专利名称：应用基因工程技术延长香蕉保鲜期的方法、组成物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于应用基因工程技术以延长香蕉保鲜期的方法、组成物及其应用，特别是指通过基因转殖方法将干扰性RNA转殖于香蕉内以抑制/降低香蕉ACC氧化酶基因的mRNA表达，进而抑制/降低乙烯的生物合成的方法、组成物及其应用。
背景技术：
“后熟作用”意指更年性果蔬采摘后自行完成熟化的过程。为了运输或贮藏，有些更年性果蔬需要提前采摘。其目的是，通过更年性果蔬自身的后熟作用，可以延长运、贮期。亦可根据需要采取适当措施(如低温、气调、乙烯吸收剂、乙烯抑制剂等)以抑制/延缓更年性果蔬的后熟过程，达到长期贮藏的目的。若需要提早上市，利用乙烯剂等可促进果蔬后熟。有些果实如香蕉(Musa spp.)，必须经后熟阶段才能更好食用。
香蕉(Musa spp.)属于芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)的单子叶植物，果实芬芳可口且营养价值高，为世界重要经济作物之一。香蕉(Musa spp.)属更年性水果，经采收后，绿熟香蕉通过后熟过程，产生更年性变化，包含内生乙烯的生成、淀粉及原果胶的水解等，待果肉软化、甜度增加、香气产生后，食用价值始能提高。
现有技术中将香蕉提前采收，通过香蕉自身的后熟作用，可以延长其运、贮期。然而，香蕉在运输过程中常仍因乙烯生成而造成果实后熟、甚者，过熟、败坏。因此，降低香蕉的市场价值及影响香蕉的普及性。因此，通过对乙烯生物合成的控制，以提供解决香蕉后熟等相关问题的方法。
乙烯(Ethylene)为气体形式存在的荷尔蒙，影响许多植物生理生化反应(Burg and Burg，1962)。乙烯对植物的生长发育及逆境反应十分重要，例如当植物受到淹水、机械性伤害、病菌感染、叶与花的老化及果实后熟，均会产生乙烯。乙烯的生物合成路径为甲硫胺酸(methionine)通过S-腺甘甲硫胺酸合成酶(AdoMet synthetase)转化为S-腺甘甲硫胺酸(S-Adenosyl-methionine，AdoMet)，再由ACC合成酶(ACC synthase，ACS)生成1-胺基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)则氧化ACC生成乙烯(Ethylene)(Yang and Hoffman，1984)。由此可知，ACO为乙烯生物合成路径的最后酶，因此，可通过抑制ACO基因或蛋白质的表达以抑制/降低乙烯的生物合成，进而达到延缓果实后熟的目的。本发明是以香蕉(Musa spp.)的ACC氧化酶基因Mh-ACO1A(MAO1A，GenBank accession no.AF030411，SEQ ID No14)、Mh-ACO1B(MAO1B，GenBank accession no.AF030410，SEQ ID No15)及Mh-ACO2(MAO2，GenBank accession no.U86045，SEQ ID No16)为目标基因，期望通过抑制这些基因的表达，以抑制/降低乙烯的生物合成，达到延缓果实成熟的目的。
过去用以降低目标基因表达的方法，主要是以转殖目标基因的反义链(antisense strand)于植物中，所产生的mRNA与内生性(endogenous)顺义基因的mRNA序列互补(complementary)，形成双链(duplex)的结构，进而降解或干扰蛋白质转译的进行，达到抑制内生性基因表达的目的；或构建带有大量表达(over-expressed)启动子的目标基因顺义链的方式，使基因大量表达而造成共同抑制(co-suppression)现象，进而抑制基因的表达。然而，上述两种方法沉默(silience)基因的效果并不好。随着基因沉默机制逐渐被明了，认为双链RNA才是造成基因沉默的主要因子，因此构建能形成双链RNA的DNA结构，并转殖进入生物中，发现能提高沉默基因的能力，其中若以功能完整的内含子(intron)为形成圈环(loop)的spacer，基因表达甚至几乎可被完全抑制(Smith et al.，2000)。
RNA干扰(RNAi)为一种降低(knock-down)目标基因表达的方法，该方法通过小型单-或双-链RNA(ssRNA、dsRNA)以沉默(silencing)基因的表达。干扰性RNA包括小片段干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、双链或单链(ds siRNA或ss siRNA)、微型RNA(miRNA)、小型发夹状RNA(shRNA)等。不受理论所束缚，RNA干扰会在体内产生，dsRNA将会被一种名为切块酶(Dicer)的类RNaseIII(RNaseIII-like)酶所辨识，将dsRNA切割出3’端具有2个核苷酸突出(overhang)的小片段RNA分子，即为siRNA，其大小约为21至23个核苷酸(Elbashiret al.，2001；Zamore et al.，2000)。
siRNA与一种蛋白质复合物相结合，此蛋白质复合物称之为RISC(RNA-诱发沉默复合物，RNAi silencing complex)，RISC具有解旋酶，可以解开双链结构的siRNA形成单链结构，其中siRNA的反义(antisense)链(或称引导链，guide strand)会与RISC相结合以引导RISC至目标mRNA上，并与之结合以进行目标mRNA的降解，进而达到沉默目标基因的表达(Matzke etal.，2001；Waterhouse et al.，2001)；其中该目标mRNA即与该siRNA的反义链为互补的序列。
Smith等(2000)以转殖含顺义或反义的马铃薯病毒(potato virus Y，PVY)的Nia-protease(Pro)基因，使马铃薯抗PVY，两者产生基因沉默转殖株的比率分别为7％及4％，但若以具可形成双链RNA的反向重复(inverted-repeat)DNA，并将功能完整的内含子(intron)构建为形成圈环(loop)的spacer，则转殖效率可高达96％(22/23)。推测intron存在可以帮助RNA稳定、调整RNA方位，且真核生物在spilicing过程，preRNA会短暂形成复式结构(duplex)，利用此特性能帮助双链RNA形成，提高抑制效果(Smith et al.，2000)。
一般而言，转殖方法是通过农杆菌携带一外源(exogenous)基因以感染胚胎物质(embryogenic material)如胚胎愈伤组织(embryogenic callus)、胚胎悬浮物(embryogenicsuspension)，或体细胞(somatic cell)，以得到该转殖基因植物。而香蕉的基因转殖方法，现有技术中揭露于马溯轩.1988的香蕉的体胚发生与植株再生研究中，或于Dean Engler等人的美国专利公告号6,133,035，一种产生转殖基因香蕉的方法等相关文献、专利。然而，熟知本领域技艺者知，不同物种或不同基因的转殖基因技术、基因传送(deliver)方式，会因不同物种的基因组(genome)、或不同的转殖基因结构(gene structure)等因素，影响转殖基因、基因传送至生物体上的成功率，甚者，更需依不同基因或不同物种所需，以改良转殖基因、或传送基因的方式。因此，本发明欲通过转殖干扰性RNA于香蕉中，以降低乙烯的生物合成，进而达到延长果实保鲜期的目的。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种利用干扰性RNA以延长香蕉保鲜期的组成物，该组成物包含干扰性RNA，通过基因转殖技术将该干扰性RNA转殖于香蕉，用以抑制/降低乙烯的生物合成。
本发明的次一目的是在于提供一种利用干扰性RNA以延长香蕉保鲜期的方法，该方法通过转殖干扰性RNA于香蕉以降低香蕉ACC氧化酶基因的表达，进而抑制/降低乙烯的生物合成，以延长香蕉保鲜期。
本发明的另一目的是在于提供一种香蕉ACC氧化酶控制组合物，该控制组合物包含干扰性RNA，用以抑制/降低香蕉ACC氧化酶基因的表达。
本发明的又一目的是在于提供香蕉的新颖转殖基因方法，该转殖基因方法包含通过香蕉雄花序所诱导的愈伤组织细胞、或由香蕉果手原体所诱导的体胚细胞、或由香蕉的顶端分生组织所诱导的体胚细胞为材料，进行基因转殖，以得到转殖基因香蕉。
本发明的再一目的是在于通过新颖的转殖基因方法将香蕉ACC氧化酶控制组合物转殖于香蕉内，以抑制香蕉ACC氧化酶的mRNA表达，进而抑制/降低香蕉的乙烯生物合成。
可达成上述发明目的的一种利用干扰性RNA以延长香蕉保鲜期的组成物，包含 至少一种干扰性RNA、基因转殖表达载体及药学上可接受的载剂；其中该干扰性RNA是连接于该基因转殖表达载体启动子的3’端，依序以反义链-内含子-正义链的香蕉基因序列构建于基因转殖表达载体，该干扰性RNA用以抑制香蕉中与乙烯生物合成相关酶的基因表达； 其中该干扰性RNA具有如SEQ ID No1的序列，可于香蕉内同时抑制香蕉ACC氧化酶-1A(MAO1A)及ACC氧化酶-1B(MAO1B)的mRNA表达，进而降低乙烯的生物合成量； 其中该干扰性RNA具有如SEQ ID No2的序列，可于香蕉内用以抑制香蕉ACC氧化酶-2(MAO2)的mRNA表达，进而降低乙烯的生物合成量； 上述干扰性RNA的序列以反义链-内含子-顺义链的方式构建，其中该反义链、内含子或顺义链分别对应于香蕉目标基因的mRNA序列，具有至少80％的序列互补性(complementary)，或是至少90％的序列同一性(Identity)。
其中该载剂可为水、或各类适用的缓冲液，可使干扰性RNA或其表达载体易于操作、易于保存及较为稳定不易降解。
本发明进一步提供一种香蕉ACC氧化酶控制组合物(control cassette)，包含 上述的干扰性RNA；以及 基因转殖表达载体； 其中干扰性RNA是连接于该基因转殖表达载体启动子的3’端，该启动子是可于含有香蕉ACC氧化酶控制组合物的香蕉内，启动该干扰性RNA的转录作用(transcription)。
其中上述的基因转殖表达载体，包括但不限于pBI101、pBI121、pBIN 19(ClonTech)、pCAMBIA1301、pCAMBIA1305、pGREEN(GenBank Accession NoAJ007829)、pGREEN II(GenBank Accession NoEF590266)(www.pGreen.ac.uk)、pGreen0029(John Innes Centre)。
取香蕉的雄花序置于适当培养基以诱导愈伤组织的生成；待愈伤组织生成后，取愈伤组织细胞以适当培养基建立均质化悬浮培养细胞；将转型后农杆菌(包含基因转殖表达载体，该载体可于植物中表达上述干扰性RNA)转殖于愈伤组织细胞中(农杆菌媒介法)；经适当培养时间后，再以含适用抗生素培养基筛选这些植株，以筛选出成功转殖的植株；将筛选后存活的植株置换于适当培养基以进行体胚的分化、丛生芽及根的诱导。
本发明另提供以香蕉的果手原体(fruit finger primordia)或顶端分生组织作为基因转殖材料的方法，包含 将果手原体或顶端分生组织先置于适当培养基以诱导形成体胚细胞；将转型后农杆菌(包含基因转殖表达载体，该载体可于植物中表达上述干扰性RNA)转殖于体胚细胞(农杆菌媒介法)；经适当培养时间后，再以含适用抗生素培养基筛选这些植株，以筛选出成功转殖的植株；将筛选后存活的植株置换于适当培养基以进行丛生芽及根的诱导。
上述的转殖的方式包括但不限于农杆菌媒介法、基因重组病毒感染法、跳跃子载体转殖法、基因枪转殖法、电穿孔法、显微注射法、花粉管法、脂质体媒介转殖法、超音波媒介转殖法、碳化硅纤维媒介转殖法(silicon carbide fiber-mediated transformation)、电泳法(electrophoresis)、雷射微光束(laser microbeam)、聚乙烯二醇(polyethylene glycol，PEG)、磷酸钙转殖法、DEAE-dextran转殖法等。
术语“转殖植株”意旨通过转殖作用，将外源性基因转殖到目标植物体中，进而改变转殖植物体的基因组组成，使外源性基因可存在于目标转殖植物体及其后代中。
术语“基因表达”意旨mRNA或蛋白质的表达。
本发明所提供的一种应用基因工程技术延长香蕉保鲜期的方法、组成物及其应用，与其它现有技术相互比较时，更具有下列的优点 1.本发明所提供的一种延长香蕉保鲜期的RNA干扰性组合物及其方法，可有效控制香蕉的乙烯生物合成，且较一般香蕉的后熟现象更延缓，故更可延长香蕉保鲜期。
2.本发明所提供的一种延长香蕉保鲜期的RNA干扰性组合物及其方法，除了可有效控制香蕉的乙烯生物合成，且仍可通过人工催熟方式，控制其成熟的时间，因此，可大幅提升香蕉的经济价值、储藏及运送的时程。
3.本发明所提供的一种延长香蕉保鲜期的转殖方法，相较于现有转殖技术，更适用于香蕉的基因转殖，转殖效率也较现有转殖技术更佳。
请参阅以下有关本发明较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为 图1A-C为基因沉默通用载体pRNAi的构建流程； 图2A-F为抑制香蕉后熟相关基因载体pBI121-2AnS及pBI121-1AnS的构建流程； 图3为香蕉进行农杆菌转殖的筛选及转植株的再生情形； A经农杆菌转殖后于置于筛选培养基的细胞；B于培养基上的细胞团；C体胚生长情形；D体胚放大图；E于诱导小苗生成培养基上的培养情形；F再生的小苗； 图4为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体pBI121-2AnS的香蕉植株生长情形； A、C、E、G及I，为未转殖的香蕉植株对照组；B、D、F、H及J，为转殖的香蕉植株；K为未转殖的香蕉果实；L为转殖的香蕉果实； 图5为香蕉基因沉默转殖株基因组DNA的Southern杂交分析； ApBI121-2AnS的T-DNA区域构建及杂交所用的探针；B以Mh-ACO2基因片段为探针的Southern杂交结果。
图6为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体的北蕉转殖系的Mh-ACO2基因表达； A为各转殖系叶片的RT-PCR分析结果；B为不同转殖系的RT-PCR表达定量柱形图，其计算标准以WT的表达量为100％； 图7为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体的北蕉转殖系2AS-79不同器官的Mh-ACO2基因表达量； A为WT与2AS-79转殖系各器官的RT-PCR分析结果；B为各器官的RT-PCR表达定量柱形图，其计算标准以WT的表达量为100％； 图8为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体的北蕉转殖系2AS-79不同部位的siRNA表达情形；杂交的探针为Mh-ACO2基因片段，并以合成的25nt及17nt专一性Mh-ACO2基因片段为对照组；WT-O未转殖香蕉的子房；79-Pi2AS-79转殖系的雌蕊；79-S2AS-79转殖系的雄蕊；79-Pe2AS-79转殖系的花瓣；79-O2AS-79转殖系的子房；79-B2AS-79转殖系的苞片； 图9为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体的北蕉果实后熟果皮转色情形； A果皮转色的过程；B果皮转色指数图；标准尺(Bars)＝5cm； 图10为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体的北蕉果实后熟的呼吸率及乙烯生成量变化； A果实后熟过程的呼吸率变化；B果实后熟过程的乙烯生成量变化； 图11为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体的北蕉果实催熟处理后的果皮转色情形； A果皮转色的过程；B果皮转色指数图；标准尺(Bars)＝5cm； 图12为转殖沉默香蕉后熟相关基因载体的北蕉果实催熟处理后的呼吸率及乙烯生成量变化； A果实催熟处理后的呼吸率变化；B果实催熟处理后的乙烯生成量变化。
具体实施例方式 本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所用的试剂如无特别指明，皆为市售易于取得的材料。
实施例1 含有抑制香蕉后熟相关基因载体的构建 1.基因沉默通用载体pRNAi的构建 (1)质粒材料 a.pUC19质粒全长2.682kb，含有大肠杆菌筛选基因AmpR(GenBank accession no.L09137)。
b.pU35STgfp质粒带有2X En CaMV 35S启动子、green fluorescent protein(GFP)基因、nopaline synthase(NOS)基因终止子。该原始质粒来源为PNAS(1996)935888-5893，以限制酶HindIII单切切下1854bp后，接入单切HindIII的pUC19载体中，即成为pU35STgfp。
(2)基因来源 构建pRNAi载体所使用的内含子(intron)，来源为香蕉ACC氧化酶基因MAO1A(GenBank accession no.AF030411)及基因MAO1B(GenBank accession no.AF030410)的第一个内含子(其序列如SEQ ID No17)，此二基因的第一个内含子的序列完全相同。
(3)香蕉基因组DNA的萃取 剪取1g的样品，经液态氮磨碎后，加入15ml extraction buffer(100mM Tris-HCl，pH 8.0；50mM EDTA；500mM NaCl)，再加入1ml 20％SDS，于65℃静置10分钟后，加入5ml 5M醋酸钾(potassium acetate，KOAc)，于冰上静置20分钟。以25,000xg于4℃离心20分钟，以尼龙网过滤后，加入10ml异丙醇(isopropanol)沉淀30分钟后，于4℃ 20,000xg离心15分钟，去除上清液后，风干沉淀物。加入0.7ml High TE(50mM Tris-HCl，pH 8.0；10mMEDTA)溶解后，加入75μl 3M醋酸钠(sodium acetate，NaOAc)及500μl异丙醇(isopropanol)混合后，于4℃以微量离心机离心10分钟。分别经由70％及100％酒精洗盐后风干，以100μlTE(pH 8.0)溶解备用。
(4)构建流程 如图1A所示，首先将pUC19以EcoR I及Sal I进行酶切，去除pUC19上大部分的MCS(Multiple cloning site)区域，再以Klenow酶进行平端(blunt end)处理，经电泳分离，回收2.6kb片段，以此片段进行自行接合(self-ligation)，得到中间载体pUC19m。将中间载体pUC19m以限制酶HindIII进行酶切，回收约2.6kb长度的片段；将pU35STLgfp以限制酶HindIII进行酶切，回收1.8kb片段，将二者进行接合反应，将得到的质粒进一步以限制酶及电泳进行筛检，以取得中间载体pUC19m-35S。请参阅图1B所示，续以香蕉基因组DNA为模版，通过PCR以合成香蕉ACC氧化酶基因MAO1的第一个内含子，用以合成该第一内含子的寡核苷酸引物(oligonucleotide primers)如下所示 正向引物IMAO-1(含有KpnI限制酶酶切位置)
(SEQ ID No3) KpnI 反向引物IMAO-2(含有BamHI限制酶酶切位置)
(SEQ IDNo4) BamHI 通过IMAO-1及IMAO-2引物以PCR合成所得到的DNA片段，以限制酶Kpn I、BamHI进行限制酶酶切，回收约0.12kb的片段(MAO1 intron1)，与酶切后的pUC19(以限制酶KpnI、BamHI进行限制酶酶切)，进行接合反应后，得到2.8kb的中间质粒pUIN。如图1C所示，接着将中间质粒pUC19m-35S以限制酶EcoRI及XbaI进行限制酶酶切，回收3.6kb片段；另将中间质粒pUIN以限制酶EcoRI、XbaI进行限制酶酶切，将MAO1基因第一个内含子切下，回收0.13kb片段，将上述得到的二片段(MAO1基因第一个内含子片段、及酶切后的pUC19m-35S)进行接合反应，得到RNA沉默通用载体pRNAi(图1C)。
2.沉默香蕉MAO2表达的RNA沉默结构的构建 首先抽取香蕉的总RNA，其方法如下剪取植物材料以液态氮研磨成粉末状。加入20mL65℃提取缓冲液(Extraction buffer)(2M NaCl，25mM EDTA，pH 8.0，100mM Tris-HCl，亚精胺(spermidine)0.5g/L，3％十六烷基三甲基色氨酸溴化物(Hexadecyl trimethyl-ammoniumbromide)，3％聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone-40)，0.4％2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，以均质机搅拌均匀后，于65℃处理10分钟。加入等量的CI(氯仿∶异戊醇＝49∶1)，混匀后离心，将上清液重新萃取一次后，加入1/3倍体积的8M LiCl，置4℃沉淀过夜。以4℃离心后去除上清液，以0.5％SDS悬浮RNA，加入等体积的CI震荡混合数秒，以4℃离心后，再取上清液，加入2倍体积的100％酒精，置于-20℃沉淀。之后再以4℃离心后去除上清液。加入500μl的70％酒精后，于4℃离心后去上清液。加入500μl的100％酒精后，于4℃离心后去上清液。风干RNA沉淀。将RNA溶于适量的DEPC水中，进行浓度定量后备用。
pRNAi-2AnS质粒(antisense-sense)的构建流程，请参阅图2所示 步骤1 请参阅图2A所示，首先以香蕉的总RNA为模版，使用One-Step RT-PCR Kit(GeneMark)进行反应，反应液中包含0.1μg/μL模板RNA，50ng/μL引物，1X反应混合液(Reaction Mix)，1X增强子(Enhancer)，2％酶混合液(Enzyme Mix)。反应温度为50℃30分钟，94℃2分钟，之后94℃30秒，59℃30秒，72℃1分钟进行35个循环。最后再反应72℃10分钟，置于4℃备用。所使用的引物如下所示 正向引物MAO25L(含有BamHI限制酶酶切位置)
(SEQ ID No5) Bam HI 反向引物MAO2 3L(含有EcoRI限制酶酶切位置)
(SEQ ID No6) EcoRI PCR合成长度约0.14bp的核苷酸片段(MAO2片段)，再将MAO2片段以BamHI及EcoRI进行酶切及回收，与酶切后的pUC18(以BamHI及EcoRI酶切)进行接合反应，得到含MAO2cDNA 139bp的质粒pUC18-m2p(图2A)。
步骤2 质体pRNAi以XbaI进行酶切，再以Klenow酶平端(blunt)处理，再以BamHI进行酶切，回收3.8kb的片段；将步骤1所得的pUC18-m2p再以EcoRI进行酶切，续以Klenow酶平端处理，再以BamHI进行酶切，回收0.14kb的片段。将前述两个酶切回收后的DNA片段(pUC18-m2p及pRNAi)进行接合反应，得到含正义(sense)MAO2部分cDNA片段的质粒pRNAi-2xnS(图2B)。
步骤3 质粒pRNAi以KpnI进行酶切，以Klenow酶平端处理后，再以EcoRI进行酶切，回收3.8kb的片段；将步骤1所得的pUC18-m2p以BamHI进行酶切，再以Klenow酶平端处理，接着以EcoRI进行酶切，回收0.14kb的片段。将前述两个酶切回收后的DNA片段(pUC18-m2p及pRNAi)进行接合反应，得到含反义(antisense)MAO2部分cDNA片段的中间质体pRNAi-2Asn(图2C)。
步骤4 将步骤3的pRNAi-2Asn及步骤2的pRNAi-2xnS均以XhoI及SacII酶切，分别回收150bp及3.8kb的片段进行接合反应后，得到含有MAO2部分cDNA序列反义(antisense)MAO2(反义链MAO2片段序列如SEQ ID No18)、正义(sense)MAO2(正义链MAO2片段序列如SEQ ID No19)的质粒pRNAi-2AnS(pRNAi-2AnS具有依序(5’端至3’端)反义MAO2-第一内含子-正义MAO2的构建序列，如SEQ ID No2)(图2D)。
步骤5 将质粒pRNAi-2AnS以HindIII酶切，回收1.4kb，与经HindIII酶切的pBI121(GenBankaccession no.AF485783)进行接合反应，得到农杆菌转殖用质粒pBI121-2AnS(图2E)。
3.沉默香蕉MAO1表达的RNA沉默结构的构建 pRNAi-1AnS载体(antisense-sense)的构建流程，同MAO2的构建策略，其中不同处为PCR选殖MAO1片段的引物不同，如下所示 正向引物MAO1 5L(含有Bam HI限制酶酶切位置)
(SEQ ID No7) BamHI 反向引物MAO1 3L(含有EcoRI限制酶酶切位置)
(SEQ ID No8) EcoRI 请参阅MAO2构建策略，以得到含有MAO1部分cDNA序列反义MAO1(反义链MAO1片段序列如SEQ ID No20)、正义MAO1(正义链MAO1片段序列如SEQ ID No21)的载体pBI121-1AnS(具有依序(5’端至3’端)反义MAO1-第一内含子-正义MAO1的构建序列，如SEQ ID No1，由于香蕉的MAO1A及MAO1B具高度保留(conserved)序列，故本发明的MAO1干扰性RNA，具有经上述构建所得的序列，如SEQ ID No1，可同时抑制MAO1A及MAO1B的基因表达)(图2F)。
上述实施例仅为一较佳示范说明，非用以限制本发明的构建方式，其它适用的构建策略亦包含于本发明中。
实施例2 香蕉的基因转殖技术与流程 1.农杆菌媒介法基因转殖 转殖的A及B方法，参照修改自马溯轩(1988)，其步骤如下 A方法 (1)植物材料及其它材料 香蕉北蕉品种(Musa spp.cv.Pei Chiao，AAA group)。由雄花序所诱导的悬浮培养细胞，及其愈伤组织(Callus)。下述材料皆为市售可得。
(2)转殖的媒介 使用的农杆菌品系为LBA4404(Hoekema et al.，1983)，转化(transformation，请参考Molecular Cloning)实施例1所构建的pBI121-2AnS或pBI121-1AnS质粒。
(3)香蕉基因转殖方法 步骤一愈伤组织的诱导 取香蕉北蕉品种(Musa spp.cv.Pei Chiao，AAA group)的雄花序置于诱导培养基(愈伤组织诱导培养基，如表1)，以诱导愈伤组织的生成。
表1 愈伤组织诱导培养基的组成 成分浓度 MS salt 1X VB1-HCl(Thiamine-HCl) 0.1～1mg/L 烟酸(nicotinic acid)0.5mg/L VB6-HCl(pyridoxine-HCl) 0.5mg/L 氨基乙酸(Glycine) 2mg/L 肌醇(myo-inositol) 100mg/L 生物素(Biotin) 1mg/L IAA 1mg/L NAA 1mg/L 2.4-D 4mg/L 蔗糖(Sucrose) 3～4.5wt％ 琼脂(Agar) 0.7wt％ 注1其中0.7wt％Agar可为0.2％～0.3wt％水晶洋菜(Gelrite)。
注2培养基的最终pH为5.3～5.7。
步骤二悬浮细胞建立 待愈伤组织生成后，取适量的愈伤组织细胞，以悬浮培养基(如表2)将愈伤组织细胞悬浮培养，以建立均质化悬浮培养细胞。
表2 悬浮培养基的组成 成分 浓度 MS salt 1X Thiamine-HCl 0.1～1mg/L nicotinic acid0.5mg/L pyridoxine-HCl0.5～5mg/L glycine， 2～5mg/L myo-inositol 100mg/L Biotin1mg/L 谷氨酸盐(glutamine) 0～100mg/L 麦芽提取物(malt extract) 0～500mg/L 脯氨酸(proline) 0～230mg/L 毒莠定(Picloram) 0～1mg/L 2.4-D 1mg/L Sucrose 3～4.5wt％ 注1其中1mg/L 2.4-D可为荷尔蒙混合物，该荷尔蒙混合物包含1mg/L IAA、1mg/LNAA及4mg/L 2.4-D。
注2培养基的最终pH为5.3～5.7。
步骤三共培养转殖 进行基因转殖前，先接种单一菌落的转型后农杆菌，于20ml含有适量抗生素(50μg/ml卡拉霉素(kanamycin)、20μg/ml链霉素(streptomycin)及100μg/ml利副霉素(Rifamycin))的YEB液体培养基(5g/l 牛肉膏(beef extract)，1g/l 酵母膏(yeast extract)，5g/l 蛋白胨(peptone)，5g/l 甘露醇(mannitol)，0.5g/l MgSO4，pH7.5，12.5g/l agar)，在28℃、240rpm下震荡培养两天，待OD600至1.0～1.5，将菌液经4,000rpm(HERMLE Z363 K)离心20分钟之后，去除上清液，再以共培养转殖培养基(如表3)重新悬浮之，以得到一转化后农杆菌的悬浮菌液备用，该转化后农杆菌包含有前述所构建的pBI121-2AnS质粒或pBI121-1AnS质粒。
取适量的愈伤组织细胞或悬浮培养细胞，与上述悬浮菌液混合后进行震荡共培养，再静置于25℃共培养2-4天。 表3 共培养转殖培养基的组成 成分 浓度 MS salt1X Thiamine-HCl 0.1～1mg/L nicotinic acid 0.5mg/L pyridoxine-HCl 0.5mg/L glycine2mg/L myo-inositol 100mg/L Biotin 1mg/L glutamine 100mg/L malt extract 500mg/L proline230mg/L 2，4-D 1mg/L 甜菜碱(betaine)1mM 乙酰丁香酮(acetosyringone) 0.1～0.3mM Sucrose3～4.5wt％ 注1其中MS salt可为SH salt。
注2培养基的最终为pH 5.3～5.7。
步骤四转殖后筛选 静置共培养2-4天后，将转殖共培养后的细胞置于固态转殖后筛选培养基(如表4)，进行转殖植株的筛选。表4 转殖后筛选培养基的组成 成分 浓度 MS salt 1X Thiamine-HCl 0.1～1mg/L nicotinic acid0.5mg/L pyridoxine-HCl0.5mg/L glycine 2mg/L myo-inositol 100mg/L Biotin 1mg/L glutamine 100mg/L malt extract100～500mg/L proline 230mg/L 2.4-D 1mg/L Sucrose 3～4.5％ 乳糖(Lactose) 0～0.1％ Agar0.7％ 头孢噻肟(Cefotaxime)200mg/L G418适当浓度 注1其中1mg/L 2.4-D可为荷尔蒙混合物，该荷尔蒙混合物包含0.05mg/L玉米素(Zeatin)、0.2mg/L 2ip、0.1mg/L激动素(kinetin)及0.2mg/L NAA。
注2其中0.7％Agar可为0.2％～0.3％Gelrite。
注3其中适当浓度的G418可为适当浓度的潮霉素(hygromycin)；该适当浓度所指为由低至高严苛度(Stringency)进行筛选，较佳实例为50mg/L G418。
注4培养基的最终pH为5.3～5.7。
步骤五分化体胚(Embryo) 以固态转殖后筛选培养基培养两个月之后，再换至再生培养基(如表5所示)继续培养，至细胞形成体胚。
表5 再生培养基的组成 成分 浓度 MS salt 1X Thiamine-HCl 0.1～1mg/L nicotinic acid0.5mg/L pyridoxine-HCl0.5mg/L glycine 2mg/L myo-inositol 100mg/L Biotin1mg/L glutamine 0～100mg/L malt extract 0～100mg/L 荷尔蒙混合物 Sucrose3～4.5wt％ Lactose0～0.1wt％ Agar 0.7wt％ G418 适当浓度 注1其中MS salt可为SH salt、或B5 salt。
注2其中该荷尔蒙混合物可为(1)0.05mg/L Zeatin、0.2mg/L 2ip、0.1mg/L kinetin及0.2mg/L NAA或(2)1mg/L BA及0.1mg/L GA。
注3其中0.7％Agar可为0.2％～0.3％Gelrite。
注4其中适当浓度的G418可为适当浓度的hygromycin；该适当浓度所指为由低至高严苛度(Stringency)进行筛选，一较佳实例为100mg/L G418。
注5培养基的最终pH为5.3～5.7。
步骤六诱导丛生芽(induce multiple shoot) 待细胞形成体胚后，将体胚细胞移置诱导丛生芽培养基(如表6所示)，诱导体胚萌发丛生芽，再生成为幼苗。 表6 诱导丛生芽培养基的组成 成分浓度 MS salt Thiamine-HCl0.1～1mg/L nicotinic acid 0.5mg/L pyridoxine-HCl 0.5mg/L glycine 2mg/L myo-inositol100mg/L Biotin 1mg/L Glutamine 0～100mg/L 荷尔蒙混合物 Sucrose3wt％ Agar 0.7wt％ G418 适当浓度 注1其中MS salt可为1/2MS salt、或B5 salt。
注2其中该荷尔蒙混合物可为(1)1mg/L BA、0.1mg/L GA或(2)1mg/L 2iP、0.1mg/LGA。
注3其中0.7％Agar可为0.2％～0.3％ Gelrite。
注4其中适当浓度的G418可为适当浓度的hygromycin；该适当浓度所指为由低至高严苛度(Stringency)进行筛选，一较佳实例为100mg/L G418。
注5培养基的最终pH为5.3～6.0。
步骤七诱导根 待幼苗长至适当大小，再移至诱导根培养基(如表7所示)以诱导其发根，促使植株长大。(图3A-F) 表7 诱导根培养基的组成 成分浓度 MS salt 1X Thiamine-HCl0.1～1mg/L nicotinic acid 0.5mg/L pyridoxine-HCl 0.5mg/L glycine 2mg/L myo-inositol100mg/L IBA 2.5mg/L BA 2.5mg/L Sucrose 3wt％ Agar0.7wt％ G418适当浓度 注1其中0.7％Agar可为0.2％～0.3％Gelrite。
注2其中适当浓度的G418可为适当浓度的hygromycin；该适当浓度所指为由低至高严苛度(Stringency)进行筛选，一较佳实例为100mg/L G418。
注3培养基的最终pH为5.3～6.0。
B方法 (1)植物材料及其它材料 香蕉北蕉品种(Musa spp.c v.Pei Chiao，AAA group)。下述材料皆为市售可得。
(2)转殖的媒介 使用的农杆菌品系为LBA4404(Hoekema et al.，1983)，转化前述所构建的pBI121-2AnS质粒。
(3)香蕉基因转殖方法 步骤一诱导体胚(Embryo) 将香蕉的果手原体或取顶端分生组织，做为转殖材料。将果手原体或顶端分生组织先置于诱导培养基(如表8所示)以诱导形成体胚细胞。
步骤二共培养转殖 取体胚细胞与前述转化后农杆菌液(该转化后农杆菌包含有前述所构建的pBI121-2AnS质粒或pBI121-1AnS质粒)及诱导培养基(如表8所示)进行共培养转殖处理。
步骤三转殖后筛选 共培养后，将转殖体移至含50mg/L G418的诱导培养基(如表8所示)进行转殖后筛选。
步骤四培养成株 将筛选后的转殖体移至含抗生素的诱导培养基(如表8所示)，并于转殖处理后约八个月即可得到出瓶的转殖植株。 表8 诱导培养基的组成 成分 浓度 MS salt1X Thiamine-HCl 0.1～1mg/L nicotinic acid 0.5mg/L pyridoxine-HCl0.5mg/L glycine 2mg/L myo-inositol 100mg/L IBA 2.5mg/L BA2.5mg/L Sucrose 3wt％ Agar 0.7wt％ G418 适当浓度 注1其中0.7％Agar可为0.2％～0.3％Gelrite。
注2其中适当浓度的G418可为适当浓度的hygromycin；该适当浓度所指为由低至高严苛度(Stringency)进行筛选，一较佳实例为100mg/L G418。
注3培养基的最终pH为5.3～6.0。
2.转殖香蕉的筛选与生长情形 与未转殖北蕉植株相比，Mh-ACO2沉默北蕉转殖株在组织培养期间、定植后，直到株高约1.5公尺前，生长情形与未转殖对照株均无明显差异(图4A-H)。继续栽培约五个月后，未转殖对照株生长至株高3公尺以上，健叶数约10片，但转殖株株高均仅约2.5公尺，而健叶数与对照株相似，亦约为10片叶(图4I-L)。
实施例3 应用Southern杂交法取得转殖香蕉的分子证据 香蕉转殖细胞经过抗生素筛选再生为小苗，利用GUS活性组织化学染色法进行报道基因的确认后，进一步即可进行分子层次的分析，本实施例利用Southern杂交分析，确认欲转殖的DNA片段整合至香蕉基因组中。
取20μg植物基因组DNA，利用适当的限制酶进行酶切，以0.7％agarose gel进行电泳分析。电泳胶体以0.25N HCl处理15分钟两次，再以变性缓冲液(1.5MNaCl，0.5M Tris-HCl，pH 7.2，1mMNa2EDTA)处理15分钟两次，再以中和缓冲液(1.5MNaCl，0.5M Tris-HCl，pH7.2，1mM Na2EDTA)处理15分钟两次。将胶体内的DNA转印至Hybond N转渍膜(Amersham)上，以条件为UV 120mJ/cm2的杂交仪(cross-linker)(Spectrolinker XL-1500)将DNA固定于转渍膜上，置于80℃真空烘箱中一小时以固定DNA。
转渍膜以预杂交溶液(prehybridization solution)[6X SSPE(20X SSPE175.3g/L NaCl，31.2g/L NaH2PO4·2H2O，7.4g/L Na2EDTA，pH 7.4)，0.5％SDS，5X BFP(100X BFP2％BSA，2％Ficoll-40,000，2％PVP-360,000)，50μg/mL变性的鲑鱼精(salmon sperm)DNA，10％硫化糊精(dextrin sulfate)〕，在65℃下反应至少两个小时，加入含有放射线标定探针的杂交溶液(hybridization solution)6X SSPE(20X SSPE175.3g/L NaCl，31.2g/L NaH2PO4·2H2O，7.4g/L Na2EDTA，PH 7.4)，0.5％SDS，5X BFP(100X BFP2％BSA，2％聚糖体-40000(Ficoll-40,000)，2％PVP-360,000)，50μg/mL变性的salmon sperm DNA，10％ dextrin sulfate，于65℃下反应16小时以上，以Wash I solution (2X SSPE，0.1％SDS)，于室温下洗15分钟两次，再以WashII solution(1X SSPE，0.1％SDS)于65℃下洗15分钟两次，以洗去非专一性杂交的探针，最后则利用X光片(Kodak XAR film)曝光。
由试验分析结果显示，香蕉基因组利用EcoRI与HindIII进行专一性切位的酶切，预计得到两种DNA片段大小，分别为1267bp与3,040bp，因此利用不同的探针，标定不同的外来基因。以Mh-ACO2基因片段为探针(以质粒pRNAi-2ANS利用限制酶XhoI及Sac II进行双酶切，所取得的160bp Mh-ACO2基因片段作为探针，其序列如SEQ ID No9)进行杂交分析的结果证实，转殖株基因组中确实已含有Mh-ACO2基因片段。虽然除了出现预期中的片段大小外，尚出现了3,040bp片段讯号，然而所转殖的DNA片段中并没有3,040bp的大小，故推测此DNA片段为香蕉基因组中的内生Mh-ACO2基因片段(图5A-B)。
实施例4 从RNA层次观察转殖基因启动的目标基因转录抑制现象 1.以反转录聚合酶连锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)观察转殖基因的转录抑制作用 以抽取的总RNA当作模板，使用One-Step RT-PCR Kit(GeneMark)进行反应，反应液中包含，0.1μg/μL模板RNA，50ng/μL引物，1X Reaction Mix，1X Enhancer，2％Enzyme Mix。反应温度为50℃30分钟，94℃2分钟，之后94℃30秒，59℃30秒，72℃1分钟进行35个循环。最后再反应72℃10分钟，置于4℃备用。所使用的引物如下所示 Mh-ACO2基因 正向引物MAO2-5RT 5’-atggattcctttccggttatcgaca-3’ (SEQ ID No10) 反向引物MAO2-3RT 5’-attccttcatcgccttccta-3’ (SEQ ID No11) 香蕉actin基因 正向引物BACT5 5’-tagcggacgtaccacaggtat-3’ (SEQ ID No12) 反向引物BACT3 5’-gtaagcaagcttctccttgat-3’ (SEQ ID No13) 利用RT-PCR检测不同转殖株间Mh-ACO2表达情形，以新叶组织材料总RNA进行试验。结果如图6所示，与未转殖的香蕉新叶总RNA相比，转殖株中的Mh-ACO2表达量均有减少的情形，且不同转殖株间，沉默效果有程度上的差异。以未转殖控制组Mh-ACO2表达量当作100％，其中转殖株系编号2AS-1转殖株，Mh-ACO2基因表达降低79.3％，2AS-6降低96.0％，2AS-78降86.3％，2AS-79降54.4％，2AS-80降低89.2％，2AS-82降低96.0％，2AS-87降低37.8％(图6A-B)。
观察Mh-ACO2于未转殖对照株与Mh-ACO2沉默转殖株，在叶、雄蕊、雌蕊、花瓣、子房及苞片等组织中的表达情形。结果如图7A-B所示，在未转殖控制组中，Mh-ACO2基因，除了在叶片中表达较少外，在雄蕊、雌蕊、花瓣、子房及苞片等生殖器官上，均发现Mh-ACO2呈现大量的表达。与未转殖对照株相比，转殖株在花瓣、雄蕊及雌蕊上，Mh-ACO2基因表达量有明显的沉默效果，在花瓣中抑制了71.0％的Mh-ACO2表达，在雄蕊中沉默效果达61.5％，在雌蕊中降低了60.5％的Mh-ACO2表达量，而在转殖株叶片中的表达，转殖株相似，表达量均较少，另外，在子房与苞片中，与未转殖对照株相比，Mh-ACO2则无明显降低情形，表达量与对照株相似(图7A-B)。
2.以小片段RNA Northern杂交分析观察转殖基因的转录抑制作用 取材料的基因组RNA，加入10μL尿素指示剂(Urea loading dye)(8M尿素(urea)，20mMEDTA-Na2，的5mM Tris-HCl pH 7.5，0.5％溴酚蓝(bromphenol blue))后，于100℃加热10分钟后，置于冰上备用。以含8M urea的15％聚丙烯酰胺(polyacryamide)胶体，以预热的65℃1X TBE(10X TBE为0.9M Tris，0.9M硼酸(boric acid)，20mM EDTA)当作电泳液，电压以250V进行电泳分离，胶体利用转移电泳槽(Tanan VE-186)将RNA转渍于Hybond N尼龙膜(Amersham)上，转渍电泳液为0.5X TBE，电压为50V，转渍一小时。将转渍膜移出风干，以UV 120mJ/cm2的cross-linker(Spectrolinker XL-1500)进行crosslink后，再以80℃真空干燥1小时，固定RNA。核酸探针备制与同位素标定方法，同实施例3的Southern杂交分析中所述。
将转渍膜以预杂交溶液(5X SSPE，50％甲酰胺(formamide)，0.5％SDS，5X BFP，在42℃下反应至少两个小时，加入含有放射线标定探针的杂交溶液(5X SSPE，0.5％SDS，5XBFP，200μg/mL变性的salmon sperm DNA，10％硫酸葡聚醣(dextran sulfate)，于室温下反应16小时以上，以Wash I solution(2X SSPE，0.1％SDS)，于室温下洗15分钟两次，再以WashII solution(1X SSPE，0.1％SDS)于42℃下洗15分钟两次，最后利用X光片(Kodak XAR film)于-80℃曝光。
利用RNA干扰技术，沉默目标基因，会产生21至27nt大小的RNA片段，利用北方杂交分析检测此些小片段RNA，以确认RNA干扰表达情形。以编号2AS-79转殖株的雄蕊、雌蕊、花瓣、子房及苞片组织，抽取总RNA，再利用RNA变性聚丙烯酰胺胶体(denaturedpolyacrylamide gel)进行电泳分离小于100nt以下的RNA，并利用Mh-ACO2的cDNA当作探针进行检测。结果如图8所示，在2AS-79转殖株的花瓣部位，检测到siRNA的表达，片段大小约为25-27nt，由此结果得知，RNA干扰作用确实的执行于转殖株之中。但在雄蕊、雌蕊、子房及苞片组织，则未检测到明显siRNA表达，此结果指出，RNAi的作用与siRNA的产生量，具有组织器官间的差异表达(图8)。
实施例5 利用基因转殖技术抑制香蕉的后熟现象 1.香蕉果实后熟试验 试验用香蕉果实，在绿熟阶段分开各果指清洗之后，以石油脂(vaseline)涂抹切口，自然风干后备用。自然后熟试验系将各果指放置于25℃，使其自然后熟。香蕉果实后熟的程度，一般常用的评估方式，通过观察果皮转色的程度，并依据果色指数(color index)进行分级，将果皮颜色由绿色至生理斑出现，共分成8级第1级为全绿(all green)，第2级为绿色带极微黄(green-trace of yellow)，第3级为绿色多于黄色(more green than yellow)，第4级为黄色多于绿色(more yellow than green)，第5级为两端绿(green tip)，第6级为全黄(all yellow)，第7级为生理斑点出现(yellow-flecked with brown)，第8级为斑点扩大(yellow with largebrown areas)。
如图9A-B所示，在自然后熟处理下，可发现未转殖对照株的果实，在约5天之后，即开始有缓慢的转色情形，在约第15天到达第3级，并在大约第20天之后，到达第4级，在第28天到达第5级，于第32天到达第6级，第35天到达第7级，第37天到达第8级。而Mh-ACO2沉默转殖株香蕉果色转色情形，与未转殖对照香蕉果实相比，后熟表达明显延缓，转殖株果皮在第6天后开始有缓慢转色，在约第20天时，达到第3级，并于第3级与第4级之间，维持了约20天，直到第40天后才进入第4级，并在第43天达到第5级(图9A-B)。
2.香蕉果实呼吸率测定 分别将香蕉果实单一果指，经过秤重后，置于1L的密封呼吸缸中，于25℃静置1小时后，吸取1mL呼吸缸中的气体，以气相层析仪[日本岛津公司GC-8AIT，搭配热传导检测器(Thermal conductivity detector，TCD)]，进行二氧化碳的测定，分离管柱为1/8”×6ft的不锈钢管柱，管柱内填充Porapak Q，80-100mesh，管柱烘箱温度定为40℃，注射口温度设定为80℃，以氢气为载行气体，压力设定在1kg/cm2。经气相层析仪检测后所得的二氧化碳高峰长度，计算香蕉果实呼吸率 呼吸速率(ml CO2/g/hr)＝ [(样品峰高-空白峰高)/标准气体峰高×标准气体浓度(％)×1/100×总体积(m1)]/[样品重量(g)×时间(hr)] 利用GC测定自然后熟果实的二氧化碳产生量，以推算后熟果实的呼吸率。结果如图10A所示，在第17天前，未转殖对照香蕉与转殖香蕉果实的呼吸率，均呈现低量稳定的表达，二者间无明显差异，到第18天后，未转殖对照果实呼吸率约0.03ml CO2/g/hr开始上升，直至第27天到达呼吸高峰0.05ml CO2/g/hr，然后开始下降。而转殖株果实到试验最后测定日期的第32天，依然持续维持着低量的稳定表达(图10A)。
3.香蕉果实乙烯生成量测定 分别将香蕉果实单一果指，经过秤重后，置于1L的密封呼吸缸中，于25℃静置1小时后，吸取1mL呼吸缸中的气体，以气相层析仪[CHROMPACK CP9001，搭配火焰离子检测器(Flame ionization detector，FID)]，分离管柱为1/8”×6ft的不锈钢管柱，管柱内填充活性氧化铝，80-100mesh，管柱烘箱温度定为90℃，注射口温度设定为150℃，侦测器温度设定130℃，以氢气为载行气体，压力设定在20kPa。燃烧气体为氢气与空气。经气相层析仪检测后所得的乙烯高峰长度，计算香蕉果实乙烯生成量 乙烯生成量(μl C2H4/g/hr)＝ [(样品峰高-空白峰高)/标准气体峰高×标准气体浓度(ppm)×总体积(ml)]/[样品重量(g)×时间(hr)] 利用GC测定自然后熟果实的乙烯生成量。结果如图10B所示，在第20天前，未转殖对照香蕉与转殖香蕉果实的乙烯生成量，均呈现极低量稳定的表达，且二者间的表达没有差异。在第20天后，未转殖对照株开始大量生成乙烯，在约27天到达乙烯生成高峰，约1.7μlC2H4/g/hr，之后则快速下降。而转殖株依然呈现极低量的表达情形，仅在约30天左右，有约0.2μl C2H4/g/hr的少量乙烯表达被侦测到(图10B)。
实施例6 催熟处理的转殖香蕉 1.香蕉果实催熟试验 试验用香蕉果实，在绿熟阶段分开各果指清洗之后，以石油脂(vaseline)涂抹切口，自然风干后备用。本次后熟试验，分别采取自然后熟以及外施乙烯催熟两部分。自然后熟部分，将各果指放置于25℃，使其自然后熟。外施乙烯催熟部分，于25℃下，将果实放置于密封的呼吸缸之中，呼吸缸内含有浓度500ppm的乙烯，进行处理24小时后，移出香蕉果实，于抽风橱中去除残存乙烯后，放置于25℃使其后熟。
以催熟前为第0天，催熟后为第1天当作基准。结果指出，经过催熟后的对照株香蕉果实，在催熟后第一天，即开始以一天一个等级向上升，于第8天到达第8级。而转殖株果实在第2天才开始转色，第3天到达第2级，第4天到达第3级，之后转色情形稍微延缓，至第6天才到达第4级，之后以一天上升一级的速度，直至第10天到达第8级(图11A-B)。
2.催熟后的香蕉果实呼吸率测定 利用GC测定催熟后果实的二氧化碳产生量，以推算后熟果实的呼吸率。结果显示，在催熟后第1天，未转殖对照株果实的呼吸率，即立即上升到第2天到达表达高峰，并维持稳定的高呼吸率表达，约维持在0.13ml CO2/g/hr，到第5天开始下降，而在第6天后呼吸率又再度上升。转殖株的呼吸率表达，在催熟第1天，同样的呼吸率有急速上升，上升至0.075mlCO2/g/hr后，在第2天随即就下降，之后持续维持在约0.04ml CO2/g/hr的低呼吸率表达，直至第6天后才开始急速上升，到第8天到达呼吸高峰0.11CO2/g/hr，之后则开始下降，在第10天后则又开始再度上升(图12A)。
3.催熟后的香蕉果实乙烯生成量测定 利用GC测定催熟处理后，后熟果实的乙烯产生量。结果显示，未转殖的对照株香蕉，在催熟处理第1天后，乙烯生成量即急速上升，在第2天到达约3μl C2H4/g/hr后，维持表达约到第6天后，开始再度上升，至约第7天到达乙烯生成量高峰5.2μl C2H4/g/hr，随后急速下降。而转殖株香蕉，在催熟后，仍然维持着低于0.1μl C2H4/g/hr的表达，直到第3天后才开始上升，并在第5天到达乙烯生成量高峰3.1μl C2H4/g/hr，之后则减减缓慢下降，并都维持在2-3μl C2H4/g/hr之间(图12B)。因此，该转殖香蕉仍可通过人工催熟处理，以控制其成熟的时间。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
序列表
<110>黄鹏林
<120>应用基因工程技术延长香蕉保鲜期的方法、组成物及其应用
<160>21
<210>1
<211>388
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>1
gtctcctcga agtccggagg gttggacggc cattcgttgt cgtctcgaag aacgaacacg60
tcctcccagt ccacgttgtc caagcgttga ccatcgcctt ctttcaccag tgtgtccaac120
agctgaacgg gtttggatcc gcggaggttt gccatcttca ccccgctcct ctcctctgct180
ttcatggcta tgctggtgta aaggtactat gttcccgatg ctctgtatcg tcgctcgcag240
ctgtcgacgg atccaaaccc gttcagctgt tggacacact ggtgaaagaa ggcgatggtc300
aacgcttgga caacgtggac tgggaggacg tgttcgttct tcgagacgac aacgaatggc360
cgtccaaccc tccggacttc gaggagac 388
<210>2
<211>394
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>2
gccttcctat actggtcatc aagatcgggg atctcagaaa tgttggagac ggggagatga60
cgcaggaaaa aggtgctttc ccagtcgagg tggtcgattt ctgagtcggc gttttccagt120
gctttgttgg cgaactcgga tccgcggagg tttgccatct tcaccccgct cctctcctct180
gctttcatgg ctatgctggt gtaaaggtac tatgttcccg atgctctgta tcgtcgctcg240
cagctgtcga cggatccgag ttcgccaaca aagcactgga aaacgccgac tcagaaatcg300
accacctcga ctgggaaagc acctttttcc tgcgtcatct ccccgtctcc aacatttctg360
agatccccga tcttgatgac cagtatagga aggc394
<210>3
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>3
ataggtaccc cgcggaggtt tgccatactt c 31
<210>4
<21129
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>4
ataggatccg tcgacagctg cgagcagac29
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>5
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<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>6
ccagaattcg ccttcctata ctg 23
<210>7
<211>21
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<220>
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<400>7
ataggatcca aacccgttca g 21
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<211>25
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<220>
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<400>8
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<211>160
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>9
tcgagaatta attcgccttc ctatactggt catcaagatc ggggatctca gaaatgttgg60
agacggggag atgacgcagg aaaaaggtgc tttcccagtc gaggtggtcg atttctgagt120
cggcgttttc cagtgctttg ttggcgaact cggatccgcg 160
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>10
atggattcct ttccggttat cgaca 25
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>11
attccttcat cgccttccta20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>12
tagcggacgt accacaggta t 21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>13
gtaagcaagc ttctccttga t 21
<210>14
<211>1998
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1998)
<300>
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<309>2008-07-29
<400>14
tatagattat tagctttaag gatataataa tcattttatt atactaatct cttacaacaa60
attaatttca aaaactattc aagttaatta atatgataaa cctcattaaa aaaaatcttt120
tccattaggc gattaacaaa aatgacttaa cacgagttaa ttaatgtgat agtcaagttt180
atgtatgtgc ttaagctgac agtcgactgc tatattatct aaaccgaact caagataaaa240
ttaatttcct tcacagaatt tgactgccac gtttggcggc tgctgctgtc tgcgttgacc300
acgcattttt tatgcgtctg gattgtctca cgaagaacac acgaaatcta ctggggatac360
gtgtgtctgt tcctggttgc ttcctcggat tgggacccct acaagatggc agagcgaagc420
ttcgcccacc ataaataggg cccataaccc tctaattctc ttcatccatc cgagcggtaa480
tacactccca aagcttgcag caatactcgc tcctctctgt ccattaattt cttagttgac540
atggcgattc cggtcatcga tttctccaag ttggatggca aggaaagggc cgaaaccatg600
gcccggattg ccaatggatg cgaggaatgg ggattctttc aggtttgcca tacttcaccc660
cgctcctctc ctctgctttc atggctatgc tggtgtaaag gtgctatgtt cccgatgctc720
tgtatcgtct gctcgcagct ggtgaaccat gggattccgg tcgagctgct ggaacgcgtg780
aagaaggtca gctccgagtg ctataagttg agggaggagc gcttcaaggg atccaaaccc840
gttcagctgt tggacacact ggtgaaagaa ggcgatggtc aacgcttgga caacgtggac900
tgggaggacg tgttcgttct tcaagacgac aacgaatggc cgtccaaccc tccggacttc960
gagtagagtt cgcatgccgc tgctgtgctc gagttttagt tgctacgata gccacaaacc1020
cgatgacgat gtgatccgat gattgctctg cagggagacc atgaaggagt acagggaaga1080
aatcaggaag ctggcggaga aaatgatgga ggtaatggac gagaatctgg gcttcgaaaa1140
gggctgcatc aagaaagcat tctctgggga cggccagcac ccgcccttct tcggcaccaa1200
ggtgagccac tacccgccgt gcccgcgcct ggacctggtg aagggccttc gcgcccacac1260
cgacgccggc ggcgtcatcc tcctcttcca ggacgaccaa gtcggcggcc tccagatgct1320
caaggacggc cggtggatcg acgttcagcc tttggccgac gccatcgtca taaacaccgg1380
agaccagatc gaggtcctca gcaacggtcg ctacaagagc gcgtggcacc gggtgctcgc1440
caccagccac ggcaaccgcc gctccatcgc ttccttctac aacccctccc tgaaggcgac1500
catcgctcca gccgccggcg ccgccaccga ggaagctgcc cctcctgctc tgtacccaaa1560
gtttctgttc ggggactaca tggacgtgta cgcgaagcag aagtacgagc ccaaggaacc1620
gagatttgag gcagtcagag ctatttgagg atggagaagc tgcgaatcta ttgttggatt1680
ataggaggat ataattcatt gtactagttt ggtgtctcat gcatggatta cataattgca1740
aacatgatct gcatctgaat aatggctgct tgttctcagg acacgcagtc gtcaatctgt1800
aagtcggtgt tcagaataaa aaccaagtgc tatgtttcct cgtcacatct tctcgagttg1860
aattcaaagg atagaaaaaa gggaaaacat agttcccctt ttgcatcaag catcttacca1920
cgacagctag caaccatagt cggcaaggca acaacaatct taaggaaagg ctgtgacgaa1980
tgcttctggt aatacata 1998
<210>15
<211>1865
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<220>
<221>CDS
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<308>Genbank/AF030410
<309>2008-07-29
<400>15
tgaagatgga ggttttctga tgtccaaatg tgctcgtcga atggttagta ttttgttttc60
acaagagaaa ctaatatcat tatatggtgt tctttcgttg tcactcgctt aatttaatta120
tatatctacc gtgaaacttg agaatataat ttcccccatg gctgttacca tcagataagc180
gtgactcact ttactacgtt aagtcttccg atatgccatc gtctcgtatg gcatcggtgc240
tggtggctgt tcgtgagtta agagtcccac gtttggcggc tgctgctgtc tgcgttgacc300
acgcattttt tatgcgtctg gattgtctca cgaagaacac acgaaatcta ctggggatac360
gtgtgtctgt tcctggttgc ttcctcggat tgggacccct acaagatggc agagcgaagc420
ttcgcccacc ataaataggg cccataaccc tctaattctc ttcatccatc cgagcggtaa480
tacactccca aagcttgcag caatactcgc tcctctctgt ccattaattt cttagttgac540
atggcgattc cggtcatcga tttctccaag ttggatggca aggaaagggc cgaaaccatg600
gcccggattg ccaatggatg cgaggaatgg ggattctttc aggtttgcca tacttcaccc660
cgctcctctc ctctgctttc atggctatgc tggtgtaaag gtgctatgtt cccgatgctc720
tgtatcgtct gctcgcagct ggtgaaccat gggattccgg tcgagctgct ggaacgcgtg780
aagaaggtca gctccgagtg ctataagttg agggaggagc gcttcgaggg atccaaaccc840
gttcagctgt tggacacact ggtgaaagaa ggcgatggtc aacgcttgga caacgtggac900
tgggaggacg tgttcgttct tcaagacgac aacgaatggc cgtccaaccc tccggacttc960
gagtagagtt cgcatgccgc tgctgtgctc gagttttagt tgctacgata gccacaaacc1020
cgatgacgat gtgatccgat gattgctctg cagggagacc atgaaggagt acagggaaga1080
aatcaggaag ctggcggaga aaatgatgga ggtaatggac gagaatctgg gcttcgaaaa1140
gggctgcatc aagaaagcat tctctgggga cggccagcac ccgcccttct tcggcaccaa1200
ggtgagccac tacccgccgt gcccgcgcct ggacctggtg aagggccttc gcgcccacac1260
cgacgccggc ggcgtcatcc tcctcttcca ggacgaccaa gtcggcggcc tccagatgct1320
caaggacggc cggtggatcg acgttcagcc tttggccgac gccatcgtca taaacaccgg1380
agaccagatc gaggtcctca gcaacggtcg ctacaagagc gcgtggcacc gggtgctcgc1440
caccagccac ggcaaccgcc gctccatcgc ttccttctac aacccctccc tgaaggcgac 1500
catcgctcca gccgccggcg ccgccaccga ggaagctgcc cctcctgctc tgtacccaaa 1560
gtttctgttc ggggactaca tggacgtgta cgcgaagcag aagtacgagc ccaaggaacc 1620
gagatttgag gcagtcagag ctatttgagg atggagaagc tgcgaatcta ttgttggatt 1680
ataggaggat ataattcatt gtactagttt ggtgtctcat gcatggatta cataattgca 1740
aacatgatct gcatctgaat aatggctgct tgttctcagg acacgcagtc gtcaatctgt 1800
aagtcggtgt tcagaataaa aaccaagtgc tatgtttcct cgtcacatct tctcgagttg 1860
aattc 1865
<210>16
<211>3718
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3718)
<300>
<308>Genbank/U86045
<309>2003-10-17
<400>16
aagcttcttt cacgctactg tagtgtctct gttgacaaaa ggttctttgg cattaggaag 60
atgtagagct tgacttctag tttgggagtt tgtgccctgg tacaggaatc ttctcactgt 120
ggtggtgaac cagtgagtga agtcgatgtt aaatgctacc gtcgacagtg tgatcgtgtg 180
tctcaagtgg gtttaacttg atgattcgag ctggcttgct gcacttggtt ttcttacagt 240
acgtgtgtgt ctcacagaca taaacatgac tctgttgaca acagggtgaa ttggcatcat 300
catcctttac ctgtccctga tttgagctgt agtgctgcgc tcagccagcg ttttatcgaa 360
gaagataaac atgcgtgagc ctacatgcac caaagcttgc cggcaagtca tgcatagctg 420
caaacatgtg acaggcaccg aaccaacaat tgaagaagat acgataaaca tgcgtgagcc 480
tacatgcacc aaagcttgcc gacaagtcat gtttgggtgc acaatgtgtc ctcatcttac 540
ttgcatatct gctgttgcac aacagcagat tgcatggagg tgtgttttcc ggcaatgcaa 600
tctttgatgt tggttctctt ttctctcttc ttgcattgtt tatagctctg tttcttgtgc 660
tcttctttta cgtagattca tagcgtagct taagttgtta tagattacct gttttactgg 720
gcaaacttgt gcaacccagg aatattccca tgtgcatctt cttcctgttt tcctctgtca 780
aactgttctg ttcatgatga ggcagcaccg aatctaagag aaatatccta atgttgattg 840
atttaacctc ataaaacttg aagcagaata tgcttgccgc tttcatgtga tcaattgaat 900
tgtttgcttg cttcacgaga acaccacatt ctgaacccat tgctttcttg tggccaccaa 960
ccggagaagg gagtctatat aactagccga gcgaggattt tcccatgacc tgttcatctc 1020
acgtagagat ggtgatttgg ttatagttat agcgatctat gatcgaagaa tgagaaaata1080
cccagataac ggagatccat gcgtcaccag atggaacctc ggccgagtgc ggccgagtga1140
cactgtttgc acaccggata cttcatgttc acggcaatgg ccgacatgcc gaacagccat1200
cgagcgttga atgtaaggca ggaatggccc atttctcaca tacgagaggg atacgagtgg1260
aaagggcgct ctaatgagct gtgaatcgaa acaatttcta cctatcgatc cctgttcttt1320
tgatatgaag tatagccaac aggtcaagag aagacgagta cacacgcatc gccgatgctg1380
tgacgttact ttctgaggtt ggcaatttgt cactacaatc caagcggaag ccatgcacgc1440
gagcgtcgcc atggaagaac tcaacaacat gatgccttcc cgggtctcct caaaggggag1500
agaccgatgg aagcagccaa acttggtccc cgatcgtgat gggacgcgag aggtggaagc1560
aaggagggtg gagaaccagg ccaaaggtgg tggggctgag agatggccaa ctgggtcacc1620
ttatggaatc ggctccgtta cgtcttccac tgctgttgct ctcgtcgata gatccttctc1680
caactttgct tcttcactca tttcgtccct cgacgtcaag aacgcctata aattgcctgg1740
taatcagcag cacctagcac actccagata gaaagcacaa gtgcaatcag ggaagaaaga1800
gcgtgtcatg gattcctttc cggttatcga catggagaag cttttgggaa gggagagagg1860
agcagccatg gagatcctcc gagatgcttg cgagaaatgg ggcttctttg aggtgctgaa1920
gcatacataa ctggttttgc ttctttgaac tatatatatt gctaaaaatg tactatttgc1980
gcatgcaatc tgtgtgtaga ttttaaacca tggcatctca cattacctca tggatgaagt2040
ggagaaggtg aacaaagaac agtacaacaa atgcagggag caaaagttca acgagttcgc2100
caacaaagca ctggaaaacg ccgactcaga aatcgatcac ctcgactggg aaagcacctt2160
tttcctgcgt catctccccg tctccaacat ttctgagatc cccgatcttg atgaccagta2220
taggttgcac gatctgatca tgatgtcatc ttctagcctt gtcttttcac cttgctcatc2280
gtttcgtttc ttgggacgat gactgcgtgc aggaaggcga tgaaggaatt tgctgcagcg2340
atagagaagc tggcagagcg gctgctcgac ttgctgggtg agaacctgga gctggagaag2400
gggtacctga agaaagcctt ctctaatgga tccaaggggc caacctttgg gaccaaggtc2460
agcagctacc cgccatgccc gcgcccggac ctggtgaagg gcctgagggc gcacaccgac2520
gccggaggca tcatcttgct cttccaggac gaccaggtca gcggcctgca gttcctcaag2580
gacggcgagt ggctggacgt gccccccatg cgccacgcca tcgtcgtcaa cctcggcgac2640
cagctcgagg tttgggtcct ctttgctctc gtttccgctg cccgtcgtct gtgatgttga2700
atgcaacgag gtctgcaggt aatcaccaat ggcaagtaca agagcgtggt gcaccgcgtg2760
gtggctcaga ctgatggcaa caggatgtcg attgcctcct tctacaaccc cgggagcgac2820
gctgtgatct tcccggcccc cgctcttgtg gagaaggaag cagaggagaa gaaggaggtc2880
tatccgaggt tcgtgttcga ggattacatg aagctctacg tcgggcataa gttccaggcc2940
aaggagccaa gattcgaagc catgaaagcc atggaagcag ttgccaccca cccaatcgct3000
acctcttaag tgacagcccc caagttagtg catgtcgctg tacttcgcgt taggaagctg3060
tcgtgtatgt ctatgcaacc cgatggaagc gtggtatgta cgtgtttgag ccttttctaa3120
tgaagcaagt catattatat atatatatat atatatatat atatataaat aattactctt3180
caaaattttc ttgaattttc tcttttgtta atctttttat cccaatattt gataggaatc3240
caaagattaa gaaaaaagag tatggtaatt aattagggat catatatact gttttaatca3300
agaaaatttc cagatttctg gattagtggc caaccttaag gggattagta ctaaaccgcc3360
catctttacc tatctaaaca cagcctgccg gaggagtcga agaactacaa aaccctaaac3420
cttgactact actcctcttc cttccagaat catggattct tctcctccct cgcatgccag3480
atccgatcaa gattcgctac cgaccgcctc cgcagctccg gaccagacga tcgcggacgg 3540
gggaacaacg gtggcggcgg acgacggagg agaggagaag aagggagaag cgaatggagg 3600
aagcgaagta gaggaggagt gcggtttctg cctcttcatg aagggcggcg ggtgcaagga 3660
tgcctttgtc gcgtgggaga aatgtatgca ggaagccgag aagcgcgacg aggacatc3718
<210>17
<211>104
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>17
aggtttgcca tcttcacccc gctcctctcc tctgctttca tggctatgct ggtgtaaagg60
tactatgttc ccgatgctct gtatcgtcgc tcgcagctgt cgac 104
<210>18
<211>137
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>18
gccttcctat actggtcatc aagatcgggg atctcagaaa tgttggagac ggggagatga 60
cgcaggaaaa aggtgctttc ccagtcgagg tggtcgattt ctgagtcggc gttttccagt 120
gctttgttgg cgaactc 137
<210>19
<211>137
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>19
gagttcgcca acaaagcact ggaaaacgcc gactcagaaa tcgaccacct cgactgggaa 60
agcacctttt tcctgcgtca tctccccgtc tccaacattt ctgagatccc cgatcttgat 120
gaccagtata ggaaggc 137
<210>20
<211>134
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>20
gtctcctcga agtccggagg gttggacggc cattcgttgt cgtctcgaag aacgaacacg 60
tcctcccagt ccacgttgtc caagcgttga ccatcgcctt ctttcaccag tgtgtccaac 120
agctgaacgg gttt134
<210>21
<211>134
<212>DNA
<213>香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400>21
aaacccgttc agctgttgga cacactggtg aaagaaggcg atggtcaacg cttggacaac 60
gtggactggg aggacgtgtt cgttcttcga gacgacaacg aatggccgtc caaccctccg 120
gacttcgagg agac13权利要求
1.一种利用干扰性RNA以延长香蕉保鲜期的组成物，其特征在于所述组成物包含至少一种干扰性RNA、基因转殖表达载体及药学上可接受的载剂； 其中该干扰性RNA连接于该基因转殖表达载体启动子的3’端，依序以反义链-内含子-正义链的香蕉基因序列构建于基因转殖表达载体，该干扰性RNA通过抑制香蕉中与乙烯生物合成相关酶的mRNA表达。
2.如权利要求1所述的组成物，其特征在于所述干扰性RNA具有如SEQ ID No1的序列，可于香蕉内用以抑制香蕉ACC氧化酶-1A及香蕉ACC氧化酶-1B的mRNA表达，进而降低乙烯的生物合成量。
3.如权利要求1所述的组成物，其特征在于所述干扰性RNA具有如SEQ ID No2的序列，可于香蕉内用以抑制香蕉ACC氧化酶-2的mRNA表达，进而降低乙烯的生物合成量。
4.如权利要求2所述的组成物，其特征在于所述干扰性RNA的序列对应于香蕉ACC氧化酶-1A及香蕉ACC氧化酶-1B的序列，具有至少80％的序列互补性，或是至少90％的序列同一性。
5.如权利要求3所述的组成物，其特征在于所述干扰性RNA的序列对应于香蕉ACC氧化酶-2的序列，具有至少80％的序列互补性，或是至少90％的序列同一性。
6.一种香蕉ACC氧化酶控制组合物，其特征在于包含
干扰性RNA；以及
基因转殖表达载体；
其中该干扰性RNA连接于该基因转殖表达载体启动子的3’端，依序以反义链-内含子-正义链的香蕉基因序列构建于基因转殖表达载体，该启动子可于含有香蕉ACC氧化酶控制组合物的香蕉内，启动该干扰性RNA的转录作用。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于所述干扰性RNA具有如SEQ ID No1的序列，可于香蕉内用以抑制香蕉ACC氧化酶-1A及香蕉ACC氧化酶-1B的mRNA表达，进而降低乙烯的生物合成量。
8.如权利要求6所述的组合物，其特征在于所述干扰性RNA具有如SEQ ID No2的序列，可于香蕉内用以抑制香蕉ACC氧化酶-2的mRNA表达，进而降低乙烯的生物合成量。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于所述干扰性RNA的序列对应于香蕉ACC氧化酶-1A及香蕉ACC氧化酶-1B的序列，具有至少80％的序列互补性，或是至少90％的序列同一性。
10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于所述干扰性RNA的序列对应于香蕉ACC氧化酶-2的序列，具有至少80％的序列互补性，或是至少90％的序列同一性。
11.一种经转殖作用而含有如权利要求6所述的香蕉ACC氧化酶控制组合物的香蕉的部份器官、组织或细胞。
12.一种香蕉的转殖基因方法，其特征在于所述转殖方法包含步骤如下
步骤一愈伤组织的诱导
取香蕉的雄花序置于诱导培养基以诱导愈伤组织的生成；
步骤二悬浮细胞建立
取步骤一的愈伤组织细胞，以悬浮培养基将愈伤组织细胞悬浮培养，以建立均质化悬浮细胞；
步骤三共培养转殖
取适量的愈伤组织细胞或悬浮培养细胞，与转化后农杆菌混合，震荡共培养后，再静置于25℃共培养2-4天；
步骤四 转殖后筛选
静置共培养2-4天后，将转殖共培养后的细胞置于固态转殖后筛选培养基，进行转殖植株的筛选；
步骤五分化体胚
以固态转殖后筛选培养基培养两个月后，更换至再生培养基继续培养，至细胞形成体胚；
步骤六诱导丛生芽
待细胞形成体胚后，将体胚细胞移置诱导丛生芽培养基，诱导体胚萌发丛生芽，再生成为幼苗；
步骤七诱导根
待幼苗长至适当大小，再移至诱导根培养基以诱导其发根，促使植株长大。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于步骤三所述的共培养转殖的方式包括农杆菌媒介法、基因重组病毒感染法、跳跃子载体转殖法、基因枪转殖法、电穿孔法、显微注射法、花粉管法、脂质体媒介转殖法、超音波媒介转殖法、碳化硅纤维媒介转殖法、电泳法、雷射微光束、聚乙烯二醇、磷酸钙转殖法或DEAE-dextran转殖法。
14.一种香蕉的转殖基因方法，其特征在于所述转殖方法包含步骤如下
步骤一诱导体胚
将果手原体或顶端分生组织先置于诱导培养基以诱导形成体胚细胞；
步骤二 共培养转殖
取步骤一的体胚细胞与转化后农杆菌及诱导培养基进行共培养转殖处理；
步骤三转殖后筛选
共培养后，将转殖体移至含适当抗生素的诱导培养基进行转殖后筛选；
步骤四培养成株
将筛选后的转殖体移至含抗生素的诱导培养基，于转殖处理后约六至八个月即可得到出瓶的转殖植株。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于步骤二所述的共培养转殖的方式包括农杆菌媒介法、基因重组病毒感染法、跳跃子载体转殖法、基因枪转殖法、电穿孔法、显微注射法、花粉管法、脂质体媒介转殖法、超音波媒介转殖法、碳化硅纤维媒介转殖法、电泳法、雷射微光束、聚乙烯二醇、磷酸钙转殖法或DEAE-dextran转殖法。
16.一种利用干扰性RNA以延长香蕉保鲜期的方法，其特征在于所述方法是通过如权利要求12所述的基因转殖方法，将如权利要求6所述的香蕉ACC氧化酶控制组合物转殖至由香蕉雄花序所诱导的愈伤组织中，培养以产生含有如权利要求6所述的香蕉ACC氧化酶控制组合物的转殖香蕉或转殖香蕉的部份器官、组织或细胞。
17.一种利用干扰性RNA以延长香蕉保鲜期的方法，其特征在于所述方法是通过如权利要求14所述的基因转殖方法，将如权利要求6所述的香蕉ACC氧化酶控制组合物转殖至由香蕉果手原体或顶端分生组织所诱导的体胚细胞中，培养以产生含有如权利要求6所述的香蕉ACC氧化酶控制组合物的转殖香蕉或转殖香蕉的部份器官、组织或细胞。
全文摘要
本发明公开了一种应用基因工程技术延长香蕉保鲜期的方法、组成物及其应用，该方法通过新颖的香蕉转殖基因方法将香蕉ACC氧化酶控制组合物转殖于香蕉内，其中该组合物包含至少一种干扰性RNA、基因转殖表达载体及药学上可接受载剂，该干扰性RNA用以抑制/降低香蕉ACC氧化酶的mRNA表达，进而抑制香蕉的乙烯生物合成，以此延缓香蕉的后熟现象，因此，可延长香蕉的保鲜期。
文档编号C12N15/82GK101633935SQ20091004153
公开日2010年1月27日 申请日期2009年7月30日 优先权日2009年7月30日
发明者黄鹏林, 杜宜殷, 廖育辰, 林宜佑, 李盛新, 黄暐芬 申请人:黄鹏林