专利名称：一种调节性t细胞的诱导培养方法
技术领域：
本发明属于免疫学与表观遗传学研究领域，涉及应用细胞因子联合DNA去甲基化药物协同诱导调节性Y ST细胞生成的培养方法。
背景技术：
γ δ T细胞具有独特的结构和生物学功能，在外周血和淋巴器官中所占比例很小 (1-5%)，以前一直为研究者们忽略。自从Kimzmarm等首次发现γ δ T细胞能够大量扩增后，越多越多的学者开始致力于该类细胞群体的研究。目前，Y δ T细胞的体外扩增和纯化已经成为一种常规技术；为此，该类细胞的生物学功能日渐明确。研究者们已发现Y δ T细胞在抗感染和抗肿瘤方面发挥着举足轻重的作用，并且其过继免疫治疗已在临床上得到了广泛应用，很多患者从中受益。调节性Y δ T细胞作为γ δ T细胞的一种亚群，于 2009年9月由意大利学者Casetti首次发现，其免疫表型与调节性T细胞一样表达叉头蛋白3 (F0XP3)转录因子，该细胞表现出了强大的免疫抑制功能，具有潜在的治疗自身免疫性疾病、实体器官移植排斥反应和造血干细胞移植后移植物抗宿主病的作用。但是目前对调节性Y δ T细胞的其他生物学特性知之甚少，与该群细胞相关的研究更是屈指可数，考虑与调节性Y δ T细胞在体内数量极少和现有扩增方法效率偏低从而不能保证体内外研究中所需要的足够细胞数量有关。不能获得足够数量的调节性Y δ T细胞成为制约其深入研究的瓶颈。因此，如何提高调节性Y S T细胞的诱导效率成为目前迫切需要解决的难题。
发明内容
本发明的目的是克服现有研究方案中诱导效率偏低的缺点，提供一种调节性T细胞的诱导培养方法，涉及提供一种调节性Y δ T细胞的诱导培养方法，能为进一步明确调节性Y δ T细胞的生物学特性提供研究平台。本发明通过以下步骤实现
(1)人单个核细胞制备取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培养液重悬细胞；
(2)单个核细胞分组将所获得的单个核细胞随机分为常规方法诱导组和改进方法诱导组常规方法诱导组为单用细胞因子和唑睞磷酸诱导，改进方法诱导组为细胞因子、唑睞磷酸联合地西他滨协同诱导，两组细胞分别设置3个复孔；
(3)调节性γδ T细胞诱导步骤(1)中所制备的单个核细胞接种当日按第0天计算， 两组细胞分别在第0天加用唑睞膦酸激活γ δ T细胞，加用白介素-2(IL-2)、白介素-15 (IL-15)和转化生长因子-β 1 (TGF-β 1)细胞因子诱导调节性γ δ T细胞的生成，第1天在改进方法诱导组中加入地西他滨，接着两组细胞分别于第3、6、9天进行半量换液，每次换液时加入新鲜IL-2、IL-15和TGF-β 1细胞因子，浓度同前，于第10天分别对两组细胞进行调节性Y δ T细胞数量含量的检测；
(4)调节性γδ T细胞数量含量检测收集步骤(3)中的细胞，采用流式细胞术分别检测 δ T细胞和调节性 δ T细胞数量含量，以F0XP3和T细胞受体γ δ (TCR γ δ )双阳性细胞作为调节性Y δ T细胞的表型特征，TCR γ δ阳性作为Υ δ T细胞的表型特征，并根据以下公式计算调节性、δ T细胞占总、δ T细胞的数量百分含量
调节性Y δ T细胞数量百分含量(％)= F0XP3和TCR γ δ双阳性细胞/ (FOXP3和 TCR γ δ双阳性细胞+ F0XP3阴性TCR γ δ单阳性细胞)X 100 ；
(5)调节性γδ T细胞富集采用免疫磁珠阳性分选(MACS)方法无菌分选TCR γ δ 阳性细胞群，该群细胞内富含调节性Y S T细胞；
(6)富集后细胞状态和活力检测富集后细胞加用IL-2、IL-15和TGF-β1细胞因子继续培养2天后用倒置相差显微镜和台盼兰染色查看细胞状态和活力，以细胞透亮度好、形态不规则和聚集成团作为细胞生长状态佳的标准；台盼兰染色观察细胞活力时，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，并根据以下公式计算细胞活力 活细胞率(％)=活细胞总数/ (活细胞总数+死细胞总数)XlOO
本发明是通过应用细胞因子联合DNA去甲基化药物地西他滨协同诱导调节性γ δ T 细胞的生成和采用MACS阳性分选的富集过程，并在富集后进行细胞生长状态及活力检测以确保用于下一步实验。其具有如下特点(1)诱导和富集过程简单易行，周期短，成本低廉；(2)诱导效率高，重复性好；(3)富集后细胞活力好，富集后细胞数量和活力均能保证下一步的体内和体外研究，能为明确调节性Y δ T细胞的生物学特性提供很好的研究平台， 具有很好的推广价值。
图1是单用细胞因子和唑睞磷酸的常规方法诱导调节性Y δ T细胞的流式分析图。图2是用细胞因子、唑睞磷酸联合DNA甲基化转移酶抑制剂地西他滨(0. 5 μ mol/ ml)的改进方法诱导调节性Y δ T细胞的流式分析图。图3是改进方法诱导培养的细胞在经MACS阳性分选富集后的流式分析图。图4是改进方法诱导培养的细胞在第12天未经MACS分选的细胞生长状态图。图5是改进方法诱导培养的细胞经MACS阳性分选后培养2天的细胞生长状态图。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。本实验所用细胞因子均购自美国PeproTech公司，流式细胞术检测用单克隆荧光抗体购自eBioscience公司，唑睞膦酸(商品名择泰)为诺华制药有限公司赠送，地西他滨 (商品名达珂)为西安杨森制药有限公司赠送，YS T细胞MACS分选试剂盒购自德国美天旎生物技术公司。本实验重复了 5名正常志愿者外周血标本，均取得了类似效果。实施例1:调节性Y δ T细胞的诱导
(1)在15ml离心管中加入7ml淋巴细胞分离液；
(2)取肝素抗凝静脉血10ml与等量Hank’ s液充分混勻，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心600gX20分钟；
(3)离心后见管内分为三层，上层为血浆和Hank’s液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带；
4(4)用滴管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一15ml离心管中，加入5倍体积的 Hank's液，300gX5分钟离心，洗涤细胞2次；
(5)末次离心后，弃上清，加入含有10%胎牛血清和1%双抗的完全RPMI1640培养液， 重悬细胞，调整细胞密度至4X 106/ml ；
(6)将细胞接种于M孔板，分为常规方法诱导组和改进方法诱导组，各组分别设立3个复孔，每孔1ml，各孔于第0天加用细胞因子和唑睞膦酸，量及终浓度如表1所示；改进方法诱导组各孔于第1天加用地西他滨，量如表1所示，终浓度为0. 5 μ mol/L ；接着于第3、6、 9天两组细胞各孔均进行半量换液，每孔去除0. 5ml培养液，再加入新鲜含10%胎牛血清的 PRMI 1640完全培养液0.5ml，并加入细胞因子，各孔细胞因子量见表2。各种细胞因子储存浓度IL-2为10000U/ml，IL-15为10 μ g/ml，TGF_3 1为1 μ g/ml ；地西他滨储存浓度为 lmmol/ml ；唑睞膦酸储存浓度为56mmol/ml。
权利要求
1.一种调节性Y δ T细胞的诱导培养方法，其特征在于通过以下步骤实现(1)人单个核细胞制备取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培养液重悬细胞；(2)单个核细胞分组将所获得的单个核细胞随机分为常规方法诱导组和改进方法诱导组，常规方法诱导组为单用细胞因子和唑睞磷酸诱导，改进方法诱导组为细胞因子、唑睞磷酸联合地西他滨协同诱导，两组细胞分别设置3个复孔；(3)调节性γδ T细胞诱导步骤(1)中所制备的单个核细胞接种当日按第0天计算， 两组细胞分别在第0天加用唑睞膦酸，加用白介素_2、白介素-15和转化生长因子-β 1细胞因子，第1天在改进方法诱导组中加入地西他滨，接着两组细胞分别于第3、6、9天进行半量换液，每次换液时加入新鲜白介素_2、白介素-15和转化生长因子- β 1细胞因子，于第 10天分别对两组细胞进行调节性Y δ T细胞数量含量的检测；(4)调节性γδ T细胞数量含量检测收集步骤(3)中的细胞，采用流式细胞术分别检测Y δ T细胞和调节性γ δ T细胞数量含量，以叉头蛋白3和T细胞受体γ δ双阳性细胞作为调节性Y δ T细胞的表型特征，TCR γ δ阳性作为Υ δ T细胞的表型特征，并根据以下公式计算调节性Y δ T细胞占总γ δ T细胞的数量百分含量调节性Y δ T细胞数量百分含量(％)=叉头蛋白3和TCR γ δ双阳性细胞/ (叉头蛋白3和TCR γ δ双阳性细胞+叉头蛋白3阴性TCR γ δ单阳性细胞)X 100 ；(5)调节性、δT细胞富集采用免疫磁珠阳性分选方法无菌分选TCR γ δ阳性细胞群，该群细胞内富含调节性Y S T细胞；(6)富集后细胞状态和活力检测富集后细胞加用白介素_2、白介素-15和转化生长因子- β 1细胞因子继续培养2天后用倒置相差显微镜和台盼兰染色查看细胞状态和活力。
2.根据权利要求1所述的一种调节性Yδ T细胞的诱导培养方法，其特征在于步骤 (6)以细胞透亮度好、形态不规则和聚集成团作为细胞生长状态佳的标准；台盼兰染色观察细胞活力时，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，并根据以下公式计算细胞活力活细胞率(％)=活细胞总数/ (活细胞总数+死细胞总数)XlOO。
全文摘要
本发明提供一种调节性T细胞的诱导培养方法，涉及调节性γδT细胞的诱导培养方法。本发明是通过应用细胞因子联合DNA去甲基化药物地西他滨协同诱导调节性γδT细胞的生成和采用MACS阳性分选的富集过程，并在富集后进行细胞生长状态及活力检测以确保用于下一步实验。本发明方法诱导和富集过程简单易行，周期短，成本低廉；诱导效率高，重复性好；富集后细胞活力好，富集后细胞数量和活力均能保证下一步的体内和体外研究，能为明确调节性γδT细胞的生物学特性提供很好的研究平台，具有很好的推广价值。
文档编号C12N5/0783GK102168067SQ20111003568
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月11日 优先权日2011年2月11日
发明者吴康妮, 胡永仙, 黄河 申请人:浙江大学