新型乙酰辅酶a羧化酶的制作方法

专利名称：新型乙酰辅酶a羧化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型乙酰辅酶A羧化酶。
背景技术：
脂肪酸是构成磷脂质、三酰基甘油等脂质的重要成分，含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为高不饱和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，并已报道了各种生理活性(非专利文献1)。其中，花生四烯酸作为形成前列腺素、白三烯等的中间代谢物受到关注，已进行了大量的将其应用于功能性食品、医药品的原料的尝试。而且因为花生四烯酸在母乳中含有， 对婴儿的发育，特别是胎儿的身高、脑的发育很重要，所以作为婴儿发育的必要成分，从营养学的观点来看与DHA(二十二碳六烯酸)共同受到关注。虽然期待该高不饱和脂肪酸在各种领域中的应用，其中也包括了在动物体内不能合成的物质。因此，开发出了通过培养各种微生物来获得高不饱和脂肪酸的方法。并且，也进行了用植物生产高不饱和脂肪酸的尝试。在这种情况下，已知高不饱和脂肪酸例如作为三酰基甘油等储存脂质的构成成分，可在微生物的菌体内或植物种子中积累。在原核生物和真核生物中，虽然与新型脂肪酸合成、脂肪酸链延长相关的酶的分子结构不同，但酶反应的机理在任何类型的细胞中均相同。脂肪酸的生物合成以乙酰辅酶 A为起始物质，通过乙酰辅酶A羧化酶(E. C. 6. 4. 1. 2)的催化作用，由乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A。在脂肪酸合成酶(FAS)的作用下，经过乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A的缩合 还原·脱水·再还原的一系列反应脱去(X)2进行结合从而使碳原子数每次延长2个，合成各种饱和脂肪酸。此外，在脂肪酸链延长反应中，也是经过酰基辅酶A与丙二酰辅酶A的缩合·还原·脱水·再还原的一系列反应脱去CO2进行结合从而使碳原子数每次延长2个。乙酰辅酶A羧化酶(以后有时记为“ACC”)，到目前为止曾在几种生物中报道过。 哺乳类的ACC是典型的变构酶，具有被柠檬酸变构激活、受长链脂肪酰CoA酯的抑制、磷酸化而失活的性质。在菌类中，已对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ACC进行了充分的研究。酿酒酵母(S. cerevisiae)的ACC定位于细胞质和线粒体内，被各种ACCl及HFAl 基因编码。已知ACCl基因是必须基因，缺失后即会致死(非专利文献2)。由突变株的分析可知，ACCl基因与从核内运输加poly(A)的mRNA等有关(非专利文献3)。曾进行了在植物中使用ACC基因从而使种子中的油脂增加的试验(非专利文献 4)。例如已报道使拟南芥的ACC在菜籽中表达时，重组体的种子中每单位干燥重量的脂肪酸量增加，进而脂肪酸的组成也发生变化(非专利文献幻。但是，根据宿主生物本来具有的脂肪酸组成，而且根据导入的ACC基因的不同，脂肪酸组成如何发生变化也不同。另一方面，ACC的活性不仅在表达水平，而且在蛋白质水平上也受到各种调节(非专利文献3及 4)，在一系列的脂肪酸合成体系中与发挥作用的其他酶蛋白质的相互作用也成为问题。因此认为，为了获得所期望的脂肪酸组合物，需要与作为基因导入的宿主的生物相应的适当的ACC基因。对于作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)(以下有时记为 "M. alpina")的ACC基因，已公知来自CBS528. 72株的作为ACC同源物认为具有ACC活性的基因的部分序列(非专利文献6)。但是还未确认含有该序列的蛋白质具有ACC活性。此外，对于在Malpina CBS696. 70株中油脂的蓄积和乙酰辅酶A羧化酶活性进行了分析(非专利文献7)。现有技术文献非专利文献非专利文献1 Lipids, 39,1147(2004)非专利文献2 Giaever G, et al. Nature 418，387-91 (2002)3 0. Tehlivets et al. , Biochimica et Biophysica Acta, 1771, 255-270(2007)非专利文献4 Biosci. Biotechnol. Biochem.，68(6)，1175-1184，(2004)非专利文献5 Plant Physiol. 113,75-81 (1997)非专利文献6国际碱基序列数据库注册号AJ586915非专利文献7 Microbiology, 145,1911-1917 (1999)

发明内容
但是，认为到目前为止所报道的ACC基因在导入宿主细胞内进行表达时对于脂质代谢的影响并不充分。而且还存在由于宿主不同，对油脂、脂肪酸的蓄积量的增减效果不能充分发挥的课题。因此，需要鉴定出在导入宿主细胞内进行表达时可对宿主的脂质代谢产生影响的新型蛋白质。并且需要鉴定出可生产利用价值高的脂肪酸含量高的油脂的蛋白质。本发明的目的是提供通过在宿主细胞内表达，或者对宿主的脂质代谢产生影响， 或者可增加目标脂肪酸的含量，从而可生产有用的油脂的蛋白质及核酸。本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，首先进行脂质生产菌Malpina的 EST分析，从中提取出与已知ACC基因同一性高的序列。进而为了获得编码ACC的开放阅读框(ORF)的全长，进行cDNA文库筛选或通过PCR克隆全长cDNA。发明者将其导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞内以尝试产生脂肪酸组合物，成功克隆出与新型ACC相关的基因，该新型ACC可生成与以往ACC表达的宿主所产生的脂肪酸组合物相比不同的脂肪酸组合物，于是完成了本发明。即本发明如下所述。(1) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶 A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列。(2)根据⑴所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中的任一项，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 90%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列。(3) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (C)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有序列号1所示的碱基序列或其部分序列，(b)核酸，其含有编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列，(c)核酸，其含有序列号4所示的碱基序列或其部分序列。(4) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列。(5)根据(4)所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中的任一项，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2 X SSC、50°C的条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 90%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列。(6) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性。(7) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性。(8) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性。(9) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性。(10) 一种蛋白质，其特征在于，为由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
(11) 一种重组载体，其特征在于，含有(1) (5)中任一项所述的核酸。(12) 一种转化体，其特征在于，为被(11)所述的重组载体转换的转化体。(13) 一种脂肪酸组合物，其特征在于，为通过培养(1 所述的转化体而得到的脂肪酸组合物。(14)上述(1 所述的脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养(1 所述的转化体而得到的培养物中提取(1 所述的脂肪酸组合物。(15) 一种食品，其特征在于，含有(1 所述的脂肪酸组合物。(16) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列。(17) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性。此外，本发明还包括以下发明。(A) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个、优选1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下、优选在2X SSC、50°C的条件下杂交，且编码具有可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上、 优选有90%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性的蛋白质的碱基序列；
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(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 80%以上、优选有90%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下、优选在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性的蛋白质的碱基序列。(B) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1个或多个、优选1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有80 %以上、优选有90 %以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性。进而，还包括含有(A)中任一项所述的核酸的重组载体(C)、被该重组载体转化的转化体(D)、培养未被(C)的重组载体转化的的宿主而得到的培养物中本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成发生了变化的培养该转化体而得到的脂肪酸组合物(E)、以从培养(D)所述的转化体得到的培养物中提取脂肪酸组合物(E)为特征的该脂肪酸组合物(E)的制造方法(F)、以及含有该脂肪酸组合物(E)的食品(G)。发明效果本发明的ACC，因为能够使脂肪酸、储存脂质的生产能力提高，所以优选作为可提高微生物、植物中的高不饱和脂肪酸的生产率的酶。因此，因为能够提供具有所期望特性、 效果的脂质，所以作为可应用于食品、化妆品、医药品、肥皂等的酶而有用。


图IA表示来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列(序列号4)及由此导出的氨基酸序列(序列号2)。图IB表示来自M.alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列(序列号4)及由此导出的氨基酸序列(序列号2)。图IC表示来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列(序列号4)及由此导出的氨基酸序列(序列号2)。图ID表示来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列(序列号4)及由此导出的氨基酸序列(序列号2)。图2A为来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列与来自公知的 M. alpinaCBS528. 72株的ACC同源物的部分序列的核酸序列的比对图。图2B为来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列与来自公知的 M. alpinaCBS528. 72株的ACC同源物的部分序列的核酸序列的比对图。图2C为来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列与来自公知的 M. alpinaCBS528. 72株的ACC同源物的部分序列的核酸序列的比对图。图2D为来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列与来自公知的M. alpinaCBS528. 72株的ACC同源物的部分序列的核酸序列的比对图。图3A为由来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与由来自M. alpinaCBS528. 72株的ACCcDNA部分序列导出的氨基酸序列(序列号 25)的比对图。图;3B为由来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与由来自M. alpinaCBS528. 72株的ACCcDNA部分序列导出的氨基酸序列(序列号 25)的比对图。图3C为由来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与由来自M. alpinaCBS528. 72株的ACCcDNA部分序列导出的氨基酸序列(序列号 25)的比对图。图4A为由来自M.alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞质ACC的ACClp的氨基酸序列(序列号34)及同线粒体ACC的Hfalp的氨基酸序列(序列号35)的比对图。图4B为由来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevi siae)的细胞质ACC的Acclp的氨基酸序列(序列号34)及同线粒体ACC的Hfalp的氨基酸序列(序列号35)的比对图。图4C为由来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞质ACC的Acclp的氨基酸序列(序列号34)及同线粒体ACC的Hfalp的氨基酸序列(序列号35)的比对图。图4D为由来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞质ACC的Acclp的氨基酸序列(序列号34)及同线粒体ACC的Hfalp的氨基酸序列(序列号35)的比对图。图4E为由来自M. alpinalS-4株的ACC的cDNA全长序列导出的氨基酸序列(序列号2)与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞质ACC的Acclp的氨基酸序列(序列号34)及同线粒体ACC的Hfalp的氨基酸序列(序列号35)的比对图。图5为表示质粒pSDY-ACC的模式图。HisH4. Ip表示来M. alpina的组蛋白H4. 1 基因的启动子，trpCt表示来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因的终止子， ura5表示来自M. alpina的ura5基因、rDNA表示来自M. alpina的18S rDNA的一部分。模式图中的箭头(一)表示用于确认转化株的引物ACC-F7和引物trpCt-R的位置。图6表示M. alpina转化株的干燥菌体重量的经时变化。纵轴表示干燥菌体重量 (g/管)，横轴表示培养时间(天)。图7表示M. alpina转化株的脂肪酸生产量的经时变化。纵轴表示脂肪酸生产量 (Mg/L培养基)，横轴表示培养时间(天)。图8表示M. alpina转化株在培养第8天的脂肪酸组成，纵轴表示脂肪酸组成，横轴表示宿主细胞及各转化株。图中的图例分别表示以下含义，EPA 二十碳五烯酸；ARA 花生四烯酸；DGLA 二高γ -亚麻酸；GLA γ -亚麻酸；LA :亚油酸；OA 油酸；SA 硬脂酸；PA 棕榈酸。
具体实施方式
本发明涉及来自被孢霉(Mortierella)属的新型乙酰辅酶A羧化酶，其特征在于， 通过依赖于ATP的乙酰辅酶A的羧化来催化生成丙二酰辅酶A的反应。通过本发明的乙酰辅酶A羧化酶(以下有时记为“ACC”)由乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A的反应是生物合成脂肪酸的主要限速步骤。因此，ACC是负责供给脂肪酸合成中的重要的中间体丙二酰辅酶A的重要的酶。具体来说，ACC是催化以下反应的酶。式1
ATP+乙酰辅酶A+HC(VOADP+Pi+丙二酰辅酶A即通过依赖于ATP的乙酰辅酶A的羧化来催化生成丙二酰辅酶A的反应。该反应通过以下2个步骤进行。式2(1) BCCP*+HC0「+Mg2+-ATP — BCCP-C02>Mg2+-ADP+P i(生物素羧基转移酶)(2) BCCP-CO2-+ 乙酰辅酶 A — BCCP+ 丙二酰辅酶 A (羧基转移酶)BCCP* 生物素羧基载体蛋白通过该反应生成的丙二酰辅酶A成为新型脂肪酸合成反应、或者脂肪酸链延长反应的底物，生成各种脂肪酸。由此可知，本发明的ACC在脂肪酸生物合成、脂质代谢的调节方面发挥了重要作用。通过本发明的ACC而生成的丙二酰辅酶A，如上所述是脂肪酸合成的底物，该丙二酰辅酶A的生成速度成为在生物体内生物合成脂肪酸的限制速度。具体来说，在合成新型脂肪酸时，以乙酰辅酶A作为起始物质，经过与丙二酰辅酶A的缩合·还原·脱水·再还原的一系列反应而脱去(X)2进行结合每次延长2个碳原子，从而合成脂肪酸。例如碳原子数为 16的棕榈酸是通过进行7次缩合·还原·脱水·再还原的一系列反应而生成的，该棕榈酸的甲基末端的2个碳原子来自乙酰辅酶A，其他来自丙二酰辅酶A。此外，丙二酰辅酶A不仅是脂肪酸生物合成的中间体，而且是聚酮类生物合成的中间体。进而如下所述，本发明的乙酰辅酶A羧化酶具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性。本发明的编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸作为与本发明的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)相关的序列，可例举作为表示来自 M. alpinalS-4的ACC的ORF区域的序列的序列号1、作为氨基酸序列的序列号2、作为表示 CDS区域的序列的序列号3及作为cDNA的碱基序列的序列号4、表示基因组碱基序列的序列号5。其中，序列号3相当于序列号4的第45 6734位的碱基序列，序列号1相当于序列号4的第45 6731位的碱基序列、及序列号3的第1 6684位的碱基序列。序列号5 的基因组序列含有5个内含子，外显子区域为序列号5的第1 27位、第315 665位、第 1271 沘沘位、第四17 ；3463位、第；3590 6239位、第6339 7889位。本发明的核酸除单链及双链的DNA之外，还包括其RNA互补体，可以来自天然，也可以由人工制备。DNA中，例如可例举基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、以及这些DNA的组合物、DNA和RNA的杂交体，但并不限于此。
作为本发明核酸的优选方式，可例举(a)含有序列号1所示的碱基序列的核酸、 (b)含有编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的核酸、(c)含有序列号4所示的碱基序列的核酸或(d)含有序列号5所示的碱基序列的核酸等。为了获得上述碱基序列，也可以从具有ACC活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，搜索编码与已知的具有ACC活性的蛋白质有高同一性的蛋白质的碱基序列。 作为具有ACC活性的生物，优选脂质生产菌，作为脂质生产菌，可例举M. alpina,但并不限于此。进行EST分析时，首先构建cDNA文库。关于cDNA文库的构建方法，可参考 ((Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.》(美国冷泉港出版社 QOOl))。并且也可使用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可例举以下方法。即将作为脂质生产菌的Malpina的适当菌株接种到适当的培养基中，预培养适当时间。作为适合该预培养的培养条件，可例举例如作为培养基的组成可例举1. 8%葡萄糖、酵母提取物、pH6. 0，培养时间为3天，培养温度为的条件。然后将预培养物在适当的条件下供给主培养。作为适合主培养的培养基组成，例如可例举1.8% 葡萄糖、大豆粉、0. 橄榄油、0.01 ^Adekanol (商品名称，日语原名尹力7 —>)、 0. 3% ΚΗ2Ρ04、0· 1% Na2SO4^O. 05% CaCl2 · 2Η20、0· 05% MgCl2 · 6Η20、ρΗ6· 0。作为适合主培养的培养条件，例如可例举300rpm、lVVm、26°C下通气搅拌培养8天的条件。培养期间可添加适量的葡萄糖。在主培养中适时提取培养物，从其中回收菌体，制备总RNA。制备总RNA 时，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可使用市售的试剂盒从得到的总RNA中纯化 poly(A)+RNA。并且可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。然后将构建的cDNA文库的任意克隆的碱基序列使用按照可决定载体上插入部分的碱基序列的方式设计的引物来决定，可获得 EST。例如用 ZAP-cDNA GigapackI II Gold Cloning Kit (STRATAGENE)(商品名称)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。相对于在GenBank中注册的氨基酸序列，利用BLASTX对本发明ACC的cDNA序列进行同源性分析，结果显示与真核微生物的ACC同源物有同源性。在已知的氨基酸序列中同一性最高的是来自米根霉(Miizopus oryzae)的推定蛋白质R03G_04977，用ClustalW 来求出编码该蛋白质的CDS与本申请发明的ACC的CDS的碱基序列的同一性及氨基酸序列的同一性时，分别为65. 5%,66. 3%。作为与来自其他菌类的ACC同源物的推定氨基酸序列的同一性，与来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(注册号EAA33781)的序列的同一性为58. 8%，与来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(注册号EAL93163)的序列的同一性为58. 3%，此外，与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞质ACC的Acclp (序列号 34)的同一性为55. 1%，与线粒体ACC的Hfalp (序列号35)的同一性为44.7%。此外，对于来自M. alpina的ACC基因，来自CBS5^. 72株的ACC同源物的部分序列是公知的，已在Genbank中注册(核酸序列注册号AJ586915 (非专利文献6)、氨基酸序列注册号CAE52914)。来自CBS528. 72株的CDS部分相当于序列号1的第342 1439位的碱基序列，其氨基酸序列相当于序列号4的第100 465位的氨基酸序列。将该序列与本次得到的来自M. alpinalS-4的cDNA中的CBS5^. 72株的CDS部分进行比较时，碱基序列的同一性为91. 3 %，氨基酸序列的同一性为97. 8%。对于本发明的来自M. alpinalS-4 的cDNA中的在公知的CBS5^. 72株中未公开的部分的序列，目前为止尚未报道，也就是说，
13M. alpina的ACC基因的全序列在本发明中才首次证明。本次重新证明的部分的序列中存在多个对于ACC的功能来说重要的区域，具体来说，证明存在对于ACC活性所必需的生物素羧基载体蛋白结构域、羧基转移酶结构域、附加生物素的蛋白质中的保守区域以及附加生物
素的残基。本发明还包括与含有上述序列号1所示的碱基序列(有时记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号2所示的氨基酸序列(有时记为“本发明的氨基酸序列”)所组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能的核酸。“具有同等功能”意味着本发明的碱基序列所编码的蛋白质以及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有ACC活性。ACC活性可用公知的方法测定，例如可例举J. B. C.，279，21779-21786，2004中记载的方法。进而，在上述的ACC活性的基础上，本发明的碱基序列所编码的蛋白质或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质，也包括具有与酵母的ACC缺陷互补的活性的蛋白质(以下有时记为“本发明的具有酵母ACC缺陷互补活性的蛋白质”)。已知酿酒酵母 (S. cerevisiae)的ACC定位于细胞质和线粒体内，其中，编码存在于细胞质的ACC的ACCl 基因是必需基因，缺失时会致死(Biochim. Biophys. Acta，1771，255-270，2007)。也就是说， 缺失ACCl基因的酵母通常不会生长发育，但使与ACCl基因具有同等功能的基因表达时，即可互补、生长发育。在此，对于本发明的ACC，作为确认其与酵母ACC缺陷互补的方法，只要是在酵母的ACC缺陷株内使本发明的ACC基因进行表达时，可确认该酵母的ACC活性恢复的方法，可以为任何方法。作为一个具体例，例如对于编码细胞质型ACC的ACCl基因，可如下述方式实施。即如以下实施例4中具体说明的那样，制作使二倍体酵母中编码细胞质ACC的 ACCl基因的等位基因的仅一个发生缺陷的杂合株，接着制作在该株中将一个本发明的ACC 基因的表达盒插入与载有ACCl的染色体不同的染色体上的株。将该菌株涂布在孢子形成培养基上，形成子囊孢子。通过对得到的菌体进行随机孢子分析或四分子分析，可得到来自孢子的单倍体株。对于这样得到的单倍体酵母的基因型进行分析，如果能够确认在本来不能生长发育的ACCl缺陷株中，仅在本发明的ACC基因的表达盒存在时才能够生长发育，即可判断本发明的ACC在酿酒酵母(S. cerevisiae)中可与ACC活性互补。进而，在上述的ACC活性的基础上，本发明的碱基序列所编码的蛋白质、或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质，还包括具有使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性的蛋白质。即本发明的蛋白质，用编码该蛋白质的核酸使宿主细胞转化，而且使该蛋白质进行表达时，可使该转化细胞所产生的脂肪酸的量、组成与未转化的宿主细胞相比较发生变化。在此，宿主可使用在下述的“本发明的ACC表达用载体的构建及转化体的制作”项目中所例示的宿主。此外，宿主所产生的脂肪酸也可以为下述的“本发明的脂肪酸组合物”项目中所例示的脂肪酸。作为这种与本发明的核酸具有同等功能的核酸，可例举以下(a) (e)中任一项所述的核酸。此外，在以下记载中，“本发明的上述活性”意味着上述“ACC活性、本发明的酵母ACC缺陷互补活性及/或可使宿主本来具有的脂肪酸含量、脂肪酸组成变化的活性”。(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列，本发明的核酸含有如下碱基序列，S卩编码由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列，具体来说，其为编码由如下氨基酸序列组成的蛋白质且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列，(i)在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1 400个、1 200个、1 100个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、更优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))氨基酸发生缺失后的氨基酸序列；(ii)在序列号2所示的氨基酸序列中，1个或多个(优选为1个或数个(例如1 400个、1 200个、1 100个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、更优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))氨基酸被其他氨基酸取代后的氨基酸序列；(iii)在序列号2所示的氨基酸序列中，附加了 1个或多个(优选为1个或数个 (例如1 400个、1 200个、1 100个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、更优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))其他氨基酸后的氨基酸序列；或(iv)将上述(i) (iii)组合后的氨基酸序列。其中，取代优选为保守取代，保守取代是指将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原来序列的结构相关的特征，可以为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原来序列中存在的螺旋结构、不破坏赋予原来序列特征的其它种类的二级结构，可以为任何取代。保守取代通常用生物学体系合成、化学肽合成来导入，优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可含有非天然的氨基酸残基，也含有肽模仿物、氨基酸序列中没有被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。以下将氨基酸残基按照可取代的残基进行分类例示，但可取代的氨基酸残基并不限定于以下记载的氨基酸残基。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、0-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4_ 二氨基丁酸、2，3_ 二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。非保守性取代时，上述种类中的某1种成分可以与其他种类的成分交换，此时为了保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数) (Kyte 等，J. Mol. Biol.，157 105-131 (1982))。此外，非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。在本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩略语均遵照IUPAC-IUB的生物化学命名法的规定，或者基于例如((Immunology—A Synthesis))(第 2 版，E. S. Golub 及 D. R. Gren监修，Sinauer Associates,Massachusetts 州 Sunderland (1991))等记载的本领域惯用的缩略语。此外，对于氨基酸，如果有光学异构体时，如无特别标示，均表示L体。D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α-二取代氨基酸等非天然氨基酸、 N-烷基氨基酸、乳酸、以及其它非惯用的氨基酸也可作为构成本发明的蛋白质的要素。此外，本说明书中使用的蛋白质的表示方法，根据标准用法及本领域惯用的表示方法，左方为氨基末端方向，右方为羧基末端方向。同样，在通常情况下如无特别说明，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方为5’方向。如果是本领域技术人员，使用本领域公知的技术，可设计并构建本说明书中记载的蛋白质的适当的突变体。例如通过将认为对本发明的蛋白质的生物学活性不太重要的区域作为靶区，可鉴定出不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而可改变其结构的蛋白质分子中适当的区域。并且还可鉴定出在类似蛋白质间保留的分子残基及区域。进而，在认为对本发明的蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏生物学活性、且对蛋白质的多肽结构不产生不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。特别是在本发明的ACC的氨基酸序列中有作为含生物素的酶的保守基序 (motif)“MKM基序”。本基序是ACC所必须的基序，保留在含生物素酶的氨基酸序列中，为图 4中的第736 738位氨基酸残基。此外，图4是来自M. alpina的ACC与来自酵母的ACCl 氨基酸序列的比对图。在图4中，单下划线表示生物素羧化酶(biotin-Carboxylase ；BC) 结构域、双下划线表示生物素羧基载体蛋白(biotin Carboxyl Carrier protein ；BCCP)结构域、虚下划线表示羧基转移酶(Carboxyl-transferase ;CT)结构域。表示带有*符号的 K(Lys)残基为附加了生物素的残基，用框围起来的区域为MKM的基序。因此，本发明的突变体只要保留上述保守基序，且不损坏本发明的上述活性，可以为任何突变体。只要是本领域技术人员，通过鉴定对本发明的蛋白质生物学活性或结构重要的与相同蛋白质的肽类似的肽残基，比较这2个肽的氨基酸残基，即可预测与本发明的蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基，也就是说，可进行结构-功能研究。进一步通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，还可选择保持本发明蛋白质的生物学活性的突变体。此外，如果是本领域技术人员，也可对本蛋白质的突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。并且从获得的分析结果中，也可预测与蛋白质的三维结构相关的氨基酸残基的比对。预测在蛋白质表面上存在的氨基酸残基，有参与和其他分子的重要相互作用的可能性，如果是本领域技术人员，可根据上述分析结果，构建使预测在这种蛋白质表面上存在的氨基酸残基不变化的突变体。进而如果是本领域技术人员，还可构建在构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基中仅有一个氨基酸残基发生取代的突变体。将这种突变体通过公知的分析方法进行筛选， 可收集各种突变体的信息。通过这样，对于取代了某种特定氨基酸残基的突变体的生物学活性与本发明的蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现这种生物学活性时、或者产生抑制本蛋白质的生物学活性的不适当活性时的情况进行比较，可评价构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，根据这种从日常实验中收集的信息，通过单独应用或与其他突变组合，即可容易地分析作为本发明蛋白质的突变体所不期
16望的氨基酸取代。如上所述，由在序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质，可根据《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.》(美国冷泉港出版社 OOOl))、《Current Protocols in Molecular Biology)) (John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92、 Kunkel (1988)Method. Enzymo 1. 85 :2763-6等记载的定点诱变法等方法进行制备。这种氨基酸发生了缺失、取代或附加等突变的突变体的构建，例如可使用通过Kimkel法、Gapped duplex法等公知的方法，使用利用了定点诱变法的突变导入用试剂盒，例如QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司制)、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen 公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等TaKaRa Bio 公司制)等进行。此外，作为在蛋白质的氨基酸序列中，在保持其活性的同时导入1个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，除上述定点诱变之外，还可例举用突变源处理基因的方法、 以及使基因选择性断裂从而将被选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。本发明的核酸中所含有的碱基序列，优选为编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成、且具有ACC活性的蛋白质的碱基序列。此外，本发明的核酸所含有的碱基序列中还包括编码由在序列号2中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的蛋白质中的氨基酸的突变或修饰的数量、或者突变或修饰的位点，只要可保持本发明的上述活性则无限制。本发明的上述活性的测定方法如上所述。(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸含有与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。序列号1及ACC 活性如上所述。上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段构建探针，使用该探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印迹法(一种DNA的印迹技术，由英国人 Southern创建)等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库等中获得。对于杂交法的详细操作步骤，可参照《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.》(美国冷泉港出版社Q001)；特别是6-7部分)、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons (1987-1997)；特别是 6. 3-6. 4 部分)、《DNA Cloning 1 :Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.》(牛津大学(1995)；杂交条件特别是2. 10部分)等。杂交条件的强度，主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件来决定。在本说明书中“严谨条件”包括中度或高度严谨条件。具体来说，作为中度严谨条件，例如杂交条件，可例举IXSSC 6XSSC、42°C 550C的条件，更优选1 X SSC 3 X SSC、45°C 50°C的条件，最优选2 X SSC,50°C的条件。杂交溶液中例如含有约50%甲酰胺时，采用比上述温度低5至15°C的温度。作为洗涤条件，可例举0. 5 X SSC 6 X SSC、40 V 60°C。在杂交及洗涤时，通常可加入0.05% 0.2% SDS、 优选约0. 1% SDS0作为高度严谨(高严谨)的条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如作为杂交条件，可例举0. IXSSC 2XSSC、55°C 65°C的条件，更优选0. 1 X SSC 1 X SSC、60°C 65°C的条件，最优选0. 2 X SSC,63°C的条件。作为洗涤条件，可例举0. 2XSSC 2XSSC、50°C 68°C，更优选0. 2XSSC,60 65°C。特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可例举在5 X SSC、1 % SDS、50mM Tris-HCl (pH7. 5)及50%甲酰胺中在42°C的条件下，进行预杂交后，添加探针，在42°C保温过夜形成杂交体，然后在0. 2 X SSC、0. 1 % SDS中在65°C下进行3次20分钟的洗涤的条件。 但并不限于此条件。此外，还可使用探针内不使用放射性物质的市售的杂交试剂盒，具体可例举使用 DIG核酸检测试剂盒(罗氏诊断公司)、ECL直接标签&检测系统(ECL direct labeling & detection system) (Amersham 公司制)的杂交等。作为在本发明中含有的核酸，可例举优选含有与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交、且编码具有ACC活性的蛋白质的碱基序列的核酸。(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸中所含有的碱基序列由与序列号1所示的核酸序列至少有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。可例举含有优选与序列号1所示的碱基序列至少有80%、更优选为85%、进一步优选为90% (例如92%以上、更进一步优选为95%以上、进一步优选为97%、98%或99%) 同一性的碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。2个核酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来决定，优选使用计算机程序通过比较2个核酸的序列信息来决定，作为序列比对的计算机程序，例如可例举可从美国国立医学图书馆网站:http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/blast/bl2seq/bls. html 上利用的 BLASTN 程序(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10) :version 2· 2· 7 版、 或WU-BLAS Τ2. 0计算法等。对于WU-BLAST2. 0的标准默认参数的设定，可使用以下网站 http://blast.wustl. edu 记载的参数值。(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸含有编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸所编码的蛋白质，只要具有与具有本发明的上述活性的蛋白质同等功能，可以为ACC或与ACC的氨基酸序列有同一性的蛋白质。具体来说，可例举与序列号2所示的氨基酸序列有80%以上、优选为85%以上、更优选为90%、进一步优选为95%以上、更进一步优选为97% (例如98%、进而99% )以上
同一性的氨基酸序列等。本发明的核酸，优选为含有编码与由序列号2所组成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质、且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。进一步优选为含有编码与由序列号2所组成的氨基酸序列有98%以上同一性的氨基酸序列组成蛋白质、且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。2个氨基酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来决定，此外，可使用计算机程序来决定同一性％，作为这种计算机程序，例如可例举BLAST、FASTA (Altschul等、 J. Mol. Biol.，215 =403-410 (1990))、及 Clustalff 等。特别是 BLAST 程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由 Altschul 等(Nucl. Acids. Res.，25，p. 3389-3402,1997)作了记载，所以可从美国国立生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站公开获得。(BLAST 指南、Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894 ;Altschul 等)。此夕卜， 也可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver. 7 (GENETYX)、DINASIS Pro (日立软件)、Vector NTI (Infomax)等程序来决定。使多个氨基酸序列并列的特定的比对图，因为也可以显示序列中特定的短区域的匹配，所以即使使用的序列的全长序列间没有显著性的关系，但在这种区域，也可检测出特定的序列同一性非常高的区域。并且，BLAST算法可使用BL0SUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数，还可使用下述(A)包括用于将具有低组成复杂性的查询序列的片段(也可参照由 Wootton 及 Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)决定；Wootton R Federhen, 1996 “序列数据库组成偏向性区域的分析(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases) "Methods Enzymol. ,266 :544-71) ^nJcfeMiIirt 部重复序列组成的片段(Claverie 及 Mates (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程序决定)屏蔽的过滤器，以及(B)用于报告相对于数据库序列的一致性的统计学显著性阈值、或根据Ε-score (Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅偶然性发现的一致性期望概率；因某种一致性引起的统计学显著误差大于E-score阈值时，不报告该一致性。(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸是含有与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。由序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质及杂交条件如上所述。作为本发明的核酸，可例举含有与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。此外，本发明的核酸还包括含有由在序列号1所组成的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或附加后的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。具体来说，也可使用含有如下碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸，(i)在序列号1所示的碱基序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1 1500 个、1 1000个、1 500个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、 1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))碱基发生缺失后的碱基序列，(ii)在序列号1所示的碱基序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1 1500个、1 1000个、1 500个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100 个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、
3、2或1个))碱基被其它碱基取代后的碱基序列，(iii)在序列号1所示的碱基序列中附加1个或多个(优选为1个或数个(例如 1 1500个、1 1000个、1 500个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、进一步优选为10、9、8、7、6、
5、4、3、2或1个))其它碱基后的碱基序列，或者(iv)将上述⑴ (iii)组合后的碱基序列。作为本发明的核酸的优选方式，还包括以下(a) (C)中任一项记载的核酸。(a)含有序列号1所示的碱基序列或其部分序列的核酸，(b)含有编码由序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列的核酸，(c)含有序列号4所示的碱基序列或其部分序列的核酸。关于(a)含有序列号1所示的碱基序列的核酸，(b)含有编码由序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的核酸、(c)含有序列号4所示的碱基序列的核酸， 如上所述。上述序列的部分序列，包括上述碱基序列中包含的0RF、CDS、具有生物学活性的区域、作为以下记载的引物而使用的区域、可成为探针的区域，可以来自天然，也可以由人工合成。而且，本发明的核酸中还包括以下核酸。(1) (a)含有编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、 取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸，(b)与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸，(c)由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成且含有编码蛋白质的碱基序列的核酸，(d)含有编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸，(e)与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸，以及(2)根据(1)所述的核酸，其为以下(a) (e)中任一项核酸，(a)核酸，其含有编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，(b)核酸，其与由与序列号1所组成的碱基序列互补的碱基序列组成的核酸在 2XSSC、50°C的条件下杂交，(c)核酸，其含有由与序列号1所组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列组成的碱基序列，(d)核酸，其含有编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，(e)核酸，其与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交。本发明的乙酰辅酶A羧化酶蛋白质本发明的蛋白质，包括序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质以及与所述蛋白质具有同等功能的蛋白质，可以为来自天然的蛋白质，也可以为人工制备的蛋白质。对于序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质，如上所述。“具有同等功能的蛋白质”如上述 “编码本发明的乙酰辅酶A羧化酶的核酸”项中的说明，意味着具有“本发明的上述活性”的蛋白质。在本发明中，作为与序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，可以例举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质。(a)由在序列号2中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成， 且具有本发明的上述活性的蛋白质，(b)由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质。对于上述中的在序列号2中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列、或者与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列，如上述“编码本发明的乙酰辅酶A羧化酶的核酸”项中的说明。此外，上述“具有本发明的上述活性的蛋白质”包括被含有序列号1的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、或者在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等通过多种修饰而发生突变的蛋白质，或者氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质，与其它蛋白质形成的融合蛋白质，且具有 ACC活性及/或本发明的酵母ACC缺陷互补活性及/或可形成本发明的脂肪酸组成的活性的蛋白质。此外，本发明的蛋白质也可以为人工制备的蛋白质，此时，可通过Fmoc法(9_芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。此外，还可利用Advanced Chem iTech 公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia 公司制、Protein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。此外，本发明的蛋白质中还包括以下蛋白质。(1) (a)由在序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，(2)以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)由在序列号2中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的核酸的克隆
本发明的ACC的核酸，例如可通过使用适当的探针从cDNA文库中筛选来进行克隆。此外，可通过使用适当的引物通过PCR反应进行扩增，再连接于适当的载体上来进行克隆。进而也可亚克隆到其它载体上。例如可以使用 pBlue-Script (商标)SK (+) (Stratagene)、pGEM—T (Promega)、 pAmp (TM =Gibco-BRL)、p-Direct (ClontecH)、pCR2. I-TOPO(Invitrogene)等市售的质粒载体。此外，通过PCR反应进行扩增时，引物可使用上述序列号1等所示的碱基序列中的任意部分，例如可分别使用上游侧用引物5，-GCCAACTGGCGTGGATTCTC-3，(序列号 6)下游侧引物5’-GTCCTCGTTGATAGTAGGGTC-3，(序列号7)等。接着使上述引物及耐热性DNA聚合酶等与从M. alpina菌体中制备的cDNA发生作用从而进行PCR反应。上述方法,根据《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.》(美国冷泉港出版社 (2001)) ”等，只要是本领域技术人员即可容易地进行，作为本发明的PCR反应的条件，例如可例举以下条件。变性温度90 95 °C退火温度40 60°C延伸温度60 75 °C、循环次数10次以上将获得的PCR产物进行纯化时可使用公知的方法。例如有使用 GENECLEAN(Funakoshi)、QIA 快速 PCR 纯化试剂盒(QIAquick PCR purification Kits) (QIAGEN)、ExoSAP-IT (GE Healthcare Bio-Sciences)等试剂盒的方法、使用 DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶中切出，可通过GENECLEAN(Fimakoshi)、QIA快速PCR纯化试剂盒 (QIAquick Gel extraction KitsMQIAGEN)、Freeze&Squeeze (冷冻挤压)法等进行纯化。已克隆的核酸的碱基序列可用碱基序列测序仪来决定。本发日月的ACC表达用jH本^^聿及转^本的泡K乍本发明还提供含有编码本发明的ACC的核酸的重组载体。本发明还进一步提供被上述重组载体转化的转化体。这种重组载体及转化体可通过以下方法获得。即将含有编码本发明ACC的核酸的质粒用限制性内切酶进行酶切。作为使用的限制性内切酶，例如可例举EcoRI、KpnI, BamHI及MlI等，但不限于这些。此外，也可通过T4聚合酶处理进行末端平滑化。酶切后的碱基序列片段通过琼脂糖凝胶电泳来进行纯化。通过用公知的方法将该碱基序列片段整合到表达用载体内，可获得ACC表达用载体。将该表达载体导入宿主内制作转化体，供给目标蛋白质的表达。此时，表达载体及宿主，只要能够表达目标蛋白质，没有特别限定，例如作为宿主， 可例举真菌、细菌、植物、动物或其细胞等。作为真菌，可例举作为脂质生产菌的Ealpina 等丝状真菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母等。此外，作为细菌，可例举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。进而作为植物，可例举油菜子、大豆、棉花、红花、亚麻等油粮植物等。作为脂质生产菌，例如可使用MYC0TAX0N，Vol. XLIV, NO. 2, pp. 257-265 (1992)所记载的菌株，具体来说可例举属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如长孢被孢霉(M. elongate) IF08570、Μ. exigua IF08571、Μ. hygrophila IF05941、高山被孢霉(Mortierella alpina) IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、 CBS224. 37、CBS250. 53、CBS343. 66、CBS527. 72、CBS528. 72、CBS529. 72、CBS608. 70、 CBS7M. 68等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物，或者深黄被孢霉 (M. isabellina)CBS194.28、 IF06336、 IF07824、 IF07873、 IF07874、 IF08286、 IF08308、 IF07884、M. nana IF08190、拉曼被孢霉(M. ramanniana) IF05426、IF08186、CBS112. 08、 CBS212. 72、IF07825、IF08184、IF08185、IF08287、葡酒色被孢霉(M. vinacea) CBS236. 82 等属于Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选高山被孢霉 (M. alpina)。将真菌类作为宿主使用时，优选本发明的核酸为可在宿主中自主复制、或者可插入该菌的染色体上的结构。与此同时，优选为含有启动子、终止子的组成。使用高山被孢霉作为宿主时，作为表达载体，例如可例举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只要能够在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonM. 1基因启动子、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子、TEF(翻译延伸因子)基因启动子等来自高山被孢霉的启动子。作为向高山被孢霉等丝状真菌内导入重组载体的方法，例如可例举电穿孔法、原生质球法、粒子轰击法(particle delivery)以及向核内直接显微注射DNA等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养的选择培养基上生长发育的菌株，可获得转化体。 此外，转化时使用抗药性标记基因时，在含有该药剂的选择性培养基上进行培养，可获得显示抗药性的细胞菌落。使用酵母作为宿主时，作为表达载体，例如可例举PYE2&1等。此外，也可使用 ρ YES (Invitrogen), pESC (STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。此外，作为适合于本发明的宿主，可例举酿酒酵母(S. cerevisiae)EH13-15株(trpl、MATa)等，但并不限于这些。 作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、GALl启动子、GALlO启动子等来自酵母的启动子。作为向酵母内导入重组载体的方法，例如可例举乙酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或复数)的包裹、以及在核内直接显微注射DNA等。使用大肠杆菌等细菌作为宿主时，作为表达载体，例如可例举Wiarmacia公司的 pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、Iac启动子、PL启动子、I3R启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。本发明的脂肪酸组合物的制造方法本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即从培养上述转化体得到的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。具体来说可用以下方法制造。但是关于本制造方法， 并不限于该方法，也可使用通常公知的其它方法进行。用于培养使ACC表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，含有各宿主增殖时所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如将酵母转化使ACC表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。作为具体的培养基的组成，例示SC-Trp培养基每IL中，无氨基
23酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids) (DIFCO) 6. 7g、葡萄糖 20g、氨基酸粉 (腺嘌呤硫酸盐1. 25g、精氨酸0. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0. 6g、亮氨酸1. Sg、赖氨酸0. 9g、蛋氨酸0. 6g、苯丙氨酸1. 5g、丝氨酸11. 25g、酪氨酸0. 9g、缬氨酸4. 5g、苏氨酸 6g、尿嘧啶0. 6g的混合物)1. 3g)。培养条件，只要适合宿主增殖，且为可使生成的酶保持稳定的适当条件，可以为任何条件，具体来说，可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。 培养方法，可以在同一条件下培养(一步培养)，也可以使用2个以上不同的培养条件即所谓的二步培养或三步培养，进行大量培养时，优选培养效率好的二步培养等。以下，作为本发明的脂肪酸组合物的具体制造方法，可例示作为宿主使用酵母进行二步培养时的情况进行说明。即作为预培养，将上述得到的菌落接入例如上述的SC-Trp 培养基等上，在30°C进行振荡培养2天。然后作为主培养，在YPD5 酵母提取物、1 %聚蛋白胨、5%葡萄糖)培养基IOml中添加预培养液500 μ 1，在30°C进行振荡培养2天的方法。本发明的脂肪酸组合物本发明还提供作为本发明的ACC所表达的细胞中的1种或1种以上的脂肪酸的聚合体的脂肪酸组合物。优选为培养本发明的ACC所表达的转化体而得到的脂肪酸组合物。 脂肪酸可以为游离脂肪酸，也可以为三甘油酯、磷脂质等。作为本发明脂肪酸组合物中含有的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可例举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻油酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸) (16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18:1(9))、异油酸 (11-十八碳烯酸)(18:1 (11))、亚油酸(顺式，顺式-9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、 α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、γ-亚麻酸(6，9，12_十八碳三烯酸)(18:3(6，9，12))、亚麻油酸(Stearidonic acid) (6，9，12，15-十八碳四烯酸) (18:4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(200)、(8，11-二十碳二烯酸 M202 (8，11))、 Mead 酸(5，8，11_ 二十碳三烯酸 M20:3(5，8，ll))、二高 γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸 Μ20:3 (8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸 Μ20:4 (5，8，11，14))、 二十碳四烯酸(8，11，14，17-二十碳四烯酸Μ20:4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸(5,8,11, 14，17-二十碳五烯酸)00:5(5，8，11，14，17))、山嵛酸(二十二烷酸 Μ22 0)、(7，10，13， 16- 二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(7，10，13，16，19- 二十二碳五烯酸)(22:5(7， 10，13，16，19))、(4,7,10，13，16- 二十二碳五烯酸)(22:5(4,7,10，13，16))、(4,7,10，13， 16，19-二十二碳六烯酸)(22:6 ，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式-15-二十四烯酸)(对:1)、蜡酸(二十六烷酸)06:0)等，但并不限于这些。此外， 上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了系统名称以及表示碳原子数量和双键位置的数值。本发明的脂肪酸组合物，只要是上述脂肪酸中的1种或1种以上的脂肪酸的组合， 可以为由任何数量任何种类的脂肪酸组成的组合物。在通过上述本发明的脂肪酸组合物的制造方法得到的冷冻干燥菌体中，添加以适当比率调整的氯仿甲醇并搅拌后，加热处理适当时间，进而通过离心分离将菌体分离，回
24收溶剂，这样重复数次。然后使用适当的方法使脂质干燥固化，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。从该试样中取出适当量，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取， 蒸馏除去己烷后用气相色谱法进行分析。例如，通过使本发明的ACC在酵母中表达时，在该脂肪酸组成中，可得到具有如下特征的脂肪酸组合物，即与培养未被本发明的重组载体转化的宿主而得到的培养物相比，棕榈油酸及/或山嵛酸的比率高或者棕榈酸、硬脂酸及/或蜡酸的比率低。此外，本发明的ACC，由于有时脂肪酸组成与公知的ACC脂肪酸组合物的脂肪酸组成不同，因此表示本发明的ACC与公知的ACC对宿主的脂质代谢的影响不同。含有本发明的脂肪酸组合物的食品等此外，本发明提供含有上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物可根据常法在例如含有油脂的食品、工业原料(化妆料、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料) 的制造等用途中使用。作为化妆料(组合物)或医药(组合物)的剂型，可例举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可例举胶囊剂等医药制剂的形态、或者在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合有本发明的脂肪酸组合物的自然流体食物、半消化态营养食物、及成份营养食物、 (健康)饮料、经肠营养剂等加工形态。进而，作为本发明的食品例，可例举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，但不限于这些。在本说明书中，食品是固体、流体、及液体及其混合物，是可摄取食用的物质的总称。营养辅助食品是指强化了特定的营养成分的食品，保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥身体的调节功能的营养成分的食品，与特定保健用途食品含义相同。幼儿用食品是指供给小于约6岁的孩子用的食品，老人用食品是指处理成与无处理的食品相比容易消化及吸收的食品。婴儿用配方乳是指供给小于约1岁的孩子用的配方乳，早产儿用配方乳是指供给早产儿从出生到出生后约6个月为止所用的配方乳。作为这些食品，可例举肉、鱼、果仁等天然食品(用油脂处理过的食品)冲华料理、拉面、汤等制作时加入油脂的食品；天麸罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、炸面圈、油炸糖点心等用油脂作热介质的食品；黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味料、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工时加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于含油脂的食品，例如可例举面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、 豆腐及其加工品等农产食品；清酒、药用酒、甜料酒、食用醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、 火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、 运动饮料、酒精饮料、茶等。#用本发日月的编码ACC ^MaKACC蛋白质的菌株的i平价·诛雇方法本发明还提供使用本发明的编码ACC的核酸或ACC蛋白质，进行评价、选择脂质生产菌的方法。具体如下所示。(1)评价方法作为本发明的一个实施方式，可例举使用本发明的编码ACC的核酸或ACC蛋白质，
25进行评价脂质生产菌的方法。作为本发明的上述评价方法，首先例举使用根据本发明的碱基序列而设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评价的方法。这种评价方法的通常方法是公知的，例如在国际专利申请手册W001/040514号、 日本专利申请特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用赫里福德(Hereford)法、乙酸钾法等任何公知的方法(例如参照Methods in Yeast Genetics，美国冷泉港实验室出版社， pl30(1990))。根据本发明的碱基序列、优选根据序列号1设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明的碱基序列的任意部分，并且可使用公知的方法进行其设计。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15 25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300 2000碱基为宜。使用上述构建的引物或探针，检测上述被测菌株的基因组中是否存在本发明的碱基序列的特异性序列。本发明的碱基序列的特异性序列的检测可采用公知的方法进行。例如，用含有本发明的碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，例如通过PCR法等来扩增被测菌株的核酸，可以测定扩增产物的有无、扩增产物的分子量大小等。适合本发明方法的PCR法的反应条件，没有特别限定，例如可例举以下条件等条件，变性温度90 95 °C退火温度40 60°C延伸温度60 75 °C循环次数10次以上将得到的反应生成物的扩增产物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可以测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是含有相当于本发明的碱基序列的特异区域的核酸分子的大小，可以预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，可以进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。此外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。此外，作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号1等本发明的碱基序列所编码的ACC的表达量，也可以评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，ACC的表达量，可以通过在适当的条件下培养被测菌株，对ACC的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA 或蛋白质的定量可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过免疫印迹法(Westernblotting)进行(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-200 。(2)选择方法作为本发明的其他实施方式，可例举使用本发明的编码ACC的核酸或ACC蛋白质来选择脂质生产菌的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号1 等本发明的碱基序列所编码的ACC的表达量，选择目标表达量的菌株，可以选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，通过比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可以选择出期望的菌株。具体来说，例如将标准菌株和被测菌株在适当的条件下培养，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比较，被测菌株为高表达或低表达的被测菌株，可以选择具有期望活性的菌株。对于期望的活性，如上所述可例举测定ACC的表达量的方法。此外，作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，也可以选择具有期望活性的被测菌株。对于期望活性，如上所述，可例举测定 ACC的表达量的方法。作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸的表达受到抑制的菌株、实施突变处理的菌株、发生自然突变的菌株等，但并不限于这些。此外，本发明的ACC活性及/或本发明的酵母ACC缺陷互补活性例如可通过本说明书中的“本发明的编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸”项目中记载的方法进行测定。作为突变处理，例如可例举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、P67-75、学会出版中心等)(日语原名大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、P 67-75、学会出版七 > 夕一)，但不限于这些。此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可例举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体来说，标准菌株、被测菌株可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。以下，根据实施例对本发明进行更加具体的说明，但本发明并不限于实施例。实施例〔实施例1〕(1) cDNA文库的构建与EST分析将M.alpinalS-4株接种于IOOml的培养基(1. 8 %葡萄糖、1 %酵母提取物、 PH6.0)中，在振荡培养4天。回收菌体，用盐酸胍/CsCl法制备总RNA。使用 01igotex-dT30<Super>mRNA 纯化试剂盒(TaKaRa Bio)，从总 RNA 中纯化 poly (A)+RNA。使用其并利用 ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(ZAP_cDNA GigapackIII 金克隆试剂盒)(STRATAGENE)，构建cDNA文库，进行cDNA的5，端一步法序列分析(约2000克隆)。(2) ACC同源物的检索将通过EST分析获得的序列，相对于在GENEBANK中注册的氨基酸序列使用同源性检索程序BLASTX进行检索，提取出乙酰辅酶A羧化酶的同源物。其结果，发现了与来自裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的乙酰辅酶A羧化酶同源物(注册号P78820)原本有高同一性的序列，即相当于序列号1的第5833 60 位碱基的序列。〔实施例2〕(I)MaACC 的克隆因为认为实施例1中发现的与序列号1的第5833 60 位碱基相当的序列编码了 Malpina的乙酰辅酶A羧化酶同源物(MaACC)的部分序列，所以以该序列为基础，进行 cDNA文库的筛选。首先为了构建PCR用的探针，设计了引物931-F和931-R。931-F :5，-GCCAACTGGCGTGGATTCTC-3，(序列号 6)
931-R :5，-GTCCTCGTTGATAGTAGGGTC-3，(序列号 7)以cDNA文库(2. 6 X lifpfu/μ 1)为模板，利用引物931-F和931-R，使用 ExTaq(TaKaRa Bio)进行PCR。PCR的条件为在94°C 2分钟后，将94°C 1分钟、55°C 1分钟、72°C 3分钟作为1个循环，进行30个循环。将扩增的片段用TOPO-TA 克隆试剂盒(cloning Kit) (INVITROGEN CORPORATION) 进行TA-克隆，确认有多少个克隆的碱基序列，将含有序列号4的第5835 6014位序列的克隆作为pCR-MaACC-Pl。接着，将该质粒作为模板，使用上述引物进行PCR反应。反应中虽然使用了 ExTaq (TaKaRa Bio)，但用PCR标记用混合物(罗氏诊断公司)代替添加的dNTP 混合物，将扩增的DNA用地高辛(DIG)标记，构建用于筛选cDNA文库的探针。使用该探针来筛选cDNA文库。杂交条件如下所示。缓冲液5XSSC、1%SDS、50mM Tris-HCl (pH7. 5)、50% 甲酰胺；温度42°C(—夜)；洗涤条件在0. 2XSSC、0. 1% SDS 溶液中(65°C ),20 分钟 X3 次;使用DIG核酸检测试剂盒(罗氏诊断公司)来进行检测。利用体内切割从经过筛选获得的噬菌体克隆中切出质粒。在这些质粒中，决定了含有相当于序列号1的第 5833 60 位碱基的序列的质粒中插入长度最长的质粒pBMaACC-p38的碱基序列。质粒 pBMaACC-P38含有序列号4的第1892 6865位碱基序列。从与已知的乙酰辅酶A羧化酶同源物的比较、有无起始密码子等来看，认为该克隆并不含有MaACC的全长。因此，为了得到MaACC的全长，如下所述，使用5，-Full RACE Core Set (TaKaRa Bio)，根据协议(protocol)进行3次5，-RACE。总RNA使用与构建上述cDNA文库时使用的总RNA相同的总RNA。为了进行5’ -RACE(第1次)，根据pBMaACC_P38的插入的碱基序列，设计以下引物。ACC-RT-I 引物pTGGTGCCGGGTTGCT (序列号 8)ACC-Sl-I 引物GCAAACTTGTTCGCTACCTTG(序列号 9)ACC-Al-I 引物TCGTTCTCCTTCTCCAACAA (序列号 10)ACC-S2-1 引物CAGGCCTATGCTGAGATTGAG (序列号 11)ACC-A2-1 引物TGGACCTCTTCCAACGAGTAA (序列号 12)5，-RACE (第1次)，将利用ACC-S2-1引物和ACC-A2-1引物扩增的DNA片段进行 TA克隆，在得到的克隆中，将含有MaACC的部分序列的最长的克隆作为pCRMaACC-P2-5。该克隆含有序列号4的第1183 2011位的碱基序列。根据该序列，为了进一步进行5，-RACE (第2次)，设计了以下的引物。5，-RACE(第 2 次)ACC-RT-2 引物pCAGGGCGTTCAGCAGTG (序列号 13)ACC-S1-2 引物CGAGTACTTGATCCGCCTTT (序列号 14)ACC-A1-2 引物GGAAATCACCACGAATGGAG (序列号 15)ACC-S2-2 弓丨物GGAGTTCGAGGAAAACACCA (序列号 16)ACC-A2-2 引物TGACCACGATCCTGTCCATA (序列号 17)
在5，-RACE (第2次)中，将利用ACC-S2-2弓丨物和ACC-A2-2弓丨物扩增的DNA片段进行TA克隆，在得到的克隆中，将含有MaACC的部分序列的最长的克隆作为pCRMaACC-P7-15。 该克隆含有序列号4的第738 1522位的碱基序列。根据该序列，为了进一步进行5’ -RACE(第3次)，设计了以下引物。5，-RACE(第 3 次)ACC-RT-3 引物pTCGGGCTTGGCAATG (序列号 18)ACC-S1-3 引物ATCTGGAGGTCCAGCTTTTG (序列号 19)ACC-A1-3 引物GCGTTACCAGCCAACTTCAT (序列号 20)ACC-S2-3 引物GCGTCGCCATCAGAAGATTA (序列号 21)ACC-A2-3 弓丨物AGGCCTGAGCGAACTTTTCT (序列号 22)在5，-RACE (第3次)中，将利用ACC-S2-3弓丨物和ACC-A2-3弓丨物扩增的DNA片段进行TA克隆，在得到的克隆中，将含有MaACC的部分序列的最长的克隆作为pCRMaACC-P9-2。 该克隆含有序列号4的第1 792位的碱基序列，从与已知的乙酰辅酶A羧化酶同源物的比较等来看，认为含有MaACC的起始密码子。通过连接这样得到的序列，得到了含有MaACC 的CDS全长的cDNA序列的序列号4的序列。然后，按照如下所述构建含有序列号4的质粒。首先，将用限制性内切酶NotI和限制性内切酶BamHI酶切质粒pBMaACC_P38得到的约81Λρ的DNA片段与用限制性内切酶NotI (位于载体pCR2. 1的MCS、MaACC的5，上游侧)和限制性内切酶BamHI酶切质粒 pCRMaACC-P2-5得到的约0. 8kbp的DNA片段连接，得到质粒pBMaACC_P4。另一方面，使用与构建上述cDNA文库时使用的相同的总RNA，通过Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(用于 RT-PCR 的 Superscript —级合成系统)Qnvitrogen)，使用随机引物合成了 cDNA。进而，以此为模板，利用引物ACC-NotI :GCGGCGGCCGCTCCCACTGACTCAAGCGG(序列号23)和ACC-A1-2引物，使用ExTaq (TaKaRa Bio)进行PCR，对得到的DNA片段进行TA克隆。将用限制性内切酶NotI和限制性内切酶^CbaI酶切含有序列号4的第1 1578位的正确碱基序列的克隆得到的约1. 5kb的DNA片段与用限制性内切酶NotI和限制性内切酶 XbaI酶切质粒pBMaACC-P4得到的约8. 4kb的DNA片段进行连接，得到质粒pB_MaACC。(2)序列分析对于如上所述得到的来自M. alpina的ACC (MaACC)的cDNA序列(序列号4)进行 ORF分析。其结果推定，本发明的ACC的CDS区域相当于序列号4的第45 6734位的序列 (序列号3)，ORF区域相当于序列号4的第45 6731位的序列(序列号1)。来自M. alpina 的ACC(以下有时记为“MaACC”)的cDNA序列(序列号4)和推定氨基酸序列(序列号2) 如图1所示。进而，相对于在GENEBANK中注册的氨基酸序列，使用BLASTX对序列号4进行同源性分析。其结果显示MaACC与真核微生物的ACC同源物有同源性，但在已知氨基酸序列中同一性最高的是来自米根酶(Miizopus oryzae)的推定蛋白质R03G_04977。利用ClustalW 来求出与该序列相关的碱基序列的CDS和MaACC的CDS的碱基序列的同一性、以及氨基酸序列和MaACC蛋白质的推定氨基酸的同一性时，分别为65. 5%、66. 3%。与来自其它菌类的ACC同源物的推定氨基酸序列的同一性，与来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(注册号EAA33781)的同一性为58. 8 %，与来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(注册号 EAL93163)的同一性为58. 3 %，此外，与酿酒酵母(S. cerevisiae)的细胞质ACC的Acclp 的同一性为55. 1%，与线粒体ACC的Hfalp的同一性为44. 7%。另一方面，来自M. alpina CBS5^. 72株的ACC同源物的部分序列已注册于 Genbank中(核酸序列注册号AJ586915 (非专利文献6)(序列号M)、氨基酸序列注册号 CAE52914(序列号25))。将这些序列与本次得到的来自M. alpinalS-4的cDNA全长序列、 推定氨基酸序列进行比对。核酸序列的比对如图2所示，氨基酸序列的比对如图3所示。 上述注册号AJ586915的碱基序列的⑶S部分相当于序列号4的第342 1439位的碱基序列，仅用该部分进行比对时同一性为91. 3%。此外，注册号CAE52914的氨基酸序列相当于序列号2的第100 465位的氨基酸序列，仅用该部分比对时同一性为97. 8%。〔实施例3〕表汰载体的构建用限制性内切酶EcoRI酶切酵母表达载体pYE22m，通过末端平滑试剂盒 (Blunting Kit) (TaKaRa Bio)进行末端平滑化。在其中插入NotI接头(p-GCGGCCGC 序列号26)，构建载体pYE22mN。将用限制性内切酶NotI、Sail酶切载体pYE22mN后的产物与用限制性内切酶NotI、XhoI酶切质粒pB-MaACC得到的约6. 9kb的片段通过予混合连接试剂(Ligation high)(东洋纺)进行连接，得到质粒pYE-MaACC。接着用限制性内切酶 HindIII酶切质粒pYE-MaACC，通过末端平滑试剂盒(Blunting Kit) (TaKaRa Bio)进行末端平滑化后插入质粒PUC-URA3的SmaI位点，构建质粒pUC_URA3_MaACC。通过用限制性内切酶HindIII酶切该质粒，将酵母Aura3株转化，可在酵母染色体上的URA3下游插入来自 M. alpina的ACC的表达盒。〔实施例4〕来自M. alpinalS-4株的导入ACC表达盒的酵母的获取和随机孢子分析在酵母的细胞质ACC基因缺陷的杂合二倍体(Heterozygous Diploid)的酵母灭活(knock out)株 YSC1021-673427 株(Δ accl :KanMX/ACCl、his3 Δ l/his3 Δ 1、leu2A0/ leu2 Δ O、ura3 Δ 0/ura3 Δ O、LYS2/lys2 Δ O、MET15/metl5 Δ O、Open biosystems)中导入用限制性内切酶HindIII酶切实施例3中构建的pUC-URA3-MaACC而得到的DNA片段从而进行转化。转化株以在SD-Ura琼脂培养基上生长发育为指标来选择。将这样选择的任意株作为 MaACC-HD-Sl 株、MaACC_HD_#2 株(Δ accl :KanMX/ACCl、his3 Δ l/his3 Δ 1、leu2 Δ O/ leu2Δ O、MaACC-URA3/ura3Δ O、LYS2/lys2Δ O、MET15/metl5 Δ 0)。为了形成MaACC-HD_#l株及MaACC_HD_#2株的孢子，将这些菌株涂布于YPD琼脂培养基上，在30°C培养2天。将生长发育的菌体涂布于孢子形成琼脂培养基(1%乙酸钾、 0. 酵母提取物、0.05%葡萄糖、2%琼脂)上，在25°C培养4天。从得到的菌体中取1白金耳，悬浮于Zymoliase (—种酶)溶液(1. 2M山梨糖醇、50mM磷酸钾缓冲液(pH7. 5)、14mM 2-巯基乙醇、0. 2mg/ml Zymoliase ( —种酶)IOOT (生物化学工业))Iml中，在30°C—边振荡一边处理M小时。然后通过离心分离收集菌体除去上清。在菌体中加入Iml灭菌水，剧烈搅拌后通过离心分离收集菌体，除去上清。进一步将上述操作重复2次。用灭菌水将得到的菌体适当稀释，涂布于YPD琼脂培养基上，形成单菌落。将得到的菌落随机各取100株(共计200株)分别影印接种到YPD、YPD+G418 (200mg/L)、SD_Ura、SD-Met, SD-Lys的各琼脂培养基上，确认各自在培养基上的生长发育状况。结果如表1所不。[表 1]表1酵母的细胞质ACC基因缺失的杂合二倍体的转化株的生长发育
权利要求
1.一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中的任一项，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列。
3.—种核酸，其特征在于，为以下(a) (c)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有序列号1所示的碱基序列或其部分序列，(b)核酸，其含有编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列，(c)核酸，其含有序列号4所示的碱基序列或其部分序列。
4.一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列。
5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中的任一项，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2 X SSC、50°C的条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性的蛋白质的碱基序列。
6.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性。
7.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性。
8.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性。
9.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有与酵母的乙酰辅酶A羧化酶缺陷互补的活性。
10.一种蛋白质，其特征在于，为由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
11.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1 5中任一项所述的核酸。
12.一种转化体，其特征在于，为被权利要求11所述的重组载体转化的转化体。
13.一种脂肪酸组合物，其特征在于，为通过培养权利要求12所述的转化体而得到的脂肪酸组合物。
14.权利要求13所述的脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养权利要求12所述的转化体而得到的培养物中提取权利要求13所述的脂肪酸组合物。
15.一种食品，其特征在于，含有权利要求13所述的脂肪酸组合物。
16.一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性的蛋白质的碱基序列。
17.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由在序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性，(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可使宿主本来具有的花生四烯酸含量升高的活性。
全文摘要
本发明提供新型乙酰辅酶A羧化酶。本发明的上述课题通过本发明的序列号1的碱基序列及序列号2的氨基酸序列来解决。
文档编号A23L1/30GK102395676SQ20108001288
公开日2012年3月28日 申请日期2010年3月17日 优先权日2009年3月18日
发明者小川顺, 樱谷英治, 清水昌, 落合美佐 申请人:三得利控股株式会社