专利名称：一种纤维素酶水解促进剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶水解促进剂，尤其是一种纤维素酶水解促进剂及其应用。
背景技术：
在化石能源即将消耗殆尽的今天，开发可再生能源是人类维持社会发展的必然趋势。燃料乙醇的使用能降低化石燃料的用量，减轻日益严重的化石环境污染问题，因此世界各国都在大力开发燃料乙醇生产技术。燃料乙醇作为目前应用最为广泛的可再生机动燃料，其商业化生产主要以淀粉和糖类作物为原料，如世界乙醇产量第一大国(巴西)就以甘蔗作为原料进行生产，美国则以玉米作为原料进行生产。近年来，商业化使用玉米等粮食作物进行生产导致粮食价格的上涨，加剧了世界粮食危机，迫使世界各国提倡以非粮食原料进行燃料乙醇的生产与开发。我国作为人口大国，粮食安全显得尤为重要，因此我国也明确 强调开发使用非粮食原料进行乙醇生产。木质纤维生物质作为地球储量最为丰富的生物质资源，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，纤维素和半纤维素通过化学法或者酶法可以降解为单体糖，这些单糖通过微生物酵母发酵可以转化为燃料乙醇。木质纤维原料转化为燃料乙醇过程，因为具有广泛原料来源，工艺环境友好，条件温和，是目前世界研究开发热点。木质纤维原料具有比淀粉类原料更为复杂的结构，纤维素被半纤维素和木质素包裹着，这种结构使得木质纤维原料具有更高的稳定性和抗生物降解性。实现生物转化首先要先将纤维素和半纤维素等多糖类物质降解为微生物能代谢的单糖物质，目前常用酸水解和酶水解。作为传统工艺，酸水解具有较高的效率，但是酸水解工艺对设备要求高，需要脱毒和中和过程，不符合绿色化工原则，不代表未来发展方向。酶水解具有条件温和，环境友好以及水解过程和后期发酵过程兼容性好等特点，是目前研究最多的工艺。植物纤维素资源是地球上最大的可利用的再生资源，有效地水解纤维素为葡萄糖进而发酵为乙醇等，将会减轻人类粮食和能源的压力。但是，酶水解工艺目前还不具备规模化应用的可能，这由三方面的原因导致1、酶生产成本居高，尽管研究致力于不断降低酶生产成本，04年美国的可再生能源实验室将酶生产成本降低到了原来的1/10，酶生产成本仍然达不到规模应用的要求；2、木质纤维原料复杂的结构降低了纤维素酶对纤维素的可及性，也就是降低了酶水解效率，增大酶用量；3、原料中木质素吸附部分纤维素酶组分，这也大大降低酶有效组分浓度。目前，提高纤维素酶水解效率的方法如下1)选育和开发能生产高效酶系的菌株，采用过程集成技术去消除酶浓缩成本从而降低酶生产成本；2)对原料进行预处理提高纤维素酶的可及性，或者采用一些工业废弃木质纤维素作为原料，这些原料通常在其产生过程中已经过了一些处理，具有疏松结构，易于被酶水解；3)采用表面活性剂降低木质素对酶组分的吸附，或者通过一定预处理降低原料中木质素的含量。木质素通过植物的光合作用产生，基本结构为苯丙烷，木质素的存在会阻碍酶与底物的接触，导致酶水解效率降低。采用表面活性剂是行之有效且实用的一种方法，但化学合成表面活性剂合成成本高，同时其生物难降解性会增加下游生物转化和产物分离过程的负担。天然表面活性剂中蛋白类具有独特的优点，其能作为下游生物转化过程的潜在营养-氮源。尽管牛血清蛋白等精制的蛋白提高酶活的效果显著，但其不适合用作酶水解添加剂，因为其同样具有高的生产成本。因此，开发低廉有效的蛋白作为表面活性剂成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种纤维素酶水解促进剂及其在提高纤维素酶水解效率中的应用。所述纤维素酶水解促进剂是将酵母或酵母废弃物加入到水中，混匀，调pH值，力口热处理得到。上述酵母废弃物可进一步离心，取轻相部分处理。其中，调pH值至2.0-7.5，所述加热处理的处理温度100-1211;处理时间5_60mino 本发明还提供一种提高纤维素酶水解效率的方法，包括在纤维素原料中加入上述纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解。具体地，包括以下步骤I)对糠醛渣水溶液进行碱中和、过滤，得到糠醛渣滤渣；2)糖化加入上述纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解，得酶水解液。所述糠醛渣水溶液含有9-12%的糠醛渣，所述碱中和为用固体NaOH中和糠醛渣水溶液至PH5飞，所述糠醛渣滤渣含水量8(Γ85%。所述糖化为处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为3 9%糠醛渣(w/v),纤维素酶用量12-15FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度10g/l-30g/I，糖化温度为45-47 °C，糖化时间48-96h。其中，步骤2)中所述纤维素酶由适应性培养的拟康氏木霉得到。所述拟康氏木霉的适应性培养的条件在2%糠醛渣固体培养基上培养拟康氏木霉菌种的孢子；将孢子用生理盐水稀释；将孢子悬浮液接种到含糠醛渣的液体产酶培养基中培养，所述2%糠醛渣固体培养基组成为4g糠醛渣、200ml Mandels营养盐和4g琼脂，所述液体产酶培养基为马铃薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。在步骤2)得到的酶水解液中进一步加入接种浓度I. 25g/l的酵母或加入接种浓度3g/l的乳酸菌，温度为38-42°C，发酵72-120h，pH值5. 5-6. 5，进行发酵，得到乙醇或乳酸。其中，所述酵母或乳酸菌经步骤I)中所述过滤得到的糠醛渣中和滤液进行适应性培养。适应性培养条件为每kg活菌加入15L糠醛渣中和滤液，使乳酸菌或酵母在发酵使用前提前适应含抑制物发酵液环境。所述乳酸菌的适应性培养的条件为培养温度为30-32°C，培养时间为32_45h，pH 值 6. 0-6. 5，培养基组成KH2PO4 O. 5g/l, MgSO4 · 7Η200· 5g/l, NaCl O. lg/1,固体 CaCO32% (w/v)，糠醛渣中和滤液。所述酵母的适应性培养的条件为培养温度为30_32°C，培养时间为18_24h，pH值
4.5-6. 0，培养基组成=KH2PO4O. 5g/l，MgSO4 · 7H200. 5g/l，糠醛渣中和滤液。
所述纤维素酶水解促进剂的活性组分主要是低分子量的蛋白质或肽类物质，通过酸热处理可使大分子酵母蛋白降解为低分子量物质。本发明的有益效果(I)本发明酶水解促进剂原料酵母价格低廉，来源广泛，其能从工业废弃资源中获得。(2)本发明酶水解促进剂制备工艺简 单，易于实现，和现有工业具有良好兼容性。(3)本发明酶水解促进剂能明显提高酶水解效率。(4)本发明酶水解促进剂具有良好的生物兼容性，其加入基本对后期生物转化无抑制作用。(5)本发明酶水解促进剂能同时作为发酵微生物优良的营养源，其能取代合成培养基，大大降低发酵培养基的成本。(6)本发明原料酵母含有一定量的多糖(约20%)，同样能为生物转化过程提供碳源，实现酵母组分的全利用。(7)本发明原料可降低酶水解木质纤维原料过程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同时较大程度降低下游转化过程化学品的消耗。
图I为本发明的工艺流程。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。质量体积比(w/v)为g/Ι，工业糠醛渣购自河北春蕾集团，含水量55飞0%，pH值2 3。拟康氏木霉菌购自中国工业微生物保藏管理中心。酵母为耐高温型安琪活性干酵母，乳酸菌为嗜热乳杆菌，均为市售商品。实施例II、糠醛渣预处理脱毒过程向10%的糠醛渣水溶液中加入固体NaOH调pH5，搅拌O. 5h后，进行过滤，得糠醛渣滤渣，滤渣含水量80 85%。2、I)制备纤维素酶水解促进剂按照6% (w/v)的比例将纯酵母加入水中，调节pH值为7. O,搅拌IOmin使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度121°C ;处理时间10min，处理液备用。2)制备纤维素酶将在2%糠醛渣固体培养基(4g糠醛渣+200ml Mandels营养盐+4g琼脂)上培养好的拟康氏木霉菌种的孢子用无菌生理盐水稀释至孢子悬浮液的浓度为IX IO8个/mL，将5mL孢子悬浮液接种到含50mL糠醛渣的液体产酶培养基(马铃薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然)的250mL的烧瓶中，并在32°C下，转速150r/min，pH4. 8条件下放入恒温培养振荡器中培养15天得到。3、糖化处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为3%糠醛渣滤渣(w/v)，纤维素酶用量12FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，加水至酶水解体系1L，糖化温度为45°C，糖化时间48h。实施例2步骤同实施例1，不同之处在于纤维素酶水解促进剂浓度为20g/l。实施例3步骤同实施例1，不同之处在于纤维素酶水解促进剂浓度为30g/l。实施例4步骤同实施例1，不同之处在酵母溶液进行加热处理的处理时间60min。实施例5 (对照例) 步骤同实施例1，不同之处在糖化步骤中未加纤维素酶水解促进剂。实施例6I、糠醛渣预处理脱毒过程向10%的糠醛渣水溶液中加入固体NaOH至pH6，搅拌O. 5h后，进行过滤，得糠醛渣滤渣。滤液用于乳酸菌的适应性培养，培养时每公斤活菌加入15L糠醛渣中和滤液。2、I)纤维素酶水解促进剂按照6% (w/v)的比例将酵母废弃物加入水中，调节pH值为7.0，搅拌IOmin使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度121°C;处理时间30min，离心，取轻相部分得到处理液备用。2)制备纤维素酶同实施例I。3)乳酸菌适应性培养培养温度为32°C，培养时间为36h，pH值6. 0，培养基组成KH2PO4 O. 5g/l，MgSO4 · 7H20 O. 5g/l，NaCl O. lg/1,固体 CaCO3 2%(w/v)，糠醛渣中和滤液。3、分步糖化发酵处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为5%糠醛渣(w/v)，不加发酵培养基，加固体CaC035%(w/v)，纤维素酶用量15FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，加水至酶水解体系1L，糖化温度为45°C，糖化时间48h。加入适应性培养过的乳酸菌，乳酸菌接种浓度I. 25g/l，温度为42°C，发酵72h，pH值5. 5，进行发酵。实施例7I、糠醛渣预处理脱毒过程向10%的糠醛渣水溶液中加入固体NaOH至pH6，搅拌O. 5h后，进行过滤，得糠醛渣滤渣。滤液用于乳酸菌的适应性培养，培养时每公斤活菌加入15L糠醛渣中和滤液。2、I)纤维素酶水解促进剂按照6% (w/v)的比例将酵母废弃物加入水中，调节pH值为2.0，搅拌IOmin使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度121°C;处理时间30min，离心，取轻相部分得到处理液备用。2)制备纤维素酶同实施例I。3)乳酸菌适应性培养培养温度为32°C，培养时间为36h，pH值6. 0，培养基组成KH2PO4 O. 5g/l，MgSO4 · 7H20 O. 5g/l，NaCl O. lg/1,固体 CaCO3 2%(w/v)，糠醛渣中和滤液。3、分步糖化发酵处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为9%糠醛渣(w/v)，不加发酵培养基，加固体CaC035%(w/v)，纤维素酶用量15FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，加水至酶水解体系1L，糖化温度为47°C，糖化时间96h。加入适应性培养过的乳酸菌，乳酸菌接种浓度I. 25g/l，温度为42°C，发酵72h，pH值5. 5，进行发酵。实施例8 (对照例)步骤同实施例6，不同之处在于未加纤维素酶水解促进剂。实施例9 (对照例)步骤同实施例6，不同之处在于未加纤维素酶水解促进剂，步骤3中加入发酵培养基，成分=KH2PO4 O. 5g/l ；MgS04 · 7H20 O. 5g/l ；NaC10. lg/1 ;牛肉膏 5g/l。实施例10I、糠醛渣预处理脱毒过程同实施例6。2、1)纤维素酶水解促进剂按照6% (w/v)的比例将纯酵母加入水中，调节pH值 为7. 0，搅拌IOmin使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度121°C;处理时间30min,处理液备用。2)制备纤维素酶同实施例6。3)乳酸菌适应性培养同实施例6。3、葡萄糖发酵67g/l葡萄糖(w/v),加入适应性培养过的乳酸菌,加固体CaCO370g/l，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，乳酸菌接种浓度I. 25g/l，温度为42°C，发酵96h，pH值5. 5，进行发酵。实施例11步骤同实施例9,不同之处在于酵母加热处理时间30min。实施例12步骤同实施例9,不同之处在于酵母加热处理时间60min。实施例13步骤同实施例9，不同之处在于酵母加热处理温度100°C。实施例14 (对照例)步骤同实施例9，不同之处在于未加纤维素酶水解促进剂。实施例15 (对照例)步骤同实施例9，不同之处在于，未加纤维素酶水解促进剂，在步骤3中加入发酵培养基，成分=KH2PO4 O. 5g/l ；MgS04 · 7H20 O. 5g/l ；NaCl 0. lg/1 ;牛肉膏 5g/l。实施例16纤维素酶活性分析1、3%糠醛渣的酶水解生产葡糖糖，如表I。表I 3%糠醛渣酶水解的葡萄糖产量
权利要求
1.一种纤维素酶水解促进剂，其特征在于，将酵母或酵母废弃物加入到水中，混匀，调PH值，加热处理得到。
2.根据权利要求I所述的纤维素酶水解促进剂，其特征在于，所述调PH值为2.0-7. 5 ；所述加热处理的处理温度为100-121°C，处理时间为5-60min。
3.一种提高纤维素酶水解效率的方法，其特征在于，在纤维素原料中加入权利要求I或2所述的纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)纤维素原料处理对糠醛渣水溶液进行碱中和、过滤，得到糠醛渣滤渣； 2)糖化加入所述纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解，得酶水解液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述糖化的条件糠醛渣滤渣浓度3 9% (w/v),纤维素酶用量12-15FPU/g糠醛渣滤渣，纤维素酶水解促进剂浓度IOg/l-30g/l，糖化温度为45-47°C，糖化时间48-96h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述纤维素酶由拟康氏木霉经适应性培养得到。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，拟康氏木霉经适应性培养的条件 1)在2%糠醛渣固体培养基上培养拟康氏木霉菌种的孢子； 2)将孢子用生理盐水稀释； 3)将孢子悬浮液接种到含糠醛渣的液体产酶培养基中培养； 所述2%糠醛渣固体培养基为4g糠醛渣、200ml Mandels营养盐和4g琼脂；所述液体产酶培养基为马铃薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，酶水解液进一步加入酵母生产乙醇或乳酸菌生产乳酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酵母或乳酸菌经步骤I)中所述过滤得到的糠醛渣中和滤液适应性培养，配比为15L滤液1kg活菌。
10.权利要求I所述纤维素酶水解促进剂在提高纤维素酶水解效率中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种纤维素酶水解促进剂及其应用。所述纤维素酶水解促进剂是将酵母或酵母废弃物加入到水中，混匀，调pH值，加热处理得到。本发明的纤维素酶水解促进剂制备工艺简单，易于实现，和现有工业具有良好兼容性，能明显提高酶水解效率，具有良好的生物兼容性，能同时作为发酵微生物优良的营养源，其能取代合成培养基，大大降低发酵培养基的成本，所用原料酵母价格低廉，来源广泛，能为生物转化过程提供碳源。本发明方法可降低酶水解木质纤维原料过程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同时较大程度降低下游转化过程化学品的消耗。
文档编号C12R1/885GK102796718SQ20121028305
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者蒋建新, 唐勇, 赵鹏翔, 朱莉伟 申请人:北京林业大学