酸氢钠是一种在水存在下将胞嘧咬修饰成尿嘧咬的试剂。亚硫酸氬钠(NaHS03)与胞嘧啶的5,6-双键很容易反应以形成易于脱氨在温和碱性条件下除去亚硫酸酯基团，导致尿嘧啶形成。因此，全部胞嘧啶有可能转化成尿嘧啶。然而，因曱基化保护作用，任何曱基化胞嘧啶不能被修饰试剂转化。用于亚辟u酸氢盐处理核酸的优选方法可以在HumanGeneticSignaturesPtyLtd(Australia)名下的WO2004/096825内找到，其中所述文献此处引用作为参考。如果处理的DNA的两条链均需要在相同扩增反应内进行扩增，则可以使用四条引物(即每条修饰的DNA链用两条引物)。在第二方面，本发明提供用于等温DNA扩增的试剂盒，该试剂盒包含DNA聚合酶；能够进行链置换的酶；以及识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基的酶。优选地，所述试剂盒还包含用于DNA扩增所需要的添加剂。优选地，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。在优选的形式中，所述DNA聚合酶与能够进行链置换的酶是相同的酶。在第三方面，本发明提供用于等温DNA扩增的引物，该引物含有至少一个内部的非常M^成基并且当该引物与DNA的区域结合时，形成由能够产生切口或切除在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近的碱基的酶所识别的位点。优选地，非常规减基是除腺嘌呤(A),胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能够插入DNA主链内的化学实体。更优选地，非常规碱基选自由下列所組成的组中脱氧次黄苷、8-脱氧鸟嘌呤、5-曱基胞嘧啶、羟基尿嘧啶、核糖核苷酸和尿嘧啶。更优选地，非常规》成基是脱氧次黄香。在第四方面，本发明提供根据本发明第二方面的试剂盒的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。在第五方面，本发明提供根据本发明第四方面的引物的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。在第六方面，本发明提供具有链置换能力的DNA聚合酶的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。在第七方面，本发明提供识别双链DNA内非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基的酶的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。在第八方面，本发明提供具有链置换能力的DNA聚合酶以及识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基部位或其附近产生切口或切除碱基的酶的用途，用于在基本上无热循环下的DNA。包括，但不限于，疾病检测、扩增DNA或RNA中所需的基因或区段(segment)、SNP检测、实时扩增法、扩增亚石危酸氢盐处理的DNA、全基因组扩增方法、作为克隆方法的附加、原位(/"Ww)扩增细胞学标本上的DNA(如检测切片或才未片内的樣i生物)、检测食品污染中的微生物、扩增染色体内的断点(如各种癌症中的BCR-ABL易位)、扩增已插入染色体的可能具有致癌性或预示疾病进程的序列(如HPV片段插入物)、检测正常细胞与癌细胞内的曱基化序列与非曱基化序列以及原位检测用于胚泡发育常态的IVF试验中的曱基化改变。通过在等温扩增之前实施RNA的逆转录而用于RNA。此外，本发明不需要用于扩增的加热或冷却。预期本发明的方法可以在"实地"，即在室温或环境温度下实施，不需要有动力的实验设备。在本发明范围内，除非上下文另外要求，词语"包含"或变化如"包含"或"包含"将理解为表示包括所述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其它的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。对已经在本说明书内包含的文件、行为、材料、装置、条款(article)等的讨论，目的仅在于提供本发明的上下文背景。不能认为因为任意或全部的这些事项先于本发明的开发而存在，其就形成现有技术基础的部分或作为与本发明相关领域内的常识。为了可以更清楚地理解本发明，优选的实施方式将参考如下附图和实施例力口以描述。图1显示本发明的核酸扩增方法的示意图2显示使用本发明方法扩增靶序列的结果的琼脂糖凝胶分析；图3显示使用本发明方法扩增靶序列的结果的琼脂糖凝胶分析；图4显示等温DNA扩增方法与常规聚合酶链式反应(PCR)直接比较的琼脂糖凝胶分析；图5显示扩增来自人基因组DNA的12SrDNA基因；图6显示等温扩增多种人乳头瘤病毒(HPV)DNA的结果；图7显示测试NO变性对反应影响的等温扩增人乳头瘤病毒(HPV)DNA的结果；图8显示在引物中使用多种非常规》成基安置(placement)的等温扩增；图9显示使用含有核糖核苷酸的寡核苷酸引物与RNA酶H和Klenowexo-组合的等温扩增的结果；图IO显示使用含有8-脱氧鸟噤呤的寡核苷酸引物与RNA酶H和Klenowexo-组合的等温扩增的结果。具体实施例方式材料和方法非常规减基非常规碱基在本文中定义为除腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能够插入DNA主链内的化学实体。非常规碱基的实例包括，但不限于脱氧次黄苷、8-脱氧鸟噪呤或羟基尿嘧啶、5-曱基-dC、5-溴-dU、具有胞嘧啶的肌苷(lnosinew他C)、核糖核苷酸和尿嘧啶。已经发现非常规J威基脱氧次黄苷可用于本发明。应当指出非常规碱基实际上不需要具有核苷酸的结构以在本发明中发挥功能。引物可以使用任何可商业获得的DNA合成装置或自制(inhouse)DNA合成仪合成引物。非常规碱基可以使用标准亚膦酰胺(phosphoamidite)合成技术引入至引物的任何位置内。酶几种模式可用于实施本发明。I.含有由内切核酸酶V识别的非常规碱基即脱氧次黄苦的寡核苷酸。II.含有由酶FPg识别的非常规碱基即8-脱氧鸟。票呤或羟基尿嘧啶的寡核苷酸。III.含有由酶hOGGl识别的非常规碱基即8-脱氧鸟嘌呤或羟基尿嘧啶的寡核苦酸。IV.含有由RNA酶H识别的非常规碱基即核糖核苷酸的寡核苷酸。V.含有由尿嘧啶DNA糖基化酶或USER酶识别的非常规碱基即尿嘧啶的寡核芬酸。VI.含有由酶McrBC识别的非常规碱基即5-曱基胞嘧啶的寡核苷酸。能够进行链置换的酶包括Klenowexo-、BstDNA聚合酶大片段(largefragment)、Ventexo-、DeepVentexo-、M-MuLV逆转录酶、9°NmDNA聚合酶和PW29DNA聚合酶.DNA聚合酶可以是具有链置换能力的任何合适的聚合酶。所述DNA聚合酶的实例包括，但不限于Klenowexo-(NewEnglandBiolabs(NEB)目录号M0212S)、BstDNA聚合酶大片段(NEB目录号M0275S)、Ventexo-(NEB目录号M0257S)、DeepVentexo-(NEB目录号M0259S)、M-MuLV逆转录酶(NEB目录号M0253S)、9°NmDNA聚合酶(NEB目录号M0260S)和Phi29DNA聚合酶(NEB目录号M0269S)ThermoPhiTM(Prokariaehf)。优选地，DNA聚合酶是Klenowexo-。扩增混合物在引物内的非常My5烕基是N=脱氧次黄苦。能够进行链置换的DNA聚合酶是内切核酸酶V,识別双链DNA内的非常规碱基的酶是KlenowExo-，50ng引物，500uMdNTP，1mMMgCl2，反应容器内的9ulx1Stoffel缓冲液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,USA)扩增才艮据本发明的扩增以如下方式发生(见图1):第一引物与DNA(A)的一条链结合，DNA聚合酶延长第一引物，形成具有含非常规碱基(B)的第一条新合成链的双链分子，切割酶在延长的DNA(C)的非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基，能够进行链置换的链置换酶或DNA聚合酶置换新合成的第一链(D),第二引物与已置换的新合成的第一链(E)结合，DNA聚合酶延长第二引物，形成具有含非常规碱基(F)的新合成第二链的双链分子，切割酶在延长的DNA(G)的非常规-威基处或其附近产生切口或切除石咸基，能够进行链置换的链置换酶或DNA聚合酶置换新合成的第二链(H),第一引物与已置换的新合成的第一链(I)结合，并且该过程继续形成重复的新合成的DNA链(J)。聚合酶应当以5'-3'方向拷贝第一引物，如果该情况未发生，则反应将在第三轮扩增后因为切口位点丢失而停止，防止进一步扩增。以上反应随后将继续循环切割、延长和置换的重复轮次。引物通常由聚合酶再生以允许连续轮次的扩增。结果等温扩增的特异性为证实本发明的特异性，扩增反应在两种人工DNA(靶和非靶)分子上实施。靶5'AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG3'(SEQIDNO1)非靶5'AGGGAATTTTTTTTTGTGATGTTTTGGTGTGTTAGTTTGTTGTGTATATTTTGTTGTGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTTGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGATTTTAG3'(SEQIDNO2)两种寡核苷酸的差异是在全部非靶寡核苷酸中的全部CpG双联体由TpG双联体替换。等温扩增使用针对靶DNA序列检测的如下引物对加以实施引物#15'AGGGAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT3'(SEQIDN03)引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO4)非常规碱基是N二脱氧次黄苷。使用标准亚膦酰胺化学合成引物。扩增在如下条件下实施在9μL的xlStoffel缓沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,美国)内的50ng以上各寡核苷酸引物、500μMdNTP、1mMMgCl2、0.5U内切核酸酶V、2UKlenowExo-。8个皮摩尔的靶寡核苷酸和非靶寡核苷酸都进行102至10—4稀释。随后将lμl稀释的DNA添加至以上反应混合物内并在42℃温育2小时。l0μL扩增的产物与10μl水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂糖(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8O8O-O4)上解析以及使用Powerbase顶运行凝胶。标记是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶视觉化。图2显示使用亚硫酸氢盐曱基化的合成性靶序列和亚硫酸氢盐非曱基化的合成性非靶序列，在42℃温育2小时后所产生扩增产物的4%琼脂糖凝胶分析。该结果证实等温扩增反应的特异性。合成两种合成性寡核苷酸(110bp)(见下文)。使用含有单个内部次黄苷(I)碱基的寡核苷酸实施等温扩增，其中设计所述的寡核香酸旨在对亚硫酸氬盐曱基化的合成性靶DNA序列的扩增呈特异性。正如可以看出，反应对靶DNA分子的扩增呈特异性。甚至当存在过量的非耙DNA时，看不到来自非靶DNA的条带。反应对曱基化序列的检测是特异性的，并且甚至当模板高度丰富时，仍未扩增非曱基化序列。因此甚至在相对低的温度(42°C)上，有可能区分具有相对相似性的两种序列。等温扩增的效率为测定扩增的效率，通过本发明的方法扩增连续稀释的靶DNA。图3显示在42。C温育4小时后所产生的扩增产物的4%琼脂糖凝胶分析。箭头指示正确的扩增产物。在图3A中的双联体是含有完整引物序列和链置换产物的全长扩增产物的结果，其中所述的链置换产物含有次黄苷插入物的引物序列5'。引物对A含有如下寡核苦酸引物引物#15'AGGNAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT3'(SEQIDN05)引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO4)非常规碱基是N=脱氧次黄苷。引物对B含有相同的引物，但是反应补加1mMDTT。引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCNCGCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO6)非常规碱基是N=脱氧次黄苷。使用标准亚膦酰胺化学合成引物。扩增在如下条件下实施在9pl的xlStoffel緩冲液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity，美国)内的50ng以上各寡核苷酸引物、500dNTP、1mMMgCl2、0.5U内切核酸酶V、2UKlenowExo隱。靶DNA是110bp的合成性寡核苷酸<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(SEQIDNO1)8皮摩尔的靶DNA从l(T3至10々进行连续稀释。随后将1^1稀释的DNA添加至以上反应混合物内并在42°C温育4小时。l0ul扩增的产物与10W水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂糖(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8080-04)上解析以及使用Powerbasetm逸行凝胶。标记是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝月交视觉化。正如可从图3中看出，该方法能够在使用模板DNA的105稀释物时从靶DNA序列中扩增DNA。此外，如可从图3B中看出，与图3A相比，扩增通过添加DTT至1mM终浓度得以改善。这表示有可能从正确杂交的相同寡核苷酸中获得多个置换事件，这不同于其中从每个正确的引发事件内仅可以产生一个新拷贝的常规PCR。这表明在理论上，本发明的等温技术在扩增DNA序列方面甚至可能比PCR更敏感，因为可以从每个正确的引发事件中产生靶的多重拷贝。PCR扩增的比较为了与市场上的扩增标准比较本发明的效率，使用相同的引物和靶DNA实施PCR。使用如下引物实施PCR引净勿#15'AGGGAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT3'(SEQIDNO3)引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO4)非常规碱基是N^脱氧次黄苷。PCR反应混合物在总反应体积25[il内使用100ng以上各引物于x1Promega主混合物中制备。PCR产物的样品在ThermoHybaidPX2热循环仪内，在如下条件下扩增在95。C下30秒、在50。C下45秒、在68。C下45秒的25个扩增循环。耙DNA是110bp的合成性寡核苷酸<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage20</formula>8皮摩尔的靶DNA进行10-2至l0-8的连续稀释。随后将l)μl稀释的DNA添加至以上反应混合物内。l0μl的PCR衍生产物与10μl水混合，并且将PCR产物在4%琼脂糖凝胶(Invitrogen目录号G6000-04)上解析以及使用Powerbase顶运行凝月交。标记是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶视觉化。图4显示等温DNA扩增方法与常规聚合酶链式反应(PCR)的直接比较。使用PCR，仅可能在使用模板DNA的106稀释物时看到扩增的条带。利用25个扩增循环通常足以成功扩增多重拷贝的靶，如12S核糖体DNA序列。可以从结果中看出等温DNA扩增方法是用于DNA扩增的快速、敏感而特异的方法。该方法不需要昂贵的热循环设备，因此可以在任何常规实验室或甚至在夕卜科手术室(doctorssurgery)内实施。双链DNA的直接姿扩增图5显示来自人基因组DNA的12SrDNA基因的扩增。扩增在如下条件下实施50ng的每种寡核苷酸引物Fl5'AACAAAACTGCTCNCCAGAACACTACNAGCCACAGCTTAA-3'(SEQIDNO7)和Rl5'TGGTGAGGTTGATCNGGGTTTATCNATTACAGAACAGGCT-3'(SEQIDN08),在9μl的x0.5Stoffe緩冲液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,USA)内的500pMdNTP、1mMMgCl2和浓度150ng、15ng、1.5ng和0.15ng的1(il人基因组DNA(Promega目录号G147A)。反应混合物在95。C加热2分钟，随后在冰上骤冷(snap-chilled)。反应混合物随后补足在10的x0.5Stoffel緩冲液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,USA)内的0.5U内切核酸酶V、2UKlenowExo-和1mMDTT。2010ul扩增的产物与10(J水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂糖(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8080-04)上解析以及使用Powerbase顶运行凝胶。标记是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶视觉化。病毒DNA扩增从ATCC获得含有全长人乳头瘤病毒(HPV)病毒基因组HPVla(45021)、HPV16(45113D)和HPV18(45152D)的质粒。如供应者推荐提示那样制备质粒制品。在^f吏用Qiagen质粒midi试剂盒(目录号12143)纯化质粒后，对HPV-la和HPV-16，根据制造商说明书用历m/III(NEB目录号R0104S)或用C7al(NEB目录号R0197S)使质粒线性化。在无菌水中制备质粒的10倍连续稀释物以充当用于等温扩增的模板。等温扩增使用如下针对靶HPVDNA序列检测引物对实施HPV-la引物引物#15'GGAGGAGTTAGTGTCNCCTCAGCAACCTTATGCTGTCNTT3'(SEQIDN09)引物#25'GCACAGTGGGCACACNATGTTCAAAGATCNCAGAAGGAG3'(SEQIDNO10)HPV-16引物#15'CCAGCTGGACAAGCAGAACCNGACAGAGCCCATTAC3'(SEQIDNO11)引物#25'CCAAAGTACGAATGTCTACNTGTGTGCTTTGTACNCACAAC3'(SEQIDNO12)HPV-18引物#15'GCTGCAACCGAGCACNACAGGAACGACTCCAACGACNCAGAG31(SEQIDNO13)引物#25'ACAACATTGTGTGACNTTGTGGTTCGGCTCNTCGGGCTGG3'(SEQIDNO14)非常规碱基是N-脱氧次黄苷。使用标准亚膦酰胺化学合成引物。扩增在如下条件下实施在9μl的x1Stoffel緩冲液(PerkinElmer-AppliedBioSystems，FosterCity,美国)内的50ng以上各寡核苷酸引物、500jiMdNTP、1mMMgCl2、0.5U内切核酸酶V、2UKlenowExo-。制备纯化的质粒DNA从100ng/μl至100ng/μl的10倍连续稀释物。质粒稀释物在95℃加热2分钟，随后在冰上骤冷直至需要。随后将lμl稀释的DNA添加至以上反应混合物内并在42℃温育4小时。lOμl扩增的产物与10μl水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂糖(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8080-04)上解析以及使用PowerbaseTM运行凝胶。标记(M)是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶视觉化。结果示于图6。10倍连续稀释HPV18(45152D)以确定对于使用等温系统的扩增是否需要预加热。等温扩增使用如下针对HPV靶DNA序列检测引物对实施HPV-18引物#15'GCTGCAACCGAGCACNACAGGAACGACTCCAACGACNCAGAG3'(SEQIDNO13)引物#25'AAATTCCNGTTGACCTTCTATGTCACNAGCAATTAAGCGAC3'(SEQIDNO15)非常规碱基是N二脱氧次黄苷。使用标准亚膦酰胺化学合成引物。扩增在如下条件下实施在9μl的xlStoffel緩冲液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,美国)内的50ng以上各寡核苷酸引物、500|iMdNTP、1mMMgCl2、0.5U内切核酸酶V、2UKlenowExo-。制备纯化的质粒DNA从100ng/μl至1ng/μl的10倍连续稀释物。随后将lμl稀释的DNA在不进行预变性下添加至以上反应混合物内并在42℃温育4小时。lOμl扩增的产物与10μl水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂糖(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8080-04)上解析以及使用Powerbase顶运行凝胶。标记(M)是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶视觉化。结果示于图7。该结果提示在某些情况下不需要在等温扩增之前使双链DNA模板初始变性。非常规碱基的安置(placement)等温扩增使用如下针对以下輩巴序列检测的引物对实施5’AGGGAAFTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTAl、ATTTCGTTGCGGTTiFTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGAFTTCGGGGAFTTTAG3’(SEQIDNO1)野生型正向引物5'-AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO16)G5'-AGGGAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO3)C5'-AGGGAATTTTTTTTCGNGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO17)A5'-AGGGAATTTTTTTTCGCGNTGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO18)T5'-AGGGAATTTTTTTTCGCGANGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO19)野生型反向引物5'-CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCGCAACTMCCGAAAAAAC(SEQIDNO20)G5'-CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO4)C5'-CTAAAATCCCCGAAATNGCCGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO21)A5-CTAAAATCCCCGAANTCGCCGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO22)T5'-CTAAAATCCCCGAAANCGCCGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO23)非常规碱基是N-脱氧次黄苷。随后比较四对引物以确定次黄苷在寡核苦酸内安置的影响。使用标准亚膦酰胺化学合成引物。扩增在如下条件下实施在9pi的xlStoffel緩冲液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,美国)内的50ng以上各寡核苦酸引物、500(^MdNTP、lmMMgCl2、0.5U内切核酸酶V、2UKlenowExo-。制备从10—2稀释至10_6稀释的靶DNA的10倍连续稀释物。随后将l^il稀释的DNA添加至以上反应混合物内并在42°C温育4小时。lOpl扩增的产物与10μl水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂糖(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8080-04)上解析以及使用PowerbaseTM运行凝胶。标记(M)是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶视觉化并且结果示于图8。对已扩增DNA的结果表明当次黄香置换序列内的G时，反应更有效地进行。进一步的实验表明对于这个DNA扩增试验，次黄苷的优选位置是在其中次黄苷替换CpG双核苷酸内G的Cl。使用核糖核苷酸的扩增等温扩增使用针对如下靶DNA序列检测的引物对实施GGATTTTAG3'(SEQIDNO1)引物#15'AGGGAATmTnTCGrCrGrAUrGTTTCGGCGCGTTAGTrCGT3'(SEQIDNO24)引物#25'CTAAAATCCCCGAAAUrCrGrCrCGCGCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO25)非常规碱基是r二核糖核苷酸.使用标准亚膦酰胺化学合成引物。扩增在如下条件下实施在9ul的xlO反应缓冲液(或者NEB緩冲液l、幻enow緩冲液或Stoffel緩冲液)内的50ng以上各寡核苷酸引物、500fiMdNTP、lmMMgCl2、0.1URNA酶H、2.5U幻enowExo-。制备靶DNA从10—1至l(T3的10倍连续稀释物。随后将1^1稀释的DNA添加至以上反应混合物内并在42℃温育4小时。10ul扩增的产物与10pil水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂糖(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8080-04)上解析以及使用Powerbasetm逸行凝胶。标记(M)是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶-魄觉化并且结果示于图9使用8-脱氧鸟噤呤的扩增等温扩增使用针对如下靶DNA序列检测的引物对实施GGATTTTAG3'(SEQIDNO1)P#l5'AGGGAATTTTTTTTCGCNNNGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO26)P#25'CTAAAATCCCCGAAATCGGCCNNNGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO27)非常规碱基是NNNG二8-脱氧鸟嘌呤。引物使用标准亚膦酰胺化学合成。扩增在如下条件下实施在9ul的x10反应緩沖液x1Stoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems，FosterCity，美国)内的50ng以上各寡核苷酸引物、500dNTP、lmMMgCl2、lUFpg、2.5UKlenowExo-。制备靶DNA从10_1至10_3的IO倍连续稀释物。随后将1^1稀释的DNA添加至以上反应混合物内并在42℃温育4小时。10ul扩增的产物与10jil水混合，并且将扩增产物在E-Gel484%琼脂4唐(HR)凝胶(Invitrogen目录号G8080-04)上解析以及使用PowerbaseTM运行凝胶。标记(M)是E-Gel低分子量范围定量DNA梯(Invitrogen目录号12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系统在紫外光照射下使凝胶视觉化并且结果示于图10。本领域技术人员明白可以对如在具体实施方案中所示的本发明作出多种变化和/或修改而不脱离广义描述时的本发明的精神和范围。因此无论如何将本实施方案视作是说明性而非限制性的。权利要求1.用于等温DNA扩增的方法，该方法包括向待扩增的DNA提供扩增混合物，其中所述的扩增混合物包含与DNA的区域至少部分互补并含有非常规碱基的第一引物，与DNA的区域至少部分互补并含有非常规碱基的第二引物，DNA聚合酶，能够进行链置换的酶，识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基的酶；以及在基本上无热循环下扩增DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA在添加扩增混合物之前、期间或之后进行变性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一引物与DNA的第一链的区域至少部分互补并且所述第二引物与DNA的第二链的区域至少部分互补。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第二引物是寡核苷酸、寡核苷酸类似物、具有嵌合特征的寡核苷酸如PNA/寡核脊酸或INA/寡核苷酸。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述引物是脱氧寡核苷酸。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述引物含有两个以上非常规碱基。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，当引物与DNA结合时，该引物形成由酶识别的位点。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述非常M^基是除腺噤呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟噤呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能够插入DNA主链内的化学实体。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述非常规碱基选自由下列所组成的组中脱氧次黄苷、8-脱氧鸟噤呤、羟基尿嘧啶、核糖核苷酸、5-曱基胞嘧咬和尿嘧啶。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述非常规石威基是脱氧次黄苷。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述链置换酶选自由下列所组成的组中解螺旋酶、AP内切核酸酶和任何能够进行链置换的酶中的错配修复酶。12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述DNA聚合酶还具有链置换能力。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是外切核酸酶缺损的。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述能够识别双链DNA内非常规碱基的酶选自由下列所组成的组中内切核酸酶V(脱氧次黄苷3'内切核酸酶)、Fpg、hOGGl、RNA酶H、McrBC和尿嘧啶DNA糖基化酶。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述酶是内切核酸酶V。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，该方法还包括用于DNA扩增所需要的添加剂。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述添加剂包括核苷酸、緩冲液或稀释剂如镁离子或锰离子、辅助因子和单链结合蛋白如T4gp32。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，扩增在其中酶具有所需要活性的任何合适的温度下实施。19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述温度是从约20℃至约75℃。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述温度是约42℃。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述DNA用修饰剂预处理，其中，所述的修饰剂在形成单链修饰的DNA的条件下修饰胞嘧咬碱基，但是不修饰5'-曱基-胞嘧咬碱基。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述修饰剂选自亚硫酸氢盐、乙酸盐或柠檬酸盐并且处理未造成大量的DNA片段化。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述修饰剂是亚硫酸氢钠。24.用于等温DNA扩增的试剂盒，该试剂盒包含DNA聚合酶；能够进行链置换的酶；以及识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除-咸基的酶。25.根据权利要求24所述的试剂盒，该试剂盒还包含用于DNA扩增所需要的添加剂。26.根据权利要求24所述的试剂盒，该试剂盒还包含使用该试剂盒的i^明书。27.根据权利要求24至26中任一项所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶和能够进行链置换的酶是相同的酶。28.用于等温DNA扩增的引物，其中，所述引物含有至少一个内部的非常规碱基并且当与DNA的区域结合时，形成由能够在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基的酶识别的位点。29.根据权利要求28所述的引物，其中，所述非常规碱基是除腺。票呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能够插入DNA主链内的化学实体。30.根据权利要求29所述的引物，其中，所述非常规碱基选自由下列所组成的组中脱氧次黄苷、8-脱氧鸟噤呤、羟基尿嘧啶、核糖核苷酸、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。31.根据权利要求30所述的引物，其中，所述非常规碱基是脱氧次黄苷。32.权利要求24至27中任一项所述的试剂盒的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。33.权利要求28至31中任一项所述的引物的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。34.具有链置换能力的DNA聚合酶的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。35.识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基的酶的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。36.具有链置换能力的DNA聚合酶以及识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基的酶的用途，用于在基本上无热循环下的DNA扩增。全文摘要本发明涉及用于等温DNA扩增的方法，该方法包括向待扩增的DNA提供扩增混合物，该扩增混合物包含与DNA的区域至少部分互补并含有非常规碱基的第一引物、与DNA的区域至少部分互补并含有非常规碱基的第二引物、DNA聚合酶、能够进行链置换的酶、识别双链DNA内的非常规碱基并在一条DNA链内在非常规碱基处或其附近产生切口或切除碱基的酶；以及在基本上无热循环下扩增DNA。文档编号C12Q1/68GK101203618SQ200680018325公开日2008年6月18日申请日期2006年5月25日优先权日2005年5月26日发明者杰夫雷·W.·格里格,约翰·R.·梅尔基,道格拉斯·斯彭切尔·米勒申请人:人类遗传标记控股有限公司