专利名称：一种动物组织样的基因组dna提取试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物组织样的基因组DNA提取试剂盒，尤其是能快速、安全、稳定的提取动物各种组织样中的DNA，所用试剂经济、安全，属于生物技术领域。
背景技术：
基因组DNA主要指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子，主要存在于细胞核、线粒体、叶绿体内。基因组DNA的提取是许多分子生物学实验的基础，如普通PCR、PCR-RFLP,PCR-SSCP 和 Southern bot 等。传统提取基因组DNA的方法步骤繁琐，花费时间较长，如果提取较多头动物组织 样时，会耗费大量的人力物力。提取基因组DNA的方法主要包括酚仿抽提法、浓盐法、阴离子去污剂法等。总的方法和原理为
碎化组织样采用眼科剪剪碎法、液氮研磨法或匀浆器研磨法将动物组织样碎化。消化蛋白质采用SDS或苯酚等蛋白变性剂水浴消化蛋白质，分解掉尽可能多的蛋白质。分离析出DNA :先将DNA和RNA这两种核酸中的RNA去除，再将DNA与蛋白质中的蛋白质去除，后用等体积的异丙醇或无水こ醇使DNA析出。洗涤干燥DNA :通过70%こ醇洗涤2次DNA，并于室温干燥。溶解保存DNA :加入一定体积的TE缓冲液或双蒸水(ddH20)，4° C保存。提取过程所用试剂较多，操作复杂且耗时较长。当提取大批量样品中的DNA吋，エ作量会很大。
发明内容
技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供ー种“傻瓜式”动物组织样中的基因组DNA提取方法，操作简单、所用试剂安全经济、提取效率高、DNA纯度好且能快速、充分溶解，以适应大批量样品基因组DNA的提取。技术方案
为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是
一种动物组织样的基因组DNA提取试剂盒，包括细胞裂解液(溶液A)、6 mol/L的NaCl溶液(溶液B)、三氯甲烷(溶液C)、TE缓冲液(溶液D)和蛋白酶K。碎化组织样将动物组织样用剪刀切下20-60 mg，放在ー个I. 5 ml离心管盖里，加100 μ I细胞裂解液，用眼科剪把组织样剪碎，约剪5分钟，然后每管再加入300 μ I的裂解液(溶液A)。消化蛋白质向每个装组织样的离心管内加入15 μ I的蛋白酶K，上下颠倒摇匀，放于65 ° C的振动水浴锅内，水浴2个小吋。分离DNA :将水浴后的样品每管加入200 μ I的6 mol/L的NaCl溶液(溶液B)，然后放在冰块上，再加入500 μ I的三氯甲烷(溶液C)，上下摇动装有样品的盒子10分钟左右，将样品4 °C离心12000转/分，10分钟。析出DNA :取离心管的上清液(约600 μ I)到新的I. 5ML离心管中，对号标上记号，加入1000 μ I无水こ醇(或等体积的异丙醇)，小心的摇动离心管直至DNA析出，静置2分钟。将析出DNA的离心管4 °C离心，12000转/分，5分钟。洗涤DNA :倒出离心管中溶液，加入1000 μ I的70%こ醇，轻弹离心管底部，使DNA浸到液体中，以便充分洗涤；4 ° C离心，12000转/分，2分钟。重复此步骤，洗涤第二
次。 快速干燥DNA :倒出离心管中溶液，用卫生纸吸走管ロ残液，离心甩下管壁上的こ醇，用10 Ul移液器吸走剰余こ醇，倒置5分钟离心管。溶解DNA :加入130-600 ul的TE缓冲液(溶液D)或ddH20，放置4 °C保存过夜，待用。有益效果
试剂盒含有A、B、C、D四种溶液，具有操作简单、提取速度快、成本低廉的特点。本发明先用蛋白酶K将细胞核蛋白中的蛋白质除去，再用高盐溶液对核酸进行提纯，使DNA和RNA分开，最后再用移液器快速干燥DNA，操作简单，不但提取速度快，而且所提取的DNA质量高。本发明通过将DNA提取过程简化，提取试剂组合优化，在保证DNA质量的前提下达到了快速、高效提取的效果组织样只需5分钟剪碎、细胞裂解时间只需2个小吋、DNA干燥只需5分钟，省时省力，特别适用于提取大批量动物组织样本DNA的试验。本发明提取的基因组DNA含量(150-300 ng/μ I)和纯度高(0D260/280 =I. 8-2. 0)，稀释15倍后琼脂糖电泳观察，经琼脂糖检测的条带也很亮，如图I。本发明提取的基因组DNA量大质优，且无蛋白质污染。
图I是本发明实施例所提取基因组DNA的电泳图谱。
具体实施例方式一种动物组织样的基因组DNA提取试剂盒，包括细胞裂解液(溶液A)、6 mol/L的NaCl溶液(溶液B)、三氯甲烷(溶液C)、TE缓冲液(溶液D)和蛋白酶K。取猪耳组织60 mg，放在ー个I. 5 ml离心管盖里，加100 μ I细胞裂解液(溶液Α)，用眼科剪把组织样剪碎，约剪5分钟，然后再加入300 μ I的溶液A和15 μ I的蛋白酶K，上下颠倒摇匀，放于65 ° C的振动水浴锅内，水浴2个小吋。将水浴后的样品每管加入200 μ I的溶液B，然后放在冰块上，再加入500 μ I的溶液C，上下摇动装有样品的盒子10分钟左右，将样品4 0C离心12000转/分，10分钟。取离心管的上清液(约600 μ I)到新的I. 5ML离心管中，对号标上记号，加入1000μ I无水こ醇，小心的摇动离心管直至DNA析出，静置2分钟。将析出DNA的离心管4 °(离心，12000转/分，5分钟。倒出离心管中溶液后，离心管中再加入1000 μ I的70%こ醇，轻弹离心管底部，使DNA浸到液体中，以便充分洗涤；4 ° C离心，12000转/分，2分钟。重复此步骤，洗涤第二次。倒出离心管中溶液，用卫生纸吸走管ロ残液，离心甩下管壁上的こ醇，用10 Ul移液器吸走剰余こ醇，倒置5分钟离心管。加入600 ul的溶液D，放置4 °C保存过夜，待用。以上述方法得到的基因组DNA含量(150-300 ng/μ I)和纯度高(0D260/280 =
I.8-2.0)，稀释15倍后琼脂糖电泳观察，经琼脂糖检测的条带也很亮，如图I。本发明提取的基因组DNA量大质优，且无蛋白质污染。·
权利要求
1.一种动物组织样的基因组DNA提取试剂盒，包括 溶液A :细胞裂解液；溶液B 6 mol/L的NaCl溶液；溶液C :三氯甲烷；溶液D :TE缓冲液和蛋白酶K。
2.权利要求I所述一种动物组织样的基因组DNA提取试剂盒的用法，其特征在于 .1)碎化组织样将动物组织样用剪刀切下20-60mg，放在一个I. 5 ml离心管盖里，力口.100 u I溶液A，再把组织样剪碎，然后再加入300 u I的溶液A ； .2)消化蛋白质向离心管内加入15的蛋白酶K，上下颠倒摇匀，放于65 ° C的振动水浴锅内，水浴2个小时； .3)分离DNA:将水浴后的样品加入200 u I溶液B，然后放在冰块上，再加入500 yl溶液C，上下摇动10分钟，将样品4 °C离心12000转/分，10分钟； .4)析出DNA:取离心管内的上清液600 到新的I. 5ML离心管中，加入1000 yl无水乙醇或等体积的异丙醇，摇动离心管直至DNA析出，静置2分钟；将析出DNA的离心管4.0C离心，12000转/分，5分钟; .5)洗涤DNA:倒出离心管中溶液后，离心管中再加入1000 u I的70% (体积比)乙醇，充分洗涤；4 °C离心，12000转/分，2分钟；重复此步骤，洗涤第二次； .6)快速干燥DNA:倒出离心管中溶液，用卫生纸吸走管口残液，离心甩下管壁上的乙醇，用10 ul移液器吸走剩余乙醇，倒置5分钟离心管； .7)溶解DNA:加入130-600 ul的溶液D或ddH20，放置4 °C保存过夜，待用。
全文摘要
本发明涉及一种动物组织样的基因组DNA快速提取试剂盒，属于生物技术领域。试剂盒含有A、B、C、D四种溶液，具有操作简单、提取速度快、成本低廉的特点。本发明通过将DNA提取过程简化，提取试剂组合优化，在保证DNA质量的前提下达到了快速、高效提取的效果组织样只需5分钟剪碎、细胞裂解时间只需2个小时、DNA干燥只需5分钟，省时省力，特别适用于提取大批量动物组织样本DNA的试验。本发明提取的基因组DNA量大质优，可以用600μl溶液溶解DNA，此溶液稀释15倍后，经琼脂糖检测的条带也很亮，且无蛋白质污染。
文档编号C12N15/10GK102676505SQ201210169838
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者付言峰, 任守文, 方晓敏, 李兰, 李碧侠, 王学敏 申请人:江苏省农业科学院