专利名称：：一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素h产量的方法
技术领域：
：本发明属抗生素生产领域，特别是涉及一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法。技术背景至今共有8种冬青生菌素(代号分别为AH)被人们所发现，它们的来源、分子式和分子结构以及性质见下表1。1971年，日本学者Hayakawa首次在山毛榉树枯萎叶片中分离出来的柱枝双孢菌属冬青生菌(Q///"^oc/ai//ww///c/co/a)MFC-870中发现冬青生菌素H。冬青生菌素H(ilicicolinH)的分子式为C27H31N04，为浅黄色片状晶体，dragendorff试剂测试阴性，具有抗真菌活性，它的作用机制在最近才被阐明在酵母中可作用于线粒体，抑制电子在呼吸链泛醌位点中的传递。研究冬青生菌素H毒性时，发现在50^g，mL—1浓度下，它对大鼠肝细胞线粒体没有显著活性(不出现肿胀、变形)，对大鼠肝细胞的IQo约为lrr^mL—1。据此推测它可能是一种对人类低毒，对部分真菌高毒的化合物，具有潜在的开发应用前景。_表l冬青生菌素家族(Ilicicolins)_<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>目前以镰刀菌生产冬青生菌素H存在产量低的问题，通过利用优化后的镰刀菌发酵培养基，产量仅比未优化前提高23倍；而利用优化后的镰刀菌发酵培养条件(例如摇床转速、培养温度、初始pH等)时，产量也提高不多。因此针对产量低的问题，应考虑次级代谢产物生物合成中产物的合成前体是调控代谢向次级代谢产物积累的方向进行、并且增加其产量的一个重要因素。由于镰刀菌代谢冬青生菌素H的代谢途径尚未有文献报道，不能全面了解冬青生菌素H在镰刀菌中的生物合成途径，故而不清楚对冬青生菌素起积极作用的因素，例如有关酶ParkSRIInternational生物组织化学实验室的Tanabe和Urano通过利用放射性元素13C标记醋酸盐、14C和15N标记苯丙氨酸研究冬青生菌素H的生物合成途径，发现冬青生菌素H是经过一系列碳架重排合成，证实其前体是醋酸盐和苯丙氨酸。随后，1998年英国的学者Moore等在利用球孢白僵菌研究布氏白僵菌素生物合成途径时发现酪氨酸同样是冬青生菌素H的前体。因此，向发酵培养基中添加苯丙氨酸、酪氨酸以及乙酸盐，都可能会促进冬青生菌素H在另一真菌——镰刀菌内的生物合成。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，该方法操作简单、转化率高、产量稳定、环保，可为工业化大规模生产冬青生菌素H提供新的思路和途径。本发明的一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，包括如下步骤(1)镰刀菌F^an'wmo;c^pon/mATCC11711菌株(购自美国菌种保藏中心)的种子培养将12片1cm直径的镰刀菌琼脂培养物置于成分包括210g七.1葡萄糖，0.22.5g-L—'蛋白胨，0.21.5g七"酵母浸膏，0.53g七"NaCl的种子培养基中，在2035。C，100—250r/min条件下培养2030h;(2)镰刀菌Fwrahwm0;9;577wwwATCC11711菌株的发酵培养以4—10%接种量将镰刀菌种子液转接至成分包括515g丄"葡萄糖/蔗糖，0.53g丄"蛋白胨，0.21.5g-I/1酵母浸膏，13g'L"NaCl的发酵培养基，并于048h内将2.520mg丄"酪氨酸添加入培养基，100130。C时灭菌1040min后，在2035。C，100—250r/min条件下培养35d;(3)发酵培养结束后通过过滤或离心得到菌丝体，以24倍于菌丝体体积的丙酮浸泡菌丝体浸泡抽提过夜，或经超声波处理1035min后再高速离心收集抽提液；为了获得菌丝体干重，可将菌丝体置于烘箱中烘至恒重后称重；(4)利用高效液相色谱和薄层层析分析得到抽提液中冬青生菌素H的浓度。步骤(1)所述的种子培养基成分包括5g七"葡萄糖，lg七"蛋白胨，0.5g丄"酵母浸膏，lg.L"NaCl。步骤(1)所述的发酵培养基成分包括10g七"葡萄糖/蔗糖，2g丄"蛋白胨，lg七"酵母浸膏，2g七"NaCl。步骤(2)优选酪氨酸前体的添加量为12.5mg七—1。步骤(2)优选酪氨酸前体的添加时间为发酵Oh，即配制发酵培养基时直接加入。步骤(3)利用G3坩埚进行过滤操作，在9000—18000r/min条件下离心1030min。步骤(4)所述的薄层层析是在HSGF254型的预制硅胶板上点样，展开剂为乙酸乙脂和石油醚的混合物，v/v=2:3，用254nm波长的紫外灯观察。步骤(4)所述的高效液相色谱分析在规格为150mmX4.60mm，5pm的配备色谱柱PhenomenexLunaC18或C8柱的液相色谱仪上进行，流动相为乙腈-水缓冲液，v/v=30:70，检测波长为254nm,流速为1.0mL/min。所述的培养镰刀菌生产冬青生菌素H的过程是间歇式或分批补料式。有益效果(1)本方法操作简单、稳定、可控性强，利用镰刀菌发酵生产抗生素一冬青生菌素H，安全环保；(2)利用前体物质酪氨酸可以有效提高镰刀菌合成冬青生菌素H的产量，为工业化生产提供新的思路和途径。图1为酪氨酸浓度对冬青生菌素H产量的影响；.图2为酪氨酸适宜添加时间的选择；图3为添加酪氨酸后镰刀菌合成冬青生菌素H与对照组的历程比较。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.镰刀菌Fw^n'w附o;c少5poramATCC11711菌株的种子培养镰刀菌ATCC11711菌株种子培养基5g七"葡萄糖，lg七"蛋白胨，0.5g七"酵母浸膏，1g'U1NaCl,pH自然；以镰刀菌ATCC11711菌株为生产菌种，在28。C，120r/min条件下培养24h。2.镰刀菌ATCC11711菌株的发酵培养镰刀菌ATCC11711菌株发酵培养基10g'L—'葡萄糖，2g'L"蛋白胨，1g丄"酵母浸膏，2g'L/1NaCl，一定浓度的酪氨酸，pH自然；以5%接种量，在28。C，120r/min条件下培养4d。发酵结束后利用G3坩埚过滤或离心(9000—18000r/min)得到菌丝体，并置于烘箱中烘至恒重测得菌丝体干重；利用2倍于菌丝体体积的丙酮浸泡抽提菌丝体过夜或以超声波处理15min后再高速离心收集抽提液；利用高效液相色谱分析得到的抽提液中冬青生菌素H的浓度。实验中以未加酪氨酸的发酵培养为对照。3.酪氨酸的添加方式在配制镰刀菌的发酵培养基时直接添加酪氨酸至10.0mg七—1,然后在11(TC条件下灭菌30min。4.采用薄层层析和高效液相色谱分析方法来定性和定量分析冬青生菌素H的浓度。薄层层析条件在HSGF254型的预制硅胶板上点样，选用乙酸乙脂和石油醚的混合物(2:3，v/v)为展开剂，展开后取出、晾干，利用254nm波长的紫外灯进行观察。高效液相色谱条件在配备色谱柱PhenomenexLunaC18(150mmX4.60mm，5pm)或C8柱的液相色谱仪上进行分析，分析条件流动相为乙腈-水缓冲液(30:70，v/v)，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min。5.实验结果冬青生菌素H与发酵液体积比值为15.8mg七人与菌丝体干重比为4.8mgf1，冬青生菌素H的平均产率为5.3mg七+cT1，与对照组相比依次提高了50.6%、87.6%和50.6%。实施例21.镰刀菌ATCC11711菌株的种子培养同实施例l。2.镰刀菌ATCC11711菌株的发酵培养同实施例l。3.酪氨酸的添加方式在配制镰刀菌的发酵培养基时直接添加酪氨酸至12.5mg七—1，然后在110'C条件下灭菌30min。4.采用薄层层析和高效液相色谱分析方法来定性和定量分析冬青生菌素H的浓度。同实施例1。5.实验结果冬青生菌素H与发酵液体积比值为20.0mg丄"，与菌丝体干重比为5.9mg'g"，冬青生菌素H的平均产率为6.7mg丄+cT1，与对照组相比依次提高了卯.6°/。、128.1%和90.6%。实施例31.镰刀菌ATCC11711菌株的种子培养同实施例l。2.镰刀菌ATCC11711菌株的发酵培养除了配制培养基时不加酪氨酸以及发酵培养基在12rC条件下灭菌20min之外，其它同实施例1。3.酪氨酸的添加方式当培养时间为12h时，往镰刀菌发酵培养基中添加无菌酪氨酸至12.5mg七"。4.采用薄层层析和高效液相色谱分析方法来定性和定量分析冬青生菌素H的浓度。同实施例1。5.实验结果冬青生菌素H与发酵液体积比值为17.98mg七—1，与菌丝体干重比为5.5mgf1，冬青生菌素H的平均产率为5.99mg'L+d—1，分别比对照组提高了71.2%、114.1%和71.2%。实施例41.镰刀菌ATCC11711菌株的种子培养同实施例l。2.镰刀菌ATCC11711菌株的发酵培养除了配制培养基时不加酪氨酸以及发酵培养基在12rC条件下灭菌20min之外，其它同实施例1。3.酪氨酸的添加方式当培养时间为24h时，在镰刀菌发酵培养基中添加无菌酪氨酸至12.5mg丄"。4.采用薄层层析和高效液相色谱分析方法来定性和定量分析冬青生菌素H的浓度。同实施例1。5.实验结果冬青生菌素H与发酵液体积比值为15.86mg丄-1，与菌丝体干重比为4.99mg.g—1，冬青生菌素H的平均产率为5.29mg七+cT1，分别比对照组提高了51.1%、94.3%和51.1%。实施例51.镰刀菌ATCC11711菌株的种子培养同实施例1。2.镰刀菌ATCC11711菌株的发酵培养除了配制培养基时不加酪氨酸以及发酵培养基在12rC条件下灭菌20min之外，其它同实施例1。3.酪氨酸的添加方式，在镰刀菌发酵培养基中添加无菌酪氨酸至12.5mg七'1。4.采用薄层层析和高效液相色谱分析方法来定性和定量分析冬青生菌素H的浓度。同实施例l。5.实验结果冬青生菌素H与发酵液体积比值为14.76mg七"，与菌丝体干重比为5.17mgf1，冬青生菌素H的平均产率为4.92mg丄十d—1，分别比对照组提高了40.6%、101.3%和40.6%。实施例61.镰刀菌ATCC11711菌株的种子培养同实施例1。2.镰刀菌ATCC11711菌株的发酵培养除了配制培养基时不加酪氨酸以及发酵培养基在12rC条件下灭菌20min之外，其它同实施例1。3.酪氨酸的添加方式当培养时间为12h时，在镰刀菌发酵培养基中添加酪氨酸至5mg七—1，24h时在镰刀菌发酵培养基中再添加酪氨酸至5mg.L-'。4.采用薄层层析和高效液相色谱分析方法来定性和定量分析冬青生菌素H的浓度。同实施例1。5.实验结果冬青生菌素H与发酵液体积比值为15.81mg丄"，与菌丝体干重比为4.82mgf1，冬青生菌素H的平均产率为5.27mg丄"'d—1，分别比对照组提高了50.6%、87.7%和50.6%。实施例71.镰刀菌ATCC11711菌株的种子培养同实施例1。2.镰刀菌ATCC11711菌株的发酵培养镰刀菌ATCC11711菌株发酵培养基15g丄"葡萄糖，2g丄"蛋白月东，lg丄"酵母浸膏，2g'L"NaCl，一定浓度的酪氨酸，pH自然；以5%接种量，在28。C,120r/min条件下培养4d。配制培养基时不加酪氨酸，而发酵培养基在12rC条件下灭菌20min。其它同实施例1。3.酪氨酸的添加方式当培养时间为36h时，在镰刀菌发酵培养基中添加无菌酪氨酸至10mg七—1。4.采用薄层层析和高效液相色谱分析方法来定性和定量分析冬青生菌素H的浓度。同实施例l。5.实验结果冬青生菌素H与发酵液体积比值为16.45mg七—"，与菌丝体干重比为4.87mgf1，冬青生菌素H的平均产率为5.48mg丄+d",分别比对照组提高了56.7%、89.6%和56.7%。权利要求1.一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，包括(1)镰刀菌FusariumoxysporumATCC11711菌株的种子培养将镰刀菌1～2片1cm直径的琼脂培养物置于成分包括2～10g·L-1葡萄糖，0.2～2.5g·L-1蛋白胨，0.2～1.5g·L-1酵母浸膏，0.5～3g·L-1NaCl的液体种子培养基中，在20～35℃，100-250r/min条件下培养18～30h；(2)镰刀菌FusariumoxysporumATCC11711菌株的发酵培养以4-10％接种量将镰刀菌种子液转接至成分包括5～15g·L-1葡萄糖/蔗糖，0.5～3g·L-1蛋白胨，0.2～1.5g·L-1酵母浸膏，1～3g·L-1NaCl的发酵培养基，并于0～48h内将2.5～20mg·L-1酪氨酸添加入培养基，100～130℃时灭菌10～40min后，在20～35℃，100-250r/min条件下培养3～5d；(3)发酵培养结束后通过过滤或离心得到菌丝体，以2～4倍于菌丝体体积的丙酮浸泡菌丝体浸泡抽提过夜，或经超声波处理10～35min后再高速离心收集抽提液；如需得到菌丝干重，则将菌丝体置于烘箱中烘至恒重后称重；(4)利用高效液相色谱和薄层层析分析得到抽提液中冬青生菌素H的浓度。2.根据权利要求1所述的利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，其特征在于步骤(1)所述的种子培养基成分为5g七"葡萄糖、lg七"蛋白胨、0.5g七—〗酵母浸膏或1g七—1NaCl。3.根据权利要求1所述的利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，其特征在于步骤(2)所述的发酵培养基成分为10g丄"葡萄糖/蔗、2g七—'蛋白胨、lg-L—1酵母浸膏或2g七—1NaCl。4.根据权利要求1所述的利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，其特征在于步骤(2)所述的酪氨酸前体的添加在配制发酵培养基时加入，添加量为12.5mg丄-1。5.根据权利要求1所述的利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，其特征在于步骤G)所述的过滤是利用G3坩埚进行的。6.根据权利要求1所述的利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，其特征在于步骤(4)所述的薄层层析是在HSGF254型的预制硅胶板上点样，展开剂为乙酸乙脂和石油醚的混合物，v/v=2:3，用254nm波长的紫外灯观察。7.根据权利要求1所述的利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，其特征在于步骤(4)所述的高效液相色谱分析在规格为150mmX4.60mm，5pm的配备色谱柱PhenomenexLunaC18或C8柱的液相色谱仪上进行，流动相为乙腈-水缓冲液，v/v=30:70，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min。8.根据权利要求15任一项所述的利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，其特征在于所述的培养镰刀菌生产冬青生菌素H的过程是间歇式或分批补料式。全文摘要本发明涉及一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，包括如下步骤(1)将镰刀菌FusariumoxysporumATCC11711菌株置于种子培养基中，在20～35℃，100-250r/min条件下培养18～30h；(2)将镰刀菌ATCC11711种子液以4-10％接种量转接至发酵培养基，并于0～48h内加入2.5～20mg·L<sup>-1</sup>酪氨酸，除菌后，在20～35℃，100-250r/min条件下培养3～5d；(3)过滤或离心得到的菌丝体置于烘箱中烘至恒重，再经丙酮浸泡抽提或超声波处理离心收集抽提液；(4)利用高效液相色谱和薄层层析分析得到抽提液中冬青生菌素H的浓度。该方法操作简单、产量稳定、可为工业化生产冬青生菌素H提供新的思路和途径。文档编号C12R1/77GK101260418SQ20081003650公开日2008年9月10日申请日期2008年4月23日优先权日2008年4月23日发明者枫洪,晨邓申请人:东华大学