专利名称：一种新型降解农作物秸秆的复合菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物应用技术领域，涉及微生物复合菌剂生产农用肥料技术，特别 用于秸秆堆腐还田的一种降解农作物秸秆的真菌复合菌剂。
背景技术：
农作物秸秆是农作物生产中的一种富含有效成分的可再生生物资源和潜在的 非竞争资源。农作物光合作用的产物有一半以上存在于秸秆中，除了大部分的碳元素 外，含有的有机质有纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质、脂肪和灰分等，矿物质元素有 氮(0. 5 % -1. 5 % )、磷(0. 1 % -0. 5 % )、钾(0. 74 % -2. 4 % )、镁(0. 01 % -0. 4 % )、钙 (0.2%-0.5%)、硅(1% -5% )和硫(0. 11%-0. 35%)等，是具有多种用途的可再生生物 资源。农作物秸秆不仅富含有效成分，而且产量和总量很大，1公斤水稻或1公斤小麦可产 生1. 5公斤秸秆，1公斤玉米可产生4公斤玉米秸秆，我国每年各类农作物秸秆总产量达7 亿吨以上，占世界总秸秆量的30%左右，其中稻草秸秆约2. 3亿吨，玉米秸秆约2. 2亿吨， 花生和薯类藤蔓、甜菜叶等秸秆约1.0亿吨。据联合国环境规划署(UNEP)统计，全球每年 农作物秸秆产量近20亿吨，大部分都没得到有效利用，在我国，农作物秸秆约有不足10% 用做饲料，应用技术处理利用的秸秆不足3.0%，其余大多数秸秆采用焚烧处理，全国每年 约有2/3的秸秆被直接焚烧掉。秸秆在田间焚烧时的高温可造成地表水分大量蒸发，破坏 土壤的抗旱保湿能力，土壤中的有益虫体和微生物的存活受损，从而影响土壤耕层生态环 境的良性循环，不仅如此，焚烧时的高温潜在诱发火灾的危险，产生的烟雾对公路、铁路以 至民航起降均有影响，同时秸秆焚烧后产生的C02、C0、S02、N02、N20等有害气体，会造成严重 的大气环境污染。20世纪90年代以来，随着农作物单产的大幅度提高，秸秆总量在迅速增 加，如何把农作物秸秆这一丰富的、可再生的生物资源充分利用起来，已是全球所共同面临 的农作物生产中的一个主要问题。在农作物秸秆资源利用的诸多研究领域中，秸秆堆腐还田的技术研究占有重要的 一席之地。秸秆堆腐的方法主要有物理、化学和生物三大类，其中以应用微生物学方法腐 解效果最好，也就是我们常说的秸秆微生物堆腐方法，这种方法是利用微生物分解作用，促 使农作物秸秆发酵腐熟，使秸秆中所含的有机质及氮、磷、钾等元素成为植物生长所需的营 养，并繁殖大量的有益菌微生物，成为优良的绿色堆腐有机肥。利用微生物堆腐方法使秸 秆还田，不仅可以提供植物生长所需的营养和有益菌微生物，而且可提高土壤水分的保蓄 能力，改善土壤性状，增加土壤团粒结构，促进土壤有机质及氮、磷、钾等含量的增加，改善 植株性状。有资料显示，每亩还田玉米秸秆500kg，等于施用土杂肥2500kg、碳铵11. 7kg、 过磷酸钙6. 2kg、硫酸钾4. 75kg，一年后土壤有机质含量相对增加0. 05% 0. 23%、全磷 平均增加0. 03%、速效钾增加31. 2mg/kg、土壤容重降低0. 03 0. 16g/cm3、土壤孔隙度增 加2% -4%。多年持续秸秆还田，可提高磷肥利用率、补充钾肥不足，地力可提高0.5%
个等级，平均增产幅度10%以上。然而，多年来农作物秸秆堆腐还田并没有得到充分的 应用，其中最关键的原因是不管是哪一种方法都存在秸秆降解腐熟时间较长和很难彻底的
3问题。目前，秸秆微生物降解的许多研究和投入应用的微生物菌剂大都以秸秆纤维素的降 解为主要目标。分解菌和酶的研究集中在纤维素酶菌株的筛选，如木酶、青酶、曲酶及白腐 真菌纤维素酶等，菌剂产品被认定的有腐杆灵，CM菌、催腐剂等。但是，农作物秸秆中纤维 素、半纤维素和木质素均占有较大比例，其纤维素占40 %，半纤维素和木质素各占20 %左 右，(Tengerdy R P, Szakacs G. Bioconversionof Iignnocellulose in solid substrate fermentation [J], Biochemical Engineering, 2003,13 (2-3) : 167—179)。而且，秸秆中纤 维素结构复杂，它与木质素结合形成难以水解的“木质纤维素”，使得微生物分解的纤维 素酶无法直接接触纤维素，在堆肥物料中纤维素常与一些更难分解的物质相复合，难以被 大多数微生物转化利用，加上半纤维素与木质素的紧密相连，单一微生物的降解效果就更 加不理想。(杭怡琼等“白腐真菌对稻草秸秆的降解及有关酶活性的变化”-《菌物系统》 2001. 20)。目前分解木质素和纤维素的微生物以及酶的研究多集中在依靠传统的“酶活” 筛选，制取的酶广泛应用于洗涤、印染和食品加工等，一直未能解决木质纤维素的自然快速 分解，用于結秆堆腐的更少(Zhang YHP, Himmel ME, MielenzJR. Outlook for cellu-lase improvement :Screening and selection strategies. Biotechnology Advances,2006, 24(5) 452-481) 0近年来人们开始注意菌群和复合菌剂的研究，但很多仅局限于实验室试 验，而且在现有技术中，大部分只针对木质素和纤维素中的一种进行筛选用来降解秸秆，造 成秸秆降解中或是纤维素降解率高而木质素降解率低，或是木质素降解率高而纤维素降解 率低，远远不能满足农作物秸秆堆腐的实际需求。充分利用自然界多种微生物的协同关系， 筛选出高效稳定菌株复合系，以达到农作物秸秆的纤维素、半纤维素和木质素在堆腐过程 中能同步、快速降解的目的，是人们的共同目标。
发明内容
本发明的目的是利用微生物之间的协同关系，筛选出适用于农作物秸秆堆腐的高 效降解秸秆木质素和纤维素的真菌复合菌剂。本发明是将土壤和植物体样本加入富集培养基中，经分离纯化得到不同的真菌菌 株，从中筛选出高产纤维素酶或木质素酶的真菌菌株，通过优化组合配比得到高效降解农 作物秸秆木质素的毛木耳 Auricularia polytricha 916-1 和香菇 Lentinula Iateritia 939，以及高效降解农作物秸秆纤维素的球孢枝孢菌Cladosporium sphaerospermum GC2-2，组配成一种新型降解农作物秸秆的真菌复合菌剂。真菌复合菌剂成分体积配比为球 孢枝孢菌20% 25%、毛木耳20% 25%、香菇50% 60%。本发明通过以下技术路线完成1、菌株的收集、分离纯化从土壤和植物体上采集样品，保湿运回实验室，将样品置于无菌水中30分钟后， 加入真菌富集培养基(蛋白胨 log、CMC-Na 10g、K2HPO4Ig, Na2C035g、MgSO4 · 7H20 0. lg、 FeSO4 · 7H20 0. 015g、MnSO4O. 05mg、酵母膏IOg, pH 6. 0)中富集培养，得到混合菌液。采用逐级梯度稀释的方法至10_6，取10_3_10_5于土豆培养基(去皮马铃薯200g，蔗 糖20g，琼脂15-20g，pH自然)上，30°C条件下培养4-5d，得到不同的真菌菌落，进一步分离 纯化获得纯培养，共获得15株真菌菌株。2、菌株的筛选
采用刚果红纤维素培养基(K2HPO4O. 50g、MgSO4O. 25g、纤维素粉1. 88g、刚果红 0. 20g、琼脂14. 00g、明胶2. 00g、土壤浸汁100ml、水900ml, ρΗ7· 0)筛选产纤维素酶的真 菌菌株，根据菌落在刚果红纤维素培养基产透明圈的大小挑选，产纤维素酶活高的真菌透 明圈大。然后将选出的真菌加入到菌株纯培养基(CMC-Na 10g、蛋白胨3.0g、KH2P044. 0g、 MgSO4 ·7Η20 0. 03g、水 1000ml，ρΗ 6)中摇床培养，28 30°C，180r/min，时间 3 4d，得到 菌液。吸取 4ml 菌液加入发酵培养基(CMC-Na 10g、(NH4) 28044g、KH2P042g、MgS04 ·7Η200. 5g、 蛋白胨10g、牛肉膏5g、水1000ml)培养48h，然后每24h采用滤纸酶活和CMC酶活的方法测 定一次纤维素酶活，共测6次。按上述方法反复三次，最终得到2株高产纤维素酶的真菌 一株为球孢枝孢菌Cladosporiumsphaerospermum GC2_2(简称球孢枝孢菌GC2-2，下同)、 另外一株为黑曲霉Aspergillus niger GC1-2 (简称黑曲霉GC1-2，下同)，其中球孢枝孢 菌GC2-2的基因序列已登入GenBank上，并得到登录号分别为HM347335。采用PDA-Bavendamm显色培养基(去皮马铃薯200g，蔗糖20g，0. 4mmol · Γ1 鞣酸，琼脂15_20g，ρΗ自然)筛选能产木质素酶的真菌菌株。能产木质素酶的真菌在 PDA-Bavendamm培养基上产棕褐色环，酶活活性越大产生得到褐色环越大。根据褐色环 的大小筛选，得到4株高产木质素酶的真菌。将挑选的真菌加入到菌株纯培养基(玉米 粉2%，麦麸2%，葡萄糖1%，酵母膏0.3%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸镁0. 1% )中摇床培 养，25-28°C，180r/min，时间5 6d，得到菌液，取4_6ml菌液加入到发酵培养基(去皮马 铃 200g, KH2P043g, MgSO4 · 7Η203· lg，酒石酸铵 5g，稻草粉(过 60 目)20g，微量元素 50ml, pH5. 0 (用H2SO4调))，培养30d，每隔两天采用木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶酶 活的方法测定木质素酶活，按上述方法反复三次，最终得到2株产木质素酶的真菌菌株，均 属于白腐菌，一株为毛木耳Auricularia polytricha916_l (简称毛木耳916-1，下同)，另 一株为香菇Lentinula Iateritia 939 (简称香菇939，下同)，其中毛木耳916-1和香菇 939的基因序列均已登入GenBank上，登录号分别为HM347336和HM347337。3、真菌复合菌剂配比球孢枝孢菌GC2-2和黑曲霉GC1-2分别加入到菌株纯培养基(CMC_Nal0g、蛋白胨 3. 0g、KH2P044. 0g、MgS04 ·7Η20 0. 03g、水 1000ml，pH 6)中摇床培养，28°C 30°C，180r/min， 时间3 4d，得到球孢枝孢菌GC2-2菌液和黑曲霉GC1-2菌液。毛木耳916-1和香菇939分别加入到菌株纯培养基(玉米粉2%，麦麸2%，葡萄 糖1%，酵母膏0.3%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸镁0. 1% )中摇床培养，25-28°C，180r/min， 时间5 6d，得到毛木耳916-1菌液和香菇939菌液。将上述4种菌液进行配比组合培养，按照不同组合处理将每组菌液充分混合均 勻，分别接入发酵产酶培养基(5%蛋白胨、0.5%纤维素、0.5% NaCUO. 2% CaC03、0. 酵 母粉、PH自然)中培养，每隔2天测定一次酶活，确定最佳的复合菌剂组成。4种菌液的9 组组合如表1.表1.配比组合表
权利要求
一种新型降解农作物秸秆的复合菌剂，其特征在于，所述的复合菌剂由球孢枝孢菌、毛木耳、香菇菌株配比获得，其中球孢枝孢菌∶毛木耳∶香菇的体积比为20％～25％∶20％～25％∶50％～60％。
2.权利要求1的新型降解农作物秸秆的复合菌剂，其特征在于，所述的毛木耳、香菇、 球孢枝孢菌分另1J为毛木耳 Auricularia polytricha 916-1,香 Lentinula Iateritia 939,球抱枝抱菌 Cladosporium sphaerospermum GC2-2。
3.权利要求2所述的新型降解农作物秸秆的复合菌剂，其特征在于，所述的毛木 耳、香菇、球孢枝孢菌为将土壤和植物体样本加入真菌富集培养基，经分离纯化筛选得 到的真菌菌株，真菌富集培养基的组成为蛋白胨10g、CMC-Na 10g、K2HPO4Ig, Na2C035g、 MgSO4 · 7Η200· lg、FeSO4 · 7Η20 0. 015g、MnSO4O. 05mg、酵母膏 IOg, pH 值为 6。
全文摘要
从土壤和植物体样本中分离纯化得到不同的真菌菌株，筛选出高产纤维素酶和木质素酶的真菌菌株，通过优化组合配比得到高效降解秸秆木质素或纤维素的球孢枝孢菌、毛木耳和香菇，组配成真菌复合菌剂。用于农作物秸秆堆腐，不需要高温条件，10-15天即可使农作物秸秆达到腐熟。
文档编号C12N1/00GK101948753SQ201010264890
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘莹莹, 周伏忠, 李冠杰, 王继雯, 甄静, 谢宝恩, 陈国参 申请人:河南省科学院生物研究所有限责任公司