专利名称：：肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因检测方法，尤其是涉及一种肺炎克雷伯菌对0-内酰胺酶耐药基因检测方法。
背景技术：
：抗菌药物发展的历史，是一部人类与细菌做斗争的历史。人类不断研制开发新药，细菌则通过改变自已的结构来与抗菌药物相对抗。抗菌药物的滥用致使耐药菌比例越来越大，耐药程度越来越高，新药研制的速度已远远不及细菌耐药性产生的速度。抗菌药物滥用是世界范围内存在的问题，我国尤为严重。据统计，我国住院病人中使用抗菌药物的比例占住院病人的60%-70%，在美国仅为20%。抗菌药物的滥用直接导致了耐药菌逐年增多，院内感染发生率不断上升。如果不加强规范、合理用药，一旦出现耐药菌感染性疾病爆发流行，将会出现无药可治的尷炝局面。因此，研究细菌耐药机制及其规律就显得十分紧迫和必要。肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界、健康人的皮肤、肠道和呼吸道。正常情况下，肺炎克雷伯菌并不感染人体的任何组织。老年病人免疫力低下，长期大量使用抗菌药物或创伤性医疗操作(如气管切开、尿道插管和肾透析等)等情况下易引起内源性感染。肺炎克雷伯菌所致感染中以呼吸道感染、泌尿道感染、菌血症等最为常见。肺炎克雷伯菌在临床标本的分离率为8.0%，其耐药率为6.1%-85.7%。近年来，从临床分离到的肺炎克雷伯菌可耐受多类抗菌药物包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、氟喹诺衝类、氯霉素、磺胺类药物等，出现了多重耐药菌株。为此，针对肺炎克雷伯菌分子耐药机制与感染关系进行深入研究，对了解本地区肺炎克雷伯菌的耐药基因流行状况、指导临床合理使用抗菌药物、研发新药的导向等具有重要意义。
发明内容为解决上述技术问题，本发明提供了一种肺炎克雷伯菌对0-内酰胺酶耐药基因检测方法，旨在应用现代分子生物学技术和现代信息技术进行细菌耐药机制和耐药的相关基因研究，揭示肺炎克雷伯菌对0内酰胺类抗菌药物产生耐药原因，达到快速诊断细菌的耐药性的目的，明确本地区肺炎克雷伯菌耐药基因流行状况，为指导临床研究合理使用抗菌药物提供依据。本发明为实现上述目的采取的技术方案如下，一种肺炎克雷伯菌对0-内酰胺酶耐药基因检测方法，包括以下步骤-1、选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定菌种后采样备用。2、采用微^#释^*测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断。3、采用PCR法检测耐药基因，检查P-内酰胺酶耐药基因并选取DM阳性株测序分析。①、模板制备挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶说明书第3/9页液200u1),56't水浴2小时，改95flC水浴10分钟，加入Chelex-100幼iil，离心G5000rpm)30秒。上清液即为基因检测的模板液，-208C冰箱保存备用。②、基因的检测采用聚合酶链反应(PCR)法，各种靶基因PCK扩增体系均为每反应体系P,、P2引物各0，5iiM，dNTPs200各mM，KC1lOmM，(MU2S048mM，MgCl22mM，Tris—HC1(pH9.0)l薩，NP0.5%，BSA0.02%(wt/vo1)，TaqD则pol1U。总反应体积20li1(其中模板液5ul)。PCR扩增产物〉500bp热循环参数均为93。C预变性2niin，然后93。C60s—55。C60s—72°C60s，循环35周期，最后一个72""C延长至5min。PCR扩增产物<500bp热循环参数均为93。C预变性2迈in，然后93'C30s—55。C30s—72"60s，循环35周期，最后一个72'C延长至5min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。优选地，选择以下P-内酰胺酶耐药基因TM、SHV、LM、OKP、CTX普1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、0XA-1群、0XA-2群、0XA-10群、PER、GES、VEB、DHA、ACT-1进行耐药性分析，相应的引物序列为Pl:AGGMGAGTATGATTCMCAP2:CTCGTCGTTTGGTATGGCPl:TGCGCMGCTGCTGACCAGCP2:TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAPl:ATGCGTT(A/T)T(A/G)TTCGCCTGTGP2:GGCGCTCAGATGCTGCGCPl:A(A/G)GCGCTTCCCGGCGACGTGP2:TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAPl:ATGGTTAAMMTCACTGCGCP2:TCCCGACGGCTTTCCGCCTTPl:ATGATGACTCAGAGCATTCGP2:TCCCGACGGCTTTCCGCCTT<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本发明的有益效果如下本发明选用目前较常见的医院感染^~~肺炎克雷伯菌为研究对象，运用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术和基因序列比对等现代分子生物学和信息技术，系统全面的对肺炎克雷伯菌的耐药机制进行了研究，发现导致肺炎克雷伯菌耐P内酰胺类药物的耐药基因，对指导临床合理使用抗菌药物具有重要价值，可减少医院院内感染率，降低死亡率，节约社会医疗资源。成果具有良好的社会和经济效益，推广应用前景广泛。以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。图1为本发明WaTEM基因PCR电泳图；[M:分子量标记，由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp，P:阳性对照,N:阴性对照，S:标本阳性]图2为本发明W^CTX-M-l群基因PCR电泳图；[M:分子量标记，由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp，P:阳性对照，N:阴性对照，S.'标本阳性]图3为本发明力7aDHA基因PCR电泳图；[M:分子量标记，由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp，P:阳性对照，N:阴性对照,S:标本阳性]图4为本发明WaCTX-M-15型基因测序图；图5为本发明WaSHV型基因测序图。具体实施方式1材料与方法1.1菌株来源及鉴定80株均为分离自2006年1月2007年10月间患者临床标本，分别为痰液53份，尿液8份，胆汁4份，脓液5份，弓疏液4份，血液3份，咽拭子3份。全部菌株均使用ATB细菌鉴定{^鉴定菌种后采样备用o1.2抗菌药物敏感性试验药敏试验按美国CLSI2006年版要求。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603铜绿假单胞菌ATCC27853、购自卫生部临床检验中心。1.3药敏试验抗菌药物敏感试验微量肉汤稀释法。1.4P内酰胺酶基因检測1.4.1模板制备挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200iil)，56t水浴2小时，改95t水浴10分钟，加入Cheiex-lOO40ul，离心(15000rpm)30秒。上清液即为基因检测的模板液，-20°C冰箱保存备用。1.4.2基因的检測采用聚合酶链反应(PCR)法，其中引物序列见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为每反应体系P，、P2引物各0.5iiM，dNTPs200各mM，KC110mM，(鹏)25048爐，MgCL2mM，Tris—HC1(pH9.0)10mM，NFVO.5%，BSA0.02%(wt/vol)，TaqDMpol1U。总反应体积20u1(其中模板液5ii1)。PCR扩增产物〉500bp热循环参数均为93。C预变性2min，然后93'C60s—55'C60s—72。C60s，循环35周期，最后一个721C延长至5min。PCR扩增产物〈500bp热循环参数均为93""C预变性2min，然后93'C30s—55lC30s—72"C60s，循环35周期，最后一个72*€延长至5min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。表l:PCR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2结果2.1抗菌药物的敏感性80株分离自老年病人产e-内酰胺酶的KPN菌抗菌药物的敏感性见表2。表2抗菌药物的敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2P内酰胺酶基因检測结果80株分离自老年病人产P-内酰胺酶的KPN菌检出力7aTEM、WaSHV、WaCTX-M-1群、WaCTX-M-9群、WaOXA-1群、WaDHA等6种P-内酰胺酶基因，阳性率分别为95%(76/80)、3096(24/80)、51.3%(41/80)、5%(4/80)、5%(4/80)、13.8%(ll/80)。80株菌中有76株至少检出1种P-内酰胺酶基因，58株同时检出2种以上3-内酰胺酶基因，最多同时检出4种0-内酰胺酶基因，只有4株没有检出e-内酰胺酶基因。WaTEM基因PCR电泳图见图1，WaCTX-M-1群基因PCR电泳图见图2，W必HA基因PCR电泳图见图3，2号株ZJaCTX-M-l群PCR阳性产物经DM测序和上网(www.ncbi.nlnLnih.gov/BUSTn)比对为WaCTX-M-15型(与己登录的型序列完全一致)，图4为CTX-M-15型测序图；2号株W必HVPCR阳性产物经DM测序和上网比对与WaSHV-28型、力7aSHV-43型同一群，图5为WaSHV测序图，2号株WaSHV序列与已在美国NCBI登录的WaSHV序列分子进化图。结论80株KPN菌P内酰胺类抗菌药物耐药与产e-内酰胺酶密切相关。80株肺炎克雷伯菌中，有76株至少检测1种P内酰胺酶基因，58株同时检测2种以上P内酰胺酶基因，最多同时检测4种&内酰胺酶基因。检测到TEM基因的阳性率为959&,SHV基因为3(W6，CTX"M-1群基因为51.3%和OXA-l群基因为5%等，TEM基因是肺炎克雷伯菌最常见的P-内酰胺酶基因，介导对氨苄西林、青霉素、头孢他定和头孢噻吩等的耐药性，此耐药性通过细菌质粒进行传递。CTX-MP-内酰胺酶能高度水解头孢吡肟、头霉素等抗菌药物，检测到CTX-M型基因代表对头孢吡诉、头霉素类药物耐药。肺炎克雷伯菌SHV基因可介导氨苄西林耐药，本研究结果耐药表型与0内酰胺酶基因检测状况相符。OXA型e内酰胺酶可水解苯唑西林，检测到此类酶基因显示细菌对苯唑西林、氨苄西林耐药。权利要求1、一种肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法，包括以下步骤(1)、选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定菌种后采样备用，(2)、采用微量稀释法测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断，(3)、采用PCR法检测β-内酰胺酶耐药基因，并选取DNA阳性株进行测序分析，所述β-内酰胺酶耐药基因及相应引物序列为基因名称引物序列blaTEMP1AGGAAGAGTATGATTCAACAP2CTCGTCGTTTGGTATGGCblaSHVP1TGCGCAAGCTGCTGACCAGCP2TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAblaLENP1ATGCGTT(A/T)T(A/G)TTCGCCTGTGP2GGCGCTCAGATGCTGCGCblaOKPP1A(A/G)GCGCTTCCCGGCGACGTGP2TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAblaCTX-M-1群P1ATGGTTAAAAAATCACTGCGCP2TCCCGACGGCTTTCCGCCTTblaCTX-M-2群P1ATGATGACTCAGAGCATTCGP2TCCCGACGGCTTTCCGCCTTblaCTX-M-9群P1CGGCCTGTATTTCGCTGTTGP2TCCCGACGGCTTTCCGCCTTblaOXA-1群P1CTGTTGTTTGGGTTTCGCAAGP2CTTGGCTTTTATGCTTGATGblaOXA-2群P1CAGGCGC(T/C)GTTCG(T/C)GATGAGTTP2GCC(T/C)TCTATCCAGTAATCGCCblaOXA-10群P1GTCTTTC(A/G)AGTACGGCATTAP2GATTTTCTTAGCGGCAACTTAblaPERP1AGTCAGCGGCTTAGATAP2CGTATGAAAAGGACAATCblaGESP1ATGCGCTTCATTCACGCACP2CTATTTGTCCGTGCTCAGGblaVEBP1GCGGTAATTTAACCAGAP2GCCTATGAGCCAGTGTTblaDHAP1AACTTTCACAGGTGTGCTGGGTP2CCGTACGCATACTGGCTTTGCblaACT-1P1TCGGTAAAGCCGATGTTGCGGP2CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT2、如权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌对P-内酰胺酶耐药基因检测方法，其特征在于所述的基因的检测中，各靶基因PCR扩增体系均为每反应体系P，、P2引物各0.5uM,dNTPs200各mM，KC110mM，(MU2S048mM，MgCl22mM，Tris-HCIpH9.010mM，NP4O0.5%，BSA0.02%wt/vol，TaqDMpol1U，总反应体积20ul，PCR扩增产物〉500bp热循环参数均为93'C预变性2min，然后WC60s—55°C60s—72°C60s，循环35周期，最后一个721C延长至5min，PCR扩增产物〈500bp热循环参数均为93'C预变性2min，然后93°C30s—55X:30s—72"C60s,循环35周期，最后一个72。C延长至5min,产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。全文摘要本发明公开了一种肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法，属于基因检测方法
技术领域：
，包括以下步骤1.选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定菌种后采样备用；2.采用微量稀释法测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断；3.采用PCR法检测耐药基因，检查β-内酰胺酶耐药基因并选取DNA阳性株测序分析。本发明通过系统全面的对肺炎克雷伯菌的耐药机制进行了研究，发现导致肺炎克雷伯菌耐β内酰胺类药物的耐药基因，对指导临床合理使用抗菌药物具有重要价值，可减少医院院内感染率，降低死亡率，节约社会医疗资源，具有良好的社会和经济效益。文档编号C12Q1/68GK101519688SQ20081012112公开日2009年9月2日申请日期2008年9月28日优先权日2008年9月28日发明者孙小军,李水法,王华均,金法祥,钟建平,黄明清申请人:钟建平