专利名称：山羊sh2b1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种一种是同义突变多态性，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱 基的“含义”相同；另一种是非同义突变多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等。SSCP可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。胰岛素通过促进骨骼肌和脂肪组织对于葡萄糖的摄取以及抑制肝脏葡萄糖的生成以降低血糖。胰岛素与胰岛素受体结合并使其活化。胰岛素受体酪氨酰(基)使胰岛素受体底物(IRS-1，-2，-3，以及-4)磷酸化。IRS蛋白，特别是IRS-I和IRS-2，可以启动和协调多个下游途径，包括磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号途径。Src同源区2 (SH2) B接头蛋白I (SH2B1 ;原名SH2-B)是接头蛋白家族的一个成员。SH2B1是一组对于许多种信号通路起作用的衔接子，涉及关于一些受体酪氨酸激酶，包括胰岛素受体的信号转导途径。SH2B1是一个异常的内源性胰岛素致敏物，它能够直接同时与胰岛素，IRS-I以及IRS-2相结合，从而通过促进胰岛素受体催化活性和抑制IRS蛋白的酪氨酸脱磷酸作用来增强胰岛素敏感性。在肌肉，肝脏，脂肪组织中，SH2B1形成二聚体，SH2B1 二聚体中的每一个SH2B1分子可同时与胰岛素受体以及IRS-I (或IRS-2)结合，介导复合体的形成，从而保护IRS蛋白免于酪氨酸脱磷酸化，并刺激胰岛素受体的催化活性，从而在整体上激活胰岛素受体的下游通路。因此，研究哺乳动物SH2B1基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。
目前，对于SH2B1基因遗传变异的研究较少，着重在小鼠和人类肥胖症上。国内外关于家畜SH2B1基因遗传变异的研究，除了最近SH2B1基因SNP与中国黄牛生长性状之外，目前在山羊中还未见相关报道。由于SH2B1基因对于维持正常体重，胰岛素敏感性以及葡萄糖代谢所必需，本发明提供的检测方法为SH2B1基因SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的山羊种群。
发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR产物混合测序的方法筛查山羊SH2B1基因的多态性位点，提供了一种山羊SH2B1基因SNP的筛查和检测方法。通过关联分析寻找与山羊体尺性状相关的SNP作为分子标记，以功能SNP作为山羊分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度和提闻种群品质。本发明是通过以下技术方案来实现
本发明根据SH2B1基因的外显子设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物混合并纯化，测序后得到山羊SH2B1基因的部分序列。一种山羊SH2B1基因的单核苷酸多态性，其基因多态性包括在山羊的SH2B1基因第4356位为T或C的碱基多态性；在山羊的SH2B1基因第6033位为G或A的碱基多态性。上述山羊SH2B1基因的单核苷酸多态性的检测方法为以包含SH2B1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对PI、P2为引物，PCR扩增山羊SH2BI基因；所述的引物对Pl为上游引物5’GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’下游引物5’CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’所述的引物对P2为上游引物5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’下游引物5’GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’所述的PCR扩增的反应程序为95°C预变性4min ;94°C变性45s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，32个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为
I.0%。用变性剂对PCR扩增产物进行变性处理，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定山羊SH2B1基因是否有多态。 所述的聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10 %。所述的根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定山羊SH2B1基因存在多态性，第7内含子4356位点有三种带型，分别为TT，TC，CC,第9外显子6033位点有两种带型，分别为GG，GA。本发明对4个山羊品种上述两个SNP进行了基因分型和基因频率分析，同时也对SSCP多态位点与山羊体尺性状之间进行了关联分析。与现有技术相比，本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了 SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种。
I、图I是引物Pl扩增不同山羊个体(山羊SH2B1基因第4356位多态位点)PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；2、图2是引物P2扩增不同山羊个体(山羊SH2B1基因第6033位多态位点)PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；3、图3是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊SH2B1基因序列第4356位T-C突变测序结果图；4、图4是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊SH2B1基因序列第6033位G-A 突变测序结果图；5、图5是本发明山羊SH2B1基因第4356位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图；6、图6是本发明山羊SH2B1基因第6033位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明根据SH2B1基因的保守序列设计引物，分别以4个山羊群体的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和体尺性状的关联分析，筛选出与山羊体尺性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。一、山羊SH2B1基因部分DNA序列的扩增及其多态性的检测I、山羊样品的采集及处理本发明采用了 4个山羊群体共计315个个体，具体为(I)波尔山羊血液样品72份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场；(2)徐淮白山羊血液样品81份，采自江苏省徐州市铜山县吕梁乡；(3)海门山羊血液样品65份，采自江苏省南通海门；(4)波尔山羊X徐淮白山羊耳组织样品46份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场。取山羊血样10mL，加A 0. 5mol/L的EDTA 500 u L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80°C保存备用。取耳组织样，在70%乙醇保存，冰盒低温带回实验室，_80°C保存备用。2、基因组DNA的提取(I)、将冷冻血样室温解冻，转移500 u L至I. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混勻，12000r/min离心IOmin (4°C ),弃去上清液,重复上述步骤至上清液透明、
沉淀呈淡黄色。(2)、在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 U L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提缓冲液的配制:0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH值至8. 0，4°C保存备用。(3)、加蛋白酶K 3iiL(20mg/mL)并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1U L蛋白酶K混匀继续消化至澄清。(4)、将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 u L，温和摇动离心管20min，使其充分混匀，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 I. 5mL离心管中，重复一次。(5)、加氯仿500iiL,充分混勻20min, 4°C, 12000r/min离心IOmin,将上清液转入另一 I. 5mL离心管中。(6)、加0. I倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30 60min。(7)、4°C，12000r/min离心lOmin，弃上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)、4°C, 12000r/min离心lOmin,弃上清,室温下使乙醇挥发干净。(9)、干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE-缓冲液或超纯水，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。耳组织DNA的提取参考文献Sambrock et al (2002)方法。3、扩增引物设计由于GenBank中没有山羊SH2B1基因序列，所以，本发明以牛(GenBank NC_007326. 5)序列为参考，利用Primer 5. 0设计能够扩增包含山羊SH2B1基因第7内含子和第9外显子的PCR引物；扩增第7内含子的引物为上游引物5’GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’下游引物5’CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’扩增第9外显子的引物为上游引物5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’下游引物5，GCGGGAGTTCTGCGAGTC3，以上述引物对扩增了山羊SH2B1基因第7内含子，第9外显子部分区域及一部分内含子区域。4、PCR 扩增分别以4个山羊品种的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为15 U L，见表I ;PCR总反应程序，见表2。表1本发明的PCR反应体系
权利要求
1.山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点，其特征在于所述基因单核苷酸多态性位点包括 在山羊的SH2B1基因第4356位为T或C的碱基多态性位点； 在山羊的SH2B1基因第6033位为G或A的碱基多态性位点。
2.一种检测山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、以包含SH2B1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对Pl和P2为引物，PCR扩增山羊SH2B1基因； 所述的引物对Pl为 上游引物5’ GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’ 下游引物5’ CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’ 所述的引物对P2为 上游引物5’ CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’ 下游引物5’ GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’ (2)、对步骤(I)的扩增产物进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序； (3)、对步骤(2)的纯化产物进行PCR-SSCP检测首先对纯化的PCR产物分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性位点，所述多态性位点包括 在山羊的SH2B1基因第4356位为T或C的碱基多态性位点，表现为TT，TC，CC三种基因型； 在山羊的SH2B1基因第6033位为G或A的碱基多态性位点，表现为GG，GA两种基因型。
3.如权利要求2所述的检测山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为95°C预变性4min ;94°C变性45s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，32个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。
4.如权利要求2所述的检测山羊SH2BI基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。
全文摘要
本发明公开了山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法，以包含SH2B1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2为引物，PCR扩增山羊SH2B1基因，然后进行SSCP多态性的检测。其基因多态性位点包括在山羊的SH2B1基因第4356位为T或C的碱基多态性；在山羊的SH2B1基因第6033位为G或A的碱基多态性。本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种。
文档编号C12N15/11GK102703440SQ20121012245
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者刘宣宣, 张春雷, 房兴堂, 陈宏 申请人:江苏师范大学