细菌纤维素高产发酵培养基及细菌纤维素的发酵方法

专利名称：细菌纤维素高产发酵培养基及细菌纤维素的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌纤维素发酵培养基及细菌纤维素的发酵方法。
背景技术：
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，BC)是一类由微生物产生的纯纤维素，是葡萄糖单体分子以β_1，4-糖苷键聚合而成的高分子聚合物。与植物纤维相比，BC不含木质素和半纤维素，具有优良的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性，被公认为世界上安全的性能优异的新型生物材料。在食品、造纸、声学器材、石油开采和人造皮肤、医用材料等领域有广泛的应用前景。虽然BC因其优越性能，有广泛应用前景，但产量低、附加值高是限制其进一步应用的“瓶颈”，这是菌株本身具有的代谢特性决定的。微生物发酵过程优化的目标在于提高 代谢产物的产量，但是在某种意义上来看结果具有不可预知性，这是由于菌株所具有的代谢特性所造成的。由于发酵过程的非线性、时变性和生物传感器的缺乏以及各参数之间的严重关联，给发酵过程建模带来了很大的困难。发酵过程中因素复杂多变，并且各因素之间的交叉影响，试验因素与其结果之间具有较强的离散性，因此使用常规方法建立的发酵模型相对而言比较粗放，误差大。所以，无法通过常规方法确定细菌纤维素合理的培养基成分和发酵培养参数。

发明内容
本发明是为了解决目前细菌纤维素产量低的问题，而提供的一种细菌纤维素高产发酵培养基及细菌纤维素的发酵方法。本发明细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氢二钠、O. 454% O. 458%的磷酸氢二钾、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的柠檬酸钠和余量的蒸懼水组成。利用上述细菌纤维素高产发酵培养基的细菌纤维素发酵方法按以下步骤实施一、将保存的细菌纤维素产生菌接种到固体培养基上进行菌种平板活化；二、种子培养用接种环挑取固体培养基上活化的细菌纤维素产生菌转接到种子培养基，再放置于温度为30°C、转速为150r/min的恒温振荡培养箱中培养24h,种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸馏水制成；三、发酵培养按体积7%的接种量将种子培养基接入细菌纤维素高产发酵培养基中，然后静置于28°C条件下的恒温电热培养箱中培养7天，即完成细菌纤维素的发酵；步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氢二钠、O. 454% O. 458%的磷酸氢二钾、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始PH值为6. 5。本发明方法适用于多种细菌纤维素产生菌，如汉氏葡糖醋杆菌DHM1_3(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市，武汉大学，保藏日期为2010年12月5日，保藏号为 CCTCC NO :M2010332)、Gluconacetobacter europaeus 和醋化醋杆菌。米用本发明发酵方法发酵培养的汉氏葡糖醋杆菌、Gluconacetobacter europaeus和醋化醋杆菌的细菌纤维素产量大幅提升，增加量均超过80%。通过发酵培养基的改变，改变了细菌纤维素产生菌的代谢流量，其中更是涉及现代代谢工程理论及代谢通量、代谢物组学等方面的因素，因此，本发明不是简单培养基成分的调整。汉氏葡糖醋杆菌DHM1-3(Gluconacetobacter hansenii DHM1-3)为汉氏葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii),属于葡糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter);保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市，武汉大学，保藏日期为2010年12月5日，保 藏号为 CCTCC NO M2010332o


图I是优化前后细菌纤维素发酵代谢流分布。图2是基本细菌纤维素发酵培养基发酵过程曲线图，“ ”曲线为残糖含量曲线，“〇”曲线为乙酸产量曲线，曲线为乙醇残余量曲线，“■”曲线为菌体含量曲线，“▲”曲线为BC产量曲线。图3是具体实施方式
五使用本发明细菌纤维素高产发酵培养基发酵细菌纤维素的过程曲线图，“ ”曲线为残糖含量曲线，“〇”曲线为乙酸产量曲线，曲线为乙醇残余量曲线，“ ■”曲线为菌体含量曲线，“▲”曲线为BC产量曲线。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23 %的磷酸氢二钠、O. 454 % O. 458 %的磷酸氢二钾、2. 22 % 2. 23 %的乙醇、O. 15% O. 25%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成。本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基降低了 HMP途径流量，有利于细菌纤维素的合成；在Acetate节点，减少了进入TCA循环的无效碳循环造成的浪费，从而使更多的代谢流量进入了细菌纤维素合成途径。本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基中乙醇和乳酸的添加，能快速氧化进入TCA循环用于能量生成；另外由于乙醇的快速氧化产生高能荷的ATP，而高能荷的ATP是HMP途径中关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶的抑制剂，从而在满足菌体生长所需能量的条件下，使代谢流量更多的进入细菌纤维素合成方向。本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基可控制发酵过程的pH值，确保更多代谢流量进入菌体生成及产物合成途径,减少代谢副产物生成。
具体实施方式
二 本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225 %的磷酸氢二钠、O. 455 % O. 457 %的磷酸氢二钾、2. 225 2. 226 %的乙醇、O. 18% O. 22%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成。
具体实施方式
三本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成。本实施方式效果最佳。
具体实施方式
四本实施方式细菌纤维素的发酵方法按以下步骤实施一、将保存的细菌纤维素产生菌接种到固体培养基上进行菌种平板活化；
二、种子培养用接种环挑取固体培养基上活化的细菌纤维素产生菌转接到种子培养基，再放置于温度为30°C、转速为150r/min的恒温振荡培养箱中培养24h,种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸馏水制成；三、发酵培养按体积7%的接种量将种子培养基接入细菌纤维素高产发酵培养基中，然后静置于28°C条件下的恒温电热培养箱中培养7天，即完成细菌纤维素的发酵；步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氢二钠、O. 454% O. 458%的磷酸氢二钾、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的柠檬酸钠和余量的蒸懼水组成，初始pH值为6. 5。细菌纤维素发酵完成后所生成的细菌纤维素膜浮于液面，膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸馏水多次冲洗，用PH试纸轻压膜测PH值，至pH值约为7. 2后80°C干燥至恒重，进行称重。采用本实施方式中的发酵培养基打破了细菌纤维素产生菌自身固有的代谢网络的遗传特性，改变了代谢产物的积累，从而实现了对细胞代谢途径的修饰，提高了细菌纤维素。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四的不同点是步骤一中将保存的细菌纤维素产生菌接种到固体培养基上，在30°C的恒温电热培养箱中培养18 24h ;固体培养基按重量百分比由3%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的Na2HP04、O. 1%的1(2即04、0. 1%的柠檬酸、0.025%的1%504、2%的琼脂和余量的水组成。其它步骤及参数与实施方式四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五的不同点是步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225%的磷酸氢二钠、O. 455% O. 457%的磷酸氢二钾、2. 225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始pH值为6. 5。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
五的不同点是步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始PH值为6. 5。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式
八本实施方式细菌纤维素的发酵方法按以下步骤实施一、将保存的细菌纤维素产生菌接种到固体培养基上进行菌种平板活化；二、种子培养用接种环挑取固体培养基上活化的细菌纤维素产生菌转接到种子培养基，再放置于温度为30°C、转速为150r/min的恒温振荡培养箱中培养24h,种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸馏水制成；三、发酵培养按体积7%的接种量将种子培养基接入细菌纤维素高产发酵培养基中，然后静置于28°C条件下的恒温电热培养箱中培养7天，即完成细菌纤维素的发酵；步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332% 的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始pH值为6. 5。细菌纤维素发酵完成后所生成的细菌纤维素膜浮于液面，膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸馏水多次冲洗，用PH试纸轻压膜测PH值，至pH值约为7. 2后80°C干燥至恒重，进行称重。分别选用基本细菌纤维素发酵培养基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的柠檬酸、O. 025% 的 MgSO4^P余量的蒸馏水组成)，功能验证细菌纤维素发酵培养基(按重量百分比由3. 9789%的葡萄糖、O. 3396%的牛肉膏、O. 1933%的酵母膏、O. 2230%的磷酸氢二钠、O. 4565%的磷酸氢二钾、2. 2255%的乙醇和余量的蒸馏水组成，初始pH值为6. 5)和本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基进行对比发酵试验和理论研究。采用基本细菌纤维素发酵培养基进行细菌纤维素产生菌的发酵生产，在Acetate节点优化前流量的70. 78%进入TCA循环，并且整个代谢途径中大多流量进入了无效循环造成碳源浪费；而采用本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基有23. 03%的流量进入TCA循环，41. 28%流量进入了乙酸途径。本实施方式中添加柠檬酸钠对细菌纤维素产量有重大影响，使之与基本细菌纤维素发酵培养基相比产量显著增加。柠檬酸钠可加快丙酮酸向AcCOA的转变，加速乙酸的消耗，减少胞外乙酸的积累，使得发酵前期进入乙酸副产物生成途径流量减少，并更早的被利用进入生成细菌纤维素途径，提高细菌纤维素产量。柠檬酸钠的加入能使发酵后期甘油加速分解利用，甘油通过FADH2进入呼吸链参与能量代谢。实验证明柠檬酸钠使发酵的代谢转变更早发生，柠檬酸钠不仅能很好的调控代谢流量，使之更多的进入细菌纤维素生成途径。发酵液及胞内的pH值降低是由发酵液中有机酸的积累造成的，而低pH影响生物合成途径中关键酶，同样较低的PH也使得细胞活力受到影响，因此，pH过低不仅影响发酵环境，还会增加副产物的产生，限制了 BC的形成。柠檬酸钠具有很好pH缓冲及调节性能，可为细菌纤维素高产发酵培养基维持较高的pH值；而且柠檬酸钠能增强PDH活性，增加PYR等有机酸的消耗，能进一步的维持较高PH值，提升BC产量。pH动态平衡依赖于ATP，ATP供给增强可促进该平衡过程，柠檬酸钠是一种弱酸强碱盐，具有良好的PH调节和缓冲性能，柠檬酸钠的添加有利于ATP能量的转化。此外，柠檬酸钠可抑制PK酶活，减少了有机酸等代谢副产物的生成；而且能影响PYR节点途径流量分配，减少副产物生成，提高BC的产量。EMP途径中，柠檬酸钠起到主要的调控作用，使丙酮酸激酶酶活大大降低，产生的乙酸和丙酮酸副产物后期进入糖异生途径被利用合成细菌纤维素；TCA途径中，发酵初期本实施方式中细菌纤维素产生菌的丙酮酸脱氢酶O3DH)酶活比优化前提高3. 5855倍以上，柠檬酸副产物大大减少；丙酮酸脱氢酶酶活活性被提高，而I3DH作为TCA循环的前体物质乙酰CoA生成的关键酶，催化PYR氧化脱羧生成乙酰CoA，同时将NAD+还原为NADH，为生物体供应充足能量；同时乙酰CoA的增加，一方面加速TCA循环，为菌体生长和BC合成提供能量；另一方面，可以激活丙酮酸羧化酶，加速PYR生成草酰乙酸，促进糖异生，合成更多BC。本实施方式细菌纤维素高产发酵培养基中朽1檬酸钠最大的作用不是在抑制丙酮酸激酶，而是减少代谢流进入代谢副产物和无效循环途径。从整个发酵过程来看，发酵初期在满足菌体快速生长的同时，代谢流快速进入能量代谢和代谢副产物生成方向，发酵中期胞外代谢副产物出现明显的代谢转变，部分代谢副产物被利用，此时糖异生途径被强化，产 物合成速率加快。控制乙酸和TCA循环之间的流量分配，降低乙酸、柠檬酸等代谢副产物的生成，从而提高细菌纤维素产率和糖酸转化率。乙醇快速氧化转化为乙酸，产生菌体生长及产物生成所需能量，所以本实施方式发酵初期乙醇主要起到提高能量的调控作用。乙醇的加入可调控碳流通过G6P节点进入BC直接合成途径，而且乙醇快速产生的高能荷增强PDH活性，致使TCA循环流量减少，减少了柠檬酸的产生和碳源浪费，达到了提高BC产量的目的。并且乙醇的添加活跃HMP途径，大量代谢流通过HMP途径进入EMP途径，增强菌体呼吸代谢能力，使PK酶活大幅升高(而PK酶活过高不利于产物积累)，为初级代谢提供能量；但同时因为本实施方式中柠檬酸盐与葡萄糖的联合代谢会增加胞内Ca2+的浓度，从而强烈抑制PK酶的活力，减慢EMP过程，糖异生途径相应地增强，因此BC产量增加，副产物的生成相应地减少；同时发酵初期HMP途径生成大量能量满足了菌体生长及产物合成的需要，此时高活性的PDH催化产生的乙酰CoA激活丙酮酸羧化酶，加速PYR通过草酰乙酸进入糖异生途径，进行产物合成，此时乙酰CoA进入TCA途径流量减少，因此本实施方式发酵过程中柠檬酸积累量远低于采用基本细菌纤维素发酵培养基。采用基本细菌纤维素发酵培养基PK酶活整个发酵过程比较低，这是因为发酵过程HMP途径较弱，为菌体生长提供的所需能量及中间产物不足造成的。与采用基本细菌纤维素发酵培养基相比，功能验证细菌纤维素发酵培养基发酵初期HK酶活是前者的2. 71倍，G6PDH为前者2. 43倍，实验结论与Takaaki等(TakaakiNaritomi, Tohrukouda, Fumihiro Yoshinagaet al. Effect of Ethanol on BacterialCelluose Prodution from Fructosein Continuous Culture. Journal Of FermentationAnd Bioengineering, 95 (1998)，598-603.)添加乙醇抑制G6PDH的结论不同，添加乙醇的发酵培养基在发酵初期G6TOH酶活依旧较高。在本实施方式发酵中后期G6TOH活性受到抑制，说明发酵初期乙醇在通过HMP途径快速提供菌体生长所需能量及前体物质方面具有重要作用；乙醇调控对HK、G6PDH影响较大。本实施方式发酵过程中乙酸积累下降，是由于添加柠檬酸钠，PK酶活降低，EMP途径减弱，需要更多乙醇通过TCA为菌体供能，则乙酸盐转化成乙酸的产量减少；同时糖异生途径的增强也会加速乙酸的利用。本实施方式发酵过程中PYR积累量明显提高；这种结果与酶活变化并没有明显的相关性；是因为柠檬酸钠降低PK酶活，EMP途径被抑制，糖异生途径增强，乙酸、甘油作为底物形成PYR进入糖异生途径，使得PYR积累量进一步增加。本实施方式细菌纤维素的发酵方法可明显提高BC产量。
具体实施方式
五本实施方式细菌纤维素的发酵方法按以下步骤实施一、将保存的汉氏葡糖醋杆菌DHM1-3接种到固体培养基上进行菌种平板活化；二、种子培养用接种环挑取固体培养基上活化的汉氏葡糖醋杆菌DHM1-3转接到种子培养基，再放置于温度为30°C、转速为150r/min的恒温振荡培养箱中培养24h,种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸馏水制成； 三、发酵培养按体积7%的接种量将种子培养基接入细菌纤维素高产发酵培养基中，然后静置于28°C条件下的恒温电热培养箱中培养7天，即完成细菌纤维素的发酵；步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始pH值为6. 5。细菌纤维素发酵完成后所生成的细菌纤维素膜浮于液面，膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸馏水多次冲洗，用PH试纸轻压膜测PH值，至pH值约为7. 2后80°C干燥至恒重，进行称重。采用基本细菌纤维素发酵培养基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的柠檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸馏水组成)进行对比发酵试验。以基本细菌纤维素发酵培养基的发酵方法为优化前，以本实施方式细菌纤维素的发酵方法为优化后，根据分析和实验得出汉氏葡糖醋杆菌DHM1-3优化前后细菌纤维素发酵代谢流分布(如图I所示，由于PFK缺乏或者活性很低，在构建网络时忽略了 F6P — G3P的反应。HPM途径和TCA循环中异柠檬酸脱氢酶反应是NADPH的主要合成途径。产生的NADPH主要用于生物合成。由于HMP代谢葡萄糖产生NADPH，然后进入TCA循环，这个过程中并没有代谢分支；HMP代谢网络简化为G6P — RU5P — 2/3F6P+1/3G3P)。图I中以葡萄糖的摩尔消耗速率为100计，得到各产物生成速率对应葡萄糖消耗速率的比值。将这些速率代入矩阵，通过MATLAB利用最小二乘法计算得到优化前后代谢流分布。HMP途径中G6P到RU5P的反应是不可逆反应，TCA循环中a-酮戊二酸脱氢酶和柠檬酸合成酶催化的反应也是不可逆的，由此得到的代谢通量分布图中并没有出现负值，因此计算得到的代谢流量没有违背生化热力学条件，说明构建的代谢网络较为合理。由图I可以看出，葡萄糖主要经过HM、TCA途径进行能量代谢，并为菌体生成提供核酸、蛋白质、脂肪、小分子中间代谢产物等。剩余的代谢流量进入细菌纤维素合成途径或者代谢流溢流进入无效循环。对比优化前后代谢通量分布发现，菌体生长通量相差不大；HMP途径代谢流量由优化前的90. 77降为74. 9 ;优化后碳流量在流向生成大量菌体的同时，有22. 8%的流量进入细菌纤维素合成途径，优化前的细菌纤维素合成流量只占6. 68%。对比优化前后菌体生物量及产物产量，可知细菌纤维素的合成与菌体的生长密切相关，但菌体的大量生长并不是细菌纤维素产量提高的直接原因。碳代谢流量先充分满足菌体合成后，才转入次生代谢产物的合成和代谢副产物的生成。优化前后代谢通量分布另一个区别就是优化前乙酸通量为0，而优化后乙酸通量高达41. 28%。这也可能是影响优化后培养基细菌纤维素产量继续提高的一个原因。因为乙醇的添加和快速氧化，在快速提高能量增加细菌纤维素产量的同时，也增加了乙酸的产生，从而恶化发酵液环境，影响菌体和细菌纤维素产量继续增加，使流量更多的进入无效循环。而优化前乙酸为0，细菌纤维素产量很低，可能的原因是HMP和TCA产生的能量仅用于菌体生成，而细菌纤维素合成途径可能受到阻碍或者反馈调节没被解除，或者是生成的乙酸，在能量不足的情况下直接被氧化利用，使之无法积累。优化前进入HMP的流量是90. 77，细胞多糖合成是2. 55，细菌纤维素合成是6. 68。这个过程所需能量主要是通过HMP代谢葡萄糖和TCA循环得到。细菌纤维素产量过低可能是在HMP和TCA循环过程中产生较多的无效循环所致。
优化后进入HMP的流量是74. 9，细胞多糖合成是2. 3，细菌纤维素合成是22. 8。与优化前通量相比，后者代谢流量发生了较大改变。优化后^(22.8)/^5(74.9) = 0.304，而优化前r2 (6. 68) /r5 (90. 77) = O. 07。也就是说优化后碳代谢流更多流向细菌纤维素合成方向，从而使其产量比优化前有了大幅提高。造成这种情况的原因，是乙醇和柠檬酸钠的添力口，能快速氧化进入TCA循环用于能量生成；另外由于乙醇的快速氧化产生高能荷的ATP，而高能荷的ATP是HMP途径中关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶的抑制剂，从而在满足菌体生长所需能量的条件下，使代谢流量更多的进入细菌纤维素合成方向。对于Acetate节点，流入F6P和PYR的流量都是来自于HMP,通过Acetate进入乙酸和AcCOA0 F6P生成Acetate涉及一系列生化反应，它是替代EMP途径使代谢流进入TCA循环，这与HMP中间产物有关。优化前后的最大差别就是，优化前来自于HPM流量的81. 2进入了 AcCOA，而优化后41. 28的流量进入了乙酸途径，仅有30. 17的流量进入AcCOA。从整个途径来看，优化前没有乙酸产生可能是某些代谢途径障碍所致。而优化后产生大量乙酸是乙醇快速氧化的结果，并不是细菌纤维素产量提高的原因。在细菌纤维素合成过程中，除乙酸外，葡萄糖酸的产生也使pH快速下降。另外，发酵后期由于菌体进入衰亡期，纤维素的生物合成变慢，出现代谢溢流，使代谢流发生迁移，更多的流量进入代谢副产物生产途径。这些副产物的形成可能与条件控制直接相关。因此基于代谢流分析，可以看出本实施方式从遗传角度和发酵控制方面使副产物的生成减少，就能达到代谢流迁移的目的，从而增大细菌纤维素生物合成途径的流量。基本细菌纤维素发酵培养基发酵过程曲线图如图2所示，本实施方式使用本发明细菌纤维素高产发酵培养基发酵细菌纤维素的过程曲线图如图3所示。测得基本细菌纤维素发酵培养基每升细菌纤维素高产发酵培养基中所获得的细菌纤维素膜膜干重为I. 232g/L，产量一直增加不明显，本实施方式每升细菌纤维素高产发酵培养基中细菌纤维素产量增加很快，跟菌体生长趋势相似，所获得的细菌纤维素膜膜干重为3. 362g/L，增重克数为2. 13g/L，细菌纤维素增产173%。在底物消耗方面，两种培养基发酵过程基本相似，都在第一天都有一个快速消耗，这与汉氏葡糖醋杆菌独特的代谢途径相关，有部分葡萄糖转化为葡萄糖酸，这也是致使发酵液pH值降低很快，影响细菌纤维素产量的一个重要原因。此后两天耗糖不高，基本细菌纤维素发酵培养基在第三天进入快速耗糖期，直至发酵终止耗糖并没减慢，与菌体生长相适应，可能相当一部分消耗的糖都进入菌体生长途径。本实施方式在第四天进入快速耗糖期，到最后一天有个小幅减慢过程。两者残糖分别为26. 5g/L和18. 5g/L，但两者的糖利用率都不高，分别为41%和47% ;而本实施方式与基本细菌纤维素发酵培养基最大的不同就是添加了乙醇，乙醇从发酵开始就快速消耗，直至第四天耗尽，葡萄糖才开始进入快速消耗期。乙醇在发酵开始就快速氧化，为菌体生长代谢和产物生成提供足够的能量，从而使更多的碳代谢流量进入产物合成途径。这也解释了耗糖量相差不大，本实施方式产量却是基本细菌纤维素发酵培养基的2. 73倍的情况。基本细菌纤维素发酵培养基中可能因为乙酸代谢途径或者别的代谢途径出现障碍，代谢中间产物出现积累，影响了碳代谢流通过糖异生非直接途径合成细菌纤维素。本实施方式发酵过程中乙酸有了一定积累，但后期乙酸量减少，原因可能是因为发酵前期乙醇快速氧化产生的能量被利用，而乙醇被氧化转化成乙酸，后期能量不够乙酸作为底物又被重新利用。基本细菌纤维素发酵培养基中代谢流发生了迁移，大量进入了无效循环，造成碳 源浪费。本实施方式使得产物产量有了明显提高更适合菌体生长和发酵生产细菌纤维素。
具体实施方式
六本实施方式细菌纤维素的发酵方法按以下步骤实施一、将保存的醋化醋杆菌接种到固体培养基上进行菌种平板活化；二、种子培养用接种环挑取固体培养基上活化的醋化醋杆菌转接到种子培养基，再放置于温度为30°C、转速为150r/min的恒温振荡培养箱中培养24h,种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸馏水制成；三、发酵培养按体积7%的接种量将种子培养基接入细菌纤维素高产发酵培养基中，然后静置于28°C条件下的恒温电热培养箱中培养7天，即完成细菌纤维素的发酵；步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始pH值为6. 5。细菌纤维素发酵完成后所生成的细菌纤维素膜浮于液面，膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸馏水多次冲洗，用PH试纸轻压膜测PH值，至pH值约为7. 2后80°C干燥至恒重，进行称重。采用基本细菌纤维素发酵培养基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的柠檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸馏水组成)进行对比发酵试验。测得基本细菌纤维素发酵培养基每升细菌纤维素高产发酵培养基中所获得的细菌纤维素膜膜干重为O. 57g/L，本实施方式每升细菌纤维素高产发酵培养基中所获得的细菌纤维素膜膜干重为I. 04g/L，增重克数为O. 47g/L，细菌纤维素增产82. 46%。
具体实施方式
八本实施方式细菌纤维素的发酵方法按以下步骤实施一、将保存的Gluconacetobacter europaeus接种到固体培养基上进行菌种平板活化；二、种子培养用接种环挑取固体培养基上活化的Gluconacetobacter europaeus转接到种子培养基，再放置于温度为30°C、转速为150r/min的恒温振荡培养箱中培养24h，种子培养基按重量百分比由2 %的蔗糖、O. 3 %的酵母膏、O. 5 %的蛋白胨、O. 2 %的ΚΗ2Ρ04、O. 015%的MgSO4和余量蒸馏水制成；三、发酵培养按体积7%的接种量将种子培养基接入细菌纤维素高产发酵培养基中，然后静置于28°C条件下的恒温电热培养箱中培养7天，即完成细菌纤维素的发酵；步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始pH值为6. 5。细菌纤维素发酵完成后所生成的细菌纤维素膜浮于液面，膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去 除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸馏水多次冲洗，用PH试纸轻压膜测PH值，至pH值约为7. 2后80°C干燥至恒重，进行称重。采用基本细菌纤维素发酵培养基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的柠檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸馏水组成)进行对比发酵试验。测得基本细菌纤维素发酵培养基每升细菌纤维素高产发酵培养基中所获得的细菌纤维素膜膜干重为O. 89g/L，本实施方式每升细菌纤维素高产发酵培养基中所获得的细菌纤维素膜膜干重为I. 87g/L，增重克数为O. 98g/L，细菌纤维素增产110. 11%。
权利要求
1.细菌纤维素高产发酵培养基，其特征在于细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O.21% O. 23%的磷酸氢二钠、O. 454% O. 458%的磷酸氢二钾、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成。
2.根据权利要求I所述的细菌纤维素高产发酵培养基，其特征在于细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O.21 %的酵母膏、O. 215 % O. 225 %的磷酸氢二钠、O. 455 % O. 457 %的磷酸氢二钾、2.225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成。
3.根据权利要求I所述的细菌纤维素高产发酵培养基，其特征在于细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2 %的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成。
4.采用权利要求I所述细菌纤维素高产发酵培养基的细菌纤维素发酵方法，其特征在于细菌纤维素的发酵方法按以下步骤实施 一、将保存的细菌纤维素产生菌接种到固体培养基上进行菌种平板活化； 二、种子培养用接种环挑取固体培养基上活化的细菌纤维素产生菌转接到种子培养基，再放置于温度为30°C、转速为150r/min的恒温振荡培养箱中培养24h,种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、0.3%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.2%的KH2PO4、O. 015 %的MgSO4和余量蒸馏水制成； 三、发酵培养按体积7%的接种量将种子培养基接入细菌纤维素高产发酵培养基中，然后静置于28°C条件下的恒温电热培养箱中培养7天，即完成细菌纤维素的发酵； 步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O.30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氢二钠、O.454% O. 458%的磷酸氢二钾、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的柠檬酸钠和余量的蒸懼水组成，初始pH值为6. 5。
5.根据权利要求4所述的细菌纤维素的发酵方法，其特征在于步骤一中将保存的细菌纤维素产生菌接种到固体培养基上，在30°C的恒温电热培养箱中培养18 24h ;固体培养基按重量百分比由3%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的Na2HP04、0. 1%的Κ2ΗΡ04、0. I %的柠檬酸、O. 025%的MgS04、2%的琼脂和余量的水组成。
6.根据权利要求5所述的细菌纤维素的发酵方法，其特征在于步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O.19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225%的磷酸氢二钠、O. 455% O. 457%的磷酸氢二钾、2. 225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始pH值为6.5。
7.根据权利要求5所述的细菌纤维素的发酵方法，其特征在于步骤三中细菌纤维素高产发酵培养基按重量百分比由3. 92 %的葡萄糖、O. 332 %的牛肉膏、O. 191 %的酵母膏、O.218%的磷酸氢二钠、O. 456%的磷酸氢二钾、2. 226%的乙醇、O. 2%的柠檬酸钠和余量的蒸馏水组成，初始PH值为6. 5。
全文摘要
细菌纤维素高产发酵培养基及细菌纤维素的发酵方法，涉及一种细菌纤维素发酵培养基及细菌纤维素的发酵方法。它解决了目前细菌纤维素产量低的问题。培养基由葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、乙醇、柠檬酸钠和蒸馏水组成。发酵方法一、菌种活化；二、种子培养；三、发酵培养。采用本发明技术细菌纤维素产量大幅提升，增加量均超过80％。本发明可用于细菌纤维素生产领域。
文档编号C12R1/01GK102827897SQ20121036208
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者雷虹, 李元敬, 张基亮, 陈雪梅, 田华, 平文祥, 韩德权 申请人:黑龙江大学