专利名称：一种寡氨基酸质粒的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学相关领域，涉及聚合酶链式反应，更具体是涉及一种寡氨基酸质粒的构建方法，该方法在基因工程、蛋白质工程、酶工程和医疗诊断等领域有较大的应用价值。
背景技术：
点突变技术是分子生物学的常用技术，广泛用于寻找蛋白质的功能氨基酸，人工设计蛋白质等等。在质粒上进行点突变可以设计两条互补的引物，引物包含所需的突变，在合适的反应体系和条件下进行聚合酶链式反应。反应产物经消化后转化到宿主细胞体内， 在带抗生素的平板上培养，挑取阳性单克隆测序确定是否为携带目的突变质粒的菌种。这种方法适合单氨基酸突变，对于多氨基酸突变，该方法由于引物与模板的非配对碱基的增多，PCR效率会大大降低，甚至无法有效进行。寡氨基酸突变也是分子生物学的常用技术，包括寡氨基酸的插入，替换和缺失。被广泛用于寻找蛋白质的功能氨基酸序列，人工设计工程蛋白，等等。但是，由于突变碱基序列较长，常用的点突变方法不适用与寡氨基酸突变。因此， 目前使用比较广泛的质粒寡氨基酸突变法是设计两段引物，分别与正义链和反义链互补， 从突变位点向两端延伸，其中一条携带目标寡氨基酸的碱基序列。在适当条件下经过聚合酶链式反应后，反应产物为携带寡氨基酸突变的线性双链。再经过平末端连接酶处理，使线性双链两端连接起来，形成一个新的质粒，这就是目的突变质粒。经模板消化后将其转化进入宿主细胞体内，在带抗生素的平板上培养，挑取阳性单克隆测序确定是否为携带目的突变质粒的菌种。然而，连接酶连接平末端具有效率低，易出错等缺点。之前我们采用这种方法进行突变的结果表明，转化得到的阳性克隆很少，有时甚至没有，而且得到的阳性克隆经测序后也有不少为错误结果。因此，如果能将平末端连接改为粘性末端连接，那么连接效率会大大提尚。
发明内容
本发明目的是在于提供了一种寡氨基酸质粒的构建方法，该方法操作简单，实验周期短，使用的工具酶的种类少，对引物质量的要求低，同时能够实现多个氨基酸的改变。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施本发明将传统的一步法改进为两步法，设计两对引物，每一对对应为传统的寡氨基酸突变法的引物。区别是其中一对携带的寡氨基酸突变碱基序列位于正向引物，另一对携带的寡氨基酸突变碱基序列位于反向引物。经第一步聚合酶链式反应后，每一反应体系反应产物均为携带突变序列的线性双链。 将两反应体系混合，再变性，复性。变性过程中，两对线性双链打开为四条单链，两条正义链，两条反义链。
复性过程中，有两种可能。一种可能是重新还原形成变性前的双链，两端为平末端。另一种可能是其中一个反应体系的正义链与另一反应体系的反义链配对，形成两端为粘性末端的线性双链。由于设计引物时，携带寡氨基酸突变的碱基序列分别位于一个反应的正向引物和另一个反应的反向引物，为互补序列，因此，形成的两端为粘性末端的线性双链可以通过粘性末端的配对自环化，形成一个环形质粒。这样的质粒转化进入宿主细胞，经过修复后，形成一个成熟的质粒就是目的突变质粒。对于寡氨基酸缺失突变，情况复杂一些，因为按常规方法设计引物没有互补的粘性末端存在。申请人采用的改进方法是将缺失突变改造为替换突变，具体方法是设计引物时向突变位点外延伸一定长度的碱基序列，然后用这段序列替换这段序列加上缺失突变序列。综上所述，通过将一步法改进为两步法，就有一定的概率生成可粘性末端连接的产物。不但大大提高了连接产率，还可以省略连接酶的使用，因为转化进入宿主细胞本身可进行修复。一种寡氨基酸质粒的构建方法，其步骤是A、引物设计，设计并合成两对引物(分别为a，b和c，d)；所述的引物a为短反向引物，以质粒正义链为模板，引物完全与质粒正义链突变位点外5’端互补。所述的引物b为长正向引物，以质粒反义链为模板，引物3’端完全与反义链突变位点外5’端互补，引物5’端与突变位点密码子序列相同。所述的引物c为长反向引物，以质粒正义链为模板，引物3’端与完全与正义链突变位点外5’端互补，5’端与突变位点密码子序列逆互补。所述的引物d为短正向引物，以质粒反义链为模板，引物完全与质粒反义链突变位点外5’端互补。所述的变性过程为置于90，94，98度，恒温2，6，10分钟；所述的复性过程为置于50，55，60度，恒温1，3，5分钟；B、将两对引物(a、b、c、d、)与同一质粒模板分别进行聚合酶链式反应；C、将B步骤中两个反应溶液混合，再经过变性和复性的过程；D、模板消化后直接转化进入宿主细胞，培养过夜，挑取单菌落测序鉴定氨基酸突变是否完成。所得到的质粒可以直接转化到大肠杆菌的表达性菌株BL21中，从而诱导表达所需要的蛋白质。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果方法简单且易于操作，材料试剂相对低廉，省略了线性质粒平末端连接酶连接步骤，能显著提高质粒寡氨基酸突变的连接效率，有利于工业或医用放大生产。有利于工业或医用放大生产。本室用该方法成功构建了近50种蛋白质的突变体，测序的成功率高达 66%，是传统方法的5倍以上。
图1为一种一种寡氨基酸质粒的构建方法的引物设计示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)。实施例1 将寡氨基酸VQIINK从Tau蛋白的截短片段K18中删除，以下是具体根据K18的氨基酸序列和cDNA序列来设计引物，实现定点删除VQIINK的功能。K18的氨基酸序列(K18的基因序列来自NCBI，含全长Tau序列的质粒pRK172Tau 参见 Vana，L.and Kanaan，N. Μ. Biochemistry 2011,50,1203-1212)QTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKP VDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIEK18 的 DNA 序列CAGACAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTG AAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGG CTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGG TGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCTGAGAAG CTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGMGATTGGGTCCCTGGACAATATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAM AAGATTGAA。(这些序列是引物设计的基础，在引物设计的过程中要用到。)一种寡氨基酸质粒的构建方法，其步骤是A、引物设计，设计并合成两对引物(分别为a，b和c，d)；所述的引物a为短反向引物，以质粒正义链为模板，引物完全与质粒正义链突变位点外5，端互补，引物a为CTTCCCGCCTCCCGGCTGG ；所述的引物b为长正向引物，以质粒反义链为模板，引物3’端完全与反义链突变位点外5’端互补，引物5’端与突变位点密码子序列相同，引物b为CCAGCCGGGAGGCGGGAAGAAGCTGGATCTTAGCAACG ；所述的引物c为长反向引物，以质粒正义链为模板，引物3’端与完全与正义链突变位点外5’端互补，5’端与突变位点密码子序列逆互补，引物c为AAGCTGGATCTTAGCAACG ；所述的引物d为短正向引物，以质粒反义链为模板，引物完全与质粒反义链突变位点外 5’ 端互补，引物 d 为CGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTCCCGCCTCCCGGCTGG ；所述的变性过程为置于90，94，98度，恒温2，6，10分钟；所述的复性过程为置于50，55，60度，恒温1，3，5分钟；B、将两对引物(a、b、C、d、)与同一质粒模板分别进行聚合酶链式反应；聚合酶链式反应的反应体系为2. 5 μ L 缓冲液 10XPCR Buffer for KOD-Plus-；2· 5 μ L 2mM dNTPs ；1 μ L质粒模板；2 μ L 25mM MgSO4 ；反应溶液1 :1 μ L引物a禾口 1 μ L引物b，反应溶液2 1 μ L引物C禾口 1 μ L引物d ；
0. 5 μ L 酶 KOD-Plus-； 14. 5 μ L双蒸水至总体积25 μ L。
反应程序为Sl :98°C,3min ；S2 :98°C,30s ；S3 :72°C, lmin/kb ；重复S2 和 S325-;35 次；C、将B步骤中的反应溶液1和反应溶液2混合，再经过变性和复性的过程。变性过程为置于90，94，98度，恒温2，6，10分钟；复性过程为置于50，55，60度，恒温1，3，5分钟；D、模板消化后直接转化进入宿主细胞大肠杆菌BL21 (来自武汉大学典型培养物保藏中心)；具体操作方法为用DnpI酶消化PCR反应产物，具体反应体系为17yL，2yL Tango缓冲液，1 μ L DnpI酶。反应条件为37°C，30min。用反应产物转化大肠杆菌LB21的
感受态，挑选单克隆并测序鉴定。获得一种寡氨基酸质粒。E、测序结果准确所述的寡氨基酸质粒中含有一种蛋白质的核苷酸序列，其序列如 SEQ ID NO. 1 所示。上述测序结果表明，编码VQIINK的基因序列已经在SEQ ID NO. 1中被删除。
权利要求
1.一种寡氨基酸质粒的构建方法，其步骤是A、引物设计，设计并合成两对引物，分别为a，b和c，d；所述的引物a为短反向引物，以质粒正义链为模板，引物完全与质粒正义链突变位点外 5，端互补，引物 a 为:CTTCCCGCCTCCCGGCTGG ；所述的引物b为长正向引物，以质粒反义链为模板，引物3’端完全与反义链突变位点外5’端互补，引物5’端与突变位点密码子序列相同，引物b为CCAGCCGGGAGGCGGGAAGAAG CTGGATCTTAGCAACG ；所述的引物c为长反向引物，以质粒正义链为模板，引物3’端与完全与正义链突变位点外5’端互补，5’端与突变位点密码子序列逆互补，引物c为AAGCTGGATCTTAGCAACG ；所述的引物d为短正向引物，以质粒反义链为模板，引物完全与质粒反义链突变位点外 5’ 端互补，引物 d 为CGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTCCCGCCTCCCGGCTGG ； 所述的变性过程为置于90，94，98度，恒温2，6，10分钟； 所述的复性过程为置于50，55，60度，恒温1，3，5分钟；B、将两对引物a、b、c、d与同一质粒模板分别进行聚合酶链式反应； 聚合酶链式反应的反应体系为2.5 mL 缓冲液 10XPCR Buffer for KOD - Plus-； 2. 5 mL 2 mM dNTPs；1mL质粒模板；2mL 25 mM MgSO4 ；反应溶液1 :1 mL弓丨物a禾口 1 mL引物b，反应溶液2 1 mL弓丨物c禾口 1 mL引物d;0. 5 mL 酶 KOD -Plus-；14. 5 mL双蒸水至总体积25 mL ；反应程序为Si:98°C,3 min ；S2:98°C,30 s;S3:72°C,1 min/kb重复S2和S3 25-35次；C、将(B)步骤中的反应溶液1和反应溶液2混合，再经过变性和复性的过程； 变性过程为置于90，94，98度，恒温2,6,10分钟；复性过程为置于50，55，60度，恒温1，3，5分钟；D、模板消化后直接转化进入宿主细胞大肠杆菌BL21；具体操作方法为用DnpI酶消化PCR反应产物，具体反应体系为17 mL，2 mL Tango缓冲液，1 mL DnpI酶，反应条件为 37° C，30 min，用反应产物转化大肠杆菌LB21的感受态，挑选单克隆并测序鉴定，获得一种寡氨基酸质粒。
2.权利要求1所述的一种寡氨基酸质粒，其特征在于所述的寡氨基酸质粒中含有一种蛋白质的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
全文摘要
本发明公开了一种寡氨基酸质粒的构建方法，其步骤A、引物设计，设计并合成两对引物，分别为a，b和c，d；B、将两对引物a、b、c、d与同一质粒模板分别进行聚合酶链式反应；C、将(B)步骤中混合，再经过变性和复性的过程；D、模板消化后直接转化进入宿主细胞大肠杆菌BL21；用DnpI酶消化PCR反应产物，反应体系为17mL，2mLTango缓冲液，1mLDnpI酶，反应条件为37°C,30min，用反应产物转化大肠杆菌LB21的感受态，挑选单克隆并测序鉴定；E、测序结果准确。方法简单，材料试剂相对低廉，省略了线性质粒平末端连接酶连接步骤，能显著提高质粒寡氨基酸突变的连接效率，有利于工业或医用放大生产。测序的成功率高达66%，是传统方法的5倍以上。
文档编号C12N15/70GK102242141SQ201110099528
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者周拯, 孟生荣, 朱应竹, 梁毅, 莫重瑛, 陈杰 申请人:武汉大学