专利名称：一种鸡肉质多基因聚合检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于动物育种学、发育生物学和细胞生物学领域。
背景技术：
目前，我国在研究鸡肉质相关基因多应用PCR检测技术的方法，具有操作简单、特 异性高、重复性好等优点，而且可以直接确定突变的部位和性质，因此在多态性检测中应 用很广。而多位点序列分型(multilocussequencetypir^MLST)是一种通过直接测定多个 管家基因的核苷酸序列来发现基因变异的分型方法，是在普通PCR的基础上加以改进，具 有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样品，所以一经提出，即 得到众多研究者的青睐，并且发展迅速，在生命科学的各个领域，多位点序列分型已经成 为一项成熟而重要的研究手段。鸡肉质相关这方面的研究国内还未见有报道。针对我国优质鸡育种中肉品质性状表型选择遗传进展慢、育种效率低等问题，在已有研究的基础上，以影响肌苷酸含量的候选基因(GARS-AIRS-GART)和影响肌内脂肪含量 的候选基因(A-FABP、Ex-FABP)为研究对象，从中选择了相关基因研制出本试剂盒进行多基 因聚合检测分析，本试剂盒的原理即是采用多位点序列分型技术，其可以加快优质鸡的育 种进程，为其专门化品系和配套系的选育提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的是研究出一个可以对多个影响鸡肉质的基因进行多基因聚合的试剂盒。本发明所说的鸡肉质多基因聚合检测试剂盒，包括以下成份PCR缓冲液、dNTPs、 Taq酶、A-FABP-3基因引物、Εχ-FABP基因引物和GARS-AIRS-GART基因引物，其中
A-FABP-3 基因引物是F 5，CGGATAAGGAGGGCAGAG3， R 5’AGGTTCCCATCCACCACT3， Ex-FABP 基因引物F 5，CGTGACAGGGCATTCTT3， R 5’TGGTGTTGTGTGGGTAGTT3’
GARS-AIRS-GART 基因引物是F 5，ACAGTTGCCAGTCTGATTA3， R 5’CATCGCCAGAGTTAGAAGT3’。本发明的试剂盒通过直接测定多个管家基因的核苷酸序列来确定基因变异的分 型，是在普通PCR的基础上加以改进，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节 省珍贵的实验样品，从肌苷酸含量的候选基因(GARS-AIRS-GART)和影响肌内脂肪含量的候 选基因(A-FABP、Ex-FABP)中选择了相关基因，进行多基因聚合检测研究，进行PCR扩增，以 及结果分析。
图1 是Ex-FABP基因的基因型。
图2 是A-FABP基因的基因型。图3 是GARS-AIRS-GART基因的基因型。
具体实施例方式试剂盒内容及时配制 自备材料
1、蒸馏水
2、加样器:10ul、100ul、200ul
3、震荡仪、PCR仪及电泳槽等。 样品要求
1、样品采集后尽早进行DNA提取，提取可按常规酚/氯仿法进行，提取后若不能马上进 行试验，可将DNA样存放于4°C或-20°C保存，但应避免反复冻融。2、DNA质量要求DNA呈透明状，粘稠度好。提取DNA时，血样至分离白细胞之间隔 时间在室温下放置不超过2h，4°C放置不超过5h，以防白细胞自溶。操作步骤
1、先将引物离心，用足量的蒸馏水将引物按附录中说明稀释，充分上下震荡5-10分 钟，常温下过夜使其充分溶解，-20°C保存备用。2、使用前，将试剂盒从_20°C环境中取出(Taq酶除外)，应在室温下平衡15_30分 钟至溶解后方可使用。3、建立PCR扩增体系
(1)PCR扩增体系
PCR 扩增反应体系为 10XPCR 缓冲液 2 μ L，IOmmol/LdNTPs2 μ L，20 μ mo 1/LNE-F 引物 1 μ L，20 μ mol/LNE-R/R 引物 1 μ L, Taq 酶 IU，15ng/ μ LDNA 模板 1 μ L,总体积为 25 μ L0 反 应条件94°C预变性5min，94°C变性Imin，58°C退火45s，72°C延伸Imin，共35个循环；最后 72°C 延伸 5min。(2)将15ng/ μ LDNA模板1 μ L各自点入试剂盒孔中，放入PCR仪。4、PCR产物用10%聚丙烯酰胺电泳检测产物。5 μ LPCR产物中加入10 μ L上样缓 冲液(98% 甲酰胺、0. 025% 溴酚蓝、0. 025% 二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8. 0)、2% 甘油)。剩 余PCR产物4°C保存备用。5、98°C变性15min，在结束程序之前迅速将其放入冰盒，然后-20°C冰浴lOmin， 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr Bi8=49:1)电泳，120V电泳10 12小时。6、银染并判型。7、三种基因的判型原则如下
(1 )Ex-FABP基因在外显子均没有检测到SNP突变，在内含子3检测到C3654T、C3699T、 A3700G3个SNP突变，共6种基因型，将Ex_FABP_3纯合型分别定义为AA、BB和CC型，杂合 型定义为AB、AC和BC型；
(2)A-FABP基因外显子3 (A-FABP-3)检测到A1763G的SNP突变，将其的纯和型分别 定义为AA、BB型，杂合型定义为AB ；
(3)GARS-AIRS-GART基因的第4外显子中的9839处的C-A突变(GARS3)，为非同义突变，导致了甘氨酞胺核普酸合成酶氨基酸序列的第173处发生氨基酸的变异由天冬氨酸 (AsP)突变为谷氨酸(Glu)，将其纯和型分别定义为AA、CC型，杂合型定义为AC。可根据以上原则结合两个基因PCR图共同判型。图1是Ex-FABP基因的基因型， 其中 AA:3, 6，8，9，11;BB:1;CC:12;AB:2, 10;AC:5，7;BC:4。图 2 是 A-FABP 基因的基因型， 其中 AA:5;BB:1，3;CC:12;AB:2，4，6。图 3 是图 3 GARS-AIRS-GART 基因的基因型，其中 AA:3，4，5，6;BB:1;CC:7;AB:2;AC:8。保存条件 试剂盒保存-20°C。 附录
1、A-FABP-3、Ex-FABP-3、GARS-AIRS-GART三个基因的引物序列分别为
2、引物稀释说明 (l)A-FABP-3基因引物
上游每OD的引物加500ul的缓冲液配成IOOuM的贮存液； 下游每OD的引物加620ul的缓冲液配成IOOuM的贮存液。(2 ) Ex-FABP-3 基因引物
上游每OD的引物加620ul的缓冲液配成IOOuM的贮存液； 下游每OD的引物加540ul的缓冲液配成IOOuM的贮存液。(3) GARS-AIRS-GART 基因引物
上游每OD的引物加54ul的缓冲液配成IOOuM的贮存液； 下游每OD的引物加52ul的缓冲液配成IOOuM的贮存液。
权利要求
一种鸡肉质多基因聚合检测试剂盒，包括以下成份PCR缓冲液、dNTPs、 Taq 酶、A-FABP-3基因引物、Ex-FABP基因引物和GARS-AIRS-GART基因引物，其中A-FABP-3基因引物是F 5'CGGATAAGGAGGGCAGAG3’R 5'AGGTTCCCATCCACCACT3’Ex-FABP基因引物F 5'CGTGACAGGGCATTCTT 3’R 5' TGGTGTTGTGTGGGTAGTT3’GARS-AIRS-GART基因引物是F 5' ACAGTTGCCAGTCTGATTA3’R 5' CATCGCCAGAGTTAGAAGT3’。
全文摘要
本发明公开了一种鸡肉质多基因聚合检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、A-FABP-3基因引物、Ex-FABP基因引物和GARS-AIRS-GART基因引物。本发明试剂盒通过直接测定多个管家基因的核苷酸序列来发现基因变异的分型方法，是在普通PCR的基础上加以改进，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点,特别是节省珍贵的实验样品，从肌苷酸含量的候选基因和影响肌内脂肪含量的候选基因中选择了相关基因，用本试剂盒进行多基因聚合检测研究。
文档编号C12Q1/68GK101838704SQ20101020536
公开日2010年9月22日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者刘艳, 常国斌, 李芹, 栾德琴, 胡国顺, 陈国宏, 陈蓉 申请人:扬州大学