专利名称：一种提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法
一种提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法技术领域一种提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，本发明改进了产聚乙烯醇降解酶的 微生物的培养条件，涉及聚乙烯醇生物降解技术领域。
技术背景聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,简称PVA)是一种人工合成的水溶性髙分子 化合物，在纺织工业中，PVA可用于织物上浆，经纱用PVA上桨后粘合力大， 成膜力高，膜柔软强韧，不发生化学变化及腐败。在纺织前处理过程中，经PVA 上浆的棉织物必须经过退浆处理，以增强其吸水性。传统的退浆方法是使用 7(K9(TC的热水在棉织物表面进行洗脱，有时使用氧化剂如NaBr02等。这样不 仅水耗、能耗大，而且在此过程中，必须严格控制操作条件，否则会因高温和 氧化作用对棉纤维造成损伤；更为严重的是其对环境所产生的负面影响纺织 厂排出的废水中含有大量的PVA和氧化剂，由于PVA的可生化性较差 (BOD/COD=0.07)，进入水体后大大增加了纺织废水处理的难度。随着人们对纺织工业清洁生产的关注，研究者们考虑能否在退浆工艺中就 实现对PVA的生物降解，即将PVA降解酶厂运用于纺织工业的退浆工艺。如果 能在退桨工段就实现对PVA的生物降解，不仅能大大减少PVA废水的排放，还 能避免化学退浆过程中高温和氧化造成的棉纤维损伤。实现对PVA生化降解的关键在于筛选到能够高效降解PVA的微生物，但与 能够降解其它脂肪族高聚物的微生物相比，PVA降解菌在种类和分布上要少得 多，并且培养周期长，酶活不高，再加上提取不容易，这些都阻碍了PVA降解 酶在实际生产上的运用。 发明内容本发明的目的是提出一种提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，改进了产聚乙 烯醇降解酶的微生物的培养条件，用低聚合度的聚乙烯醇为碳源进行微生物培 养，代替传统的用高聚合度的聚乙烯醇为碳源进行微生物培养，经改进后，酶 活有显著提高。本发明的技术方案 一种提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，以受聚乙烯醇 污染的纺织厂退浆管道的污泥中采集的原始聚乙烯醇降解菌群液的混合菌系，用聚合度500的聚乙烯醇(PVA205)为碳源和诱导物诱导微生物产酶，所产的 聚乙烯醇降解酶用来降解聚合度1700的聚乙烯醇；发酵培养基PVA205 4-6 g/L，酵母粉2-4 g/L， NaN03 2-3 g/L， K2HP04 1.6g/L， KH2P04 0.2 g/L， MgS04'7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeS04-7H20 0.02 g/L， NaC10.02g/L， pH7.2;发酵条件旋转式摇床摇瓶培养，转速200r/min，培养温度3(TC,取保藏 菌种的甘油管接入装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，发酵4天；或取 1 mL上一批发酵结束的发酵液接入装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中， 发酵4天。本发明内容中所用的测定方法1、 PVA含量测定Finley法。原理在硼酸存在时，PVA与碘作用会产生绿色络合物，颜色的深浅可用分 光光度计测A69。^消光值表示。具体实验操作为，在50mL的容量瓶中，依次加 入lmL待测PVA溶液，15mL25g/L的硼酸溶液和1.5 mL 0.1 mol/L的l2-KI溶液， 加水至刻度，摇匀，10min后，用lcm比色杯，以空白为参比，在6卯nm处测定 吸光值，以吸光度值大小来表示PVA含量的多少。2、 PVA降解酶总酶活测定将发酵结束的发酵液15 000 r/min离心10 min，该部分上清液称为粗酶液。 由于PVA的降解过程是整个酶系共同作用的结果，因此研究中测定的酶活为 PVA降解酶系的总酶活。在150mL三角瓶中加入4mL粗酶液禾tl4mL底物(lg/L PVA 1799溶于0.1 mol/LpH7.0磷酸钾缓冲液中)，将此混合体系于30 'C的水浴摇 床中反应3h，分别测反应前后反应混和液所对应的PVA含量的吸光度。每分钟 吸光度下降0.001定义为一个酶活单位。3、 细胞破碎液酶活测定将发酵液15 000 r/min离心10 min，.离心后的沉淀物溶于磷酸盐缓冲液(pH 7.0， 0.1mol/L)，体积比约为1:4，用超声破碎(4。C， 400 W，工作l s，停2s，工 作时间为15min)并离心收集上清液备用，该部分上清液称为破碎上清液；破碎 后离心所得沉淀物溶于磷酸盐缓冲液至原体积，称为沉淀复溶液。然后按上述 方法测定各自部分的酶活。试剂实验用PVA: PVA1799 (聚合度1700，醇解度99.0%); PVA205 (聚合度500， 醇解度88%); PVA1750 (聚合度1750±50，醇解度99.0%);其它试剂药品均为分 析纯。本发明的有益效果对于产聚乙烯醇降解酶的微生物培养，普遍的方法是 用聚合度1700左右的聚乙烯醇为碳源和诱导物，诱导微生物产酶，但高聚合度 的聚乙烯醇极易絮凝，影响微生物对聚乙烯醇的降解，进而降低酶产量。本发 明改进了培养条件，用聚合度500的聚乙烯醇为碳源培养，适当提高聚乙烯醇 的浓度也不会出现絮凝，且所产的酶对高聚合度聚乙烯醇的降解能力比前者有很大提高，为聚乙烯醇降解酶早日实现工业化应用奠定了基础。
图l酶活分布图2PVA 1750不同浓度对降解率和OD6G()值的影响图3用不同PVA型号培养时酶活的比较图4PVA205不同浓度对酶活的影响图5以PVA205为碳源，不同氮源对酶活的影响图6酵母粉浓度对酶活的影响图7添加不同浓度NaNC^或NH4C1对酶活的影响具体实施方式
菌种以受聚乙烯醇污染的纺织厂退浆管道的污泥中采集的原始聚乙烯醇降解菌群液的混合菌系(ZL200510038224.2)，本实施方式中的混合菌系选自无 锡市宜兴军达纺织厂退浆管道的污泥中筛选出的混合菌系。菌株产酶的酶活比较与发酵条件优化，如下述。对照实施例l.用PVA 1750培养时产酶的酶活发酵培养基PVA1750 1 g/L，酵母粉1 g/L，K2HP04 1.6 g/L，KH2P04 0.2 g/L， MgS04.7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeS04.7H20 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L;pH 7.2。分别测定发酵上清液、破碎上清液和沉淀复溶液的酶活，结果如图l所示。 可以看出菌系所产的PVA降解酶胞内外都有分布，但在这三部分中胞外PVA降 解酶所占的比重较大(53%)，发酵48小时PVA降解酶活最大，为0.133 U/mL， 此后胞内、外PVA降解酶酶活都在降低，72小时时，胞内酶活已降为O，但胞 外酶活为0.09U/mL。如果提高培养基中PVA 1750的浓度，菌体生长量和PVA降解率却随之下降， 如图2所示。由于高醇解度PVA含有大量亲水性羟基，在强烈摇动条件下容易发 生分子内或分子间氢键缔合，造成分子聚合成凝胶团。培养液中PVA浓度增加会 导致溶液粘度的增加，从而造成培养基的溶氧量小于细胞生长代谢的需要量， 阻碍了菌体的生长和产酶。此时测发酵上清液酶活，酶活并没有太大变化，而 且测定酶活过程中底物中的PVA1799会发生絮凝，影响酶活结果。实施例l.用PVA205培养时产酶的酶活发酵培养基PVA205 1 g/L，酵母粉1 g/L， K2HP04 1.6 g/L， KH2P04 0.2 g/L， MgS04.7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L，FeS04.7H20 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L;pH 7.2。或发酵培养基PVA250 4g/L，蛋白胨2g/L， K2HP04 1.6 g/L, KH2P04 0.2 g/L， MgSO4.7H2O0.5g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeS04.7H20 0.02 g/L， NaC10.02g/L; pH7.2。只测发酵上清液的酶活(胞外酶)，结果如图3所示。用lg/LPVA1750和lg/LPVA205培养，酶活相差不大，但用4g/LPVA205培养时不仅发酵液没有絮凝， 酶活也大大提高，酶活为0.69U/mL是用l g/LPVA1750培养时(酶活位O. 133 U/mL)的5.18倍。实施例2.培养基优化用PVA205为碳源进行微生物培养，优化培养基碳、氮源的浓度，以期望提 高酶活，如下所述。(1) 氮源优化以4g/LPVA205为碳源，考察含氮量相同的有机氮和无机氮(以3 g/L的酵 母粉为基准)的酶活。结果如图5所示。由图5可知，以酵母粉为氮源时酶活 最高。考察不同酵母粉浓度对酶活的影响，结果如图6所示，酵母粉浓度为3g/L 时酶活最高。(2) 最适碳源浓度的确定考察不同PVA205浓度的酶活，结果如图4所示，可知PVA205浓度为4-6 g/L，酶活均较高，以4g/L时酶活最高。(3) 复合氮源的酶活考察复合氮源的酶活，由图5可知，无机氮源中NaN03和NH4C1对酶活贡 献最大，当PVA205浓度为4 g/L，酵母粉浓度为3g/L时，添加不同浓度的NaN03 或NH4C1,考察酶活，结果如图7。由图7可知添加2-3 g/L的NaN03能大大提高酶活；添加2 g/L时，酶活为 1.06U/mL，比无添加时的酶活提高了52%。比用1 g/L PVA1750培养时提高了 8.15倍。优化后最适的发酵培养基组成为PVA205 4-6g/L，酵母粉2-4g/L， NaN03 2-3g/L， K2HP04 1.6 g/L， KH2P04 0.2 g/L， MgS04.7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeSO4.7H2O0.02g/L， NaC10.02g/L; pH7.2。发酵条件旋转式摇床摇瓶培养，转速200r/min,培养温度30°C 。取保藏菌 种的甘油管接入装有30ml发酵培养基的250ml三角瓶中，发酵4天；或取1 mL 上一批发酵结束的发酵液接入装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，发酵 4天。
权利要求
1、一种提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，其特征是以受聚乙烯醇污染的纺织厂退浆管道的污泥中采集的原始聚乙烯醇降解菌群液的混合菌系，用聚合度500的聚乙烯醇为碳源和诱导物诱导微生物产酶，所产的聚乙烯醇降解酶用来降解聚合度1700的聚乙烯醇；发酵培养基PVA 205 4-6g/L，酵母粉2-4g/L，NaNO3 2-3g/L，K2HPO4 1.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，NaCl 0.02g/L，pH7.2；发酵条件旋转式摇床摇瓶培养，转速200r/min，培养温度30℃，取保藏菌种的甘油管接入装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，发酵4天；或取1mL上一批发酵结束的发酵液接入装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，发酵4天。
全文摘要
一种提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，属于聚乙烯醇生物降解技术领域。本发明改进了产聚乙烯醇降解酶的微生物的培养条件，传统的培养方法是用聚合度1700左右的聚乙烯醇为碳源和诱导物，诱导微生物产酶，但高聚合度的聚乙烯醇极易絮凝，影响微生物对聚乙烯醇的降解，进而影响产酶。本发明改进了培养条件，用聚合度500的聚乙烯醇为碳源培养，适当提高聚乙烯醇的浓度不会出现絮凝，并对培养基进行优化，所产的酶对高聚合度聚乙烯醇的降解能力比前者有很大提高，约提高8.15倍。
文档编号C12N9/00GK101220352SQ20081001872
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者堵国成, 牛海燕, 坚 陈 申请人:江南大学