高效克隆筛选表达载体、其制备方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种高效克隆筛选表达载体，该载体由piggyBac转座系统的ITRs序列插入到哺乳动物表达载体中得到。本发明还公开了上述载体的制备方法及其用途。本发明利用piggyBac转座系统的ITRs序列构建高效克隆筛选表达载体，同时将经过密码子优化的能在小鼠中高效表达的转录酶基因克隆到另外一个真核表达载体上，通过含ITRs序列的表达载体和含转录酶的载体的共表达，将筛选标记与目的基因一同整合到宿主细胞的基因组中，从而大大提高了转染的效率和阳性克隆的筛选率。
【专利说明】高效克隆筛选表达载体、其制备方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物学领域,特别是涉及一种用PiggyBac转座系统的ITRs序列构建的高效克隆筛选表达载体，该载体的构建方法及其用途。
【背景技术】
[0002]转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。转座子占人和小鼠基因组序列的40%以上(Nature, 2001, 409, 860 - 921 ；Nature,2002, 420, 520 - 562)。
[0003]自从McClintock从玉米中发现第一个转座子以来(Proc.Natl.Acad.Sc1.1950, USA36, 344 - 345)，转座因子已成为很多生物宝贵的遗传分析工具。在原核生物中，利用转座子进行的突变研究发现了在有害微生物致病时起重要作用的基因(Science, 1999，286，2165 - 2169 ；J.Virol.2003，77，123 - 134)。在真核生物中，运用 P 因子(一种转座子)的转基因和插入突变技术大大推动了果蝇遗传学的发展。包括P因子在内的许多转座子在其天然宿主以外的生物体中没有活性，说明转座过程涉及一些宿主因子(Arch.1nsect Biochem.Physiol.1993, 22, 373 - 384)。Tcl/Mariner 家族在内的几种转座系统已应用于小鼠和斑马鱼。一种利用比较系统发育学手段人工合成的Tcl类转座^ Sleeping Beauty (SB)被证明在小鼠和人的细胞中具有活性(Cell 1997，91，501-510 ;Proc.Natl.Acad.Sc1.1998，USA 95，10769 - 10773)。虽然 SB和Minos等转座子已在小鼠体内进行了插入突变测试，但由于新插入位点集中在原始位点周围、转座效率低下以及携带DNA长度有限等原因，这些转座子并没有被广泛地应用(Genomics 2003,81, 108-111 ；Mol.Cell.Biol.2003, 23, 9189-9207)。
[0004]PB因子是一种来源于飞蛾甘蓝尺蠖中的`DNA转座子，全长2472个碱基。它两端含有13个碱基的反向末端重复序列(ITR)，并编码一个594个氨基酸的转座酶。PB已被成功地用于黑腹果蝇和其它昆虫的遗传分析。它特异地插入四碱基TTAA位点，并在插入位点两侧形成 TTAA 重复(Virology 1989，172，156 - 169 ；Virology 1995，211，397 - 407 ；InsectMol.Biol.1996，5，141 - 151)。由于其特有的转座酶和TTAA目标序列，PB成为了一个新的 DNA 转座子家族——PiggyBac 家族的代表(In Mobile DNA II，2002，pp.1093 - 1110)。PB作为生殖系转基因工具已被应用于四个目的十余种昆虫(Insect Biochem.Mol.Biol.2003，33，449 - 458)。作为诱变剂，PB在黑腹果蝇中的转座效率至少和P因子相当(Nat.Genet.2004, 36, 283 - 287)。在红色面象虫 Tribolium castaneum 中，PB 在非同源染色体间也可高效转座(Insect Mol.Biol.2003, 12,433 - 440)。霉菌到哺乳动物等许多系统发育地位不同的物种基因组中都发现有很多类似PB的序列，进一步预示了 PB的活性可能并不仅局限在昆虫中(Mol.Genet.Genomics, 2003，270，173 - 180)。事实上，最近发现PB也能在涡虫Girardiatigrina、哺乳动物及其细胞中具有高效的转座活性，已在动物基因组功能研究、基因转移及诱导多能干细胞等领域得到了广泛应用(Proc.Natl.Acad.Sc1.2003，USA 100，14046 - 14051)。[0005]虽然PB系统具有广泛的宿主性，以及高效的转染效率，而且在哺乳动物细胞中已广泛用于基因治疗(Molecular Therapy, 2007, 15，139-145)，但是目前其在体外研究还未曾有相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题之一是提供一种高效克隆筛选表达载体，它可以大大提高转染效率和阳性克隆的筛选率。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的高效克隆筛选表达载体，由piggyBac转座系统的ITRs序列插入到哺乳动物表达载体中得到。
[0008]本发明要解决的技术问题之二是提供上述高效克隆筛选表达载体的制备方法。
[0009]为解决上述技术问题，本发明的高效克隆筛选表达载体的制备方法，包括以下步骤:
[0010]I)以pGH为克隆载体，全基因合成5’ ITR和3’ ITR DNA片段，片段的两头加入EcoRV的酶切位点，得到载体pGH-1TR5和pGH_ITR3 ；
[0011]2)以pGH为克隆载体，全基因合成GeneBank序列号为EF587698的转录酶基因片段，且片段的两头分别加入EcoRI和HindIII的酶切位点，得到载体pGH-Transposase ；
[0012]3)用 EcoRV 酶切载体 pGH_ITR5 和 pGH_ITR3，EcoRI 和 HindIII 酶切载体pGH—Transposase ；
[0013]4) NruI酶切 哺乳动物表达载体，同时EcoRI和HindIII酶切表达载体pTriEx2 ；
[0014]5)将片段ITR5连接到经过NruI酶切的哺乳动物表达载体，得到含ITR5片段的表达载体；
[0015]6)同时将片段Transposase连接到经过EcoRI和HindIII酶切的表达载体pTriEx2,得至Ij新表达载体 pTriEx2_Transposase ；
[0016]7) Bstz 171酶切步骤5)得到的含ITR5片段的表达载体；
[0017]8)将片段ITR3连接到步骤7)得到的表达载体。
[0018]本发明要解决的技术问题之三是提供上述高效克隆筛选表达载体在转染哺乳动物细胞和筛选表达目的蛋白克隆中的应用。
[0019]本发明用piggyBac转座系统的ITRs序列构建高效克隆筛选表达载体，同时将经过密码子优化的能在小鼠中高效表达的转录酶基因克隆到另外一个真核表达载体上，通过含ITRs序列的表达载体和含转录酶的载体的共表达，将筛选标记与目的基因一同整合到宿主细胞的基因组中，从而大大提高了转染的效率和阳性克隆的筛选率，也为构建多个亚基共表达的稳转细胞系提供了可能，为研究外源基因在哺乳动物细胞中的功能提供了有利的条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是表达载体pcDNA3.1 (+)-1TRs的结构示意图。
[0021]图2是表达载体pcDNA4 /T0-1TRs的结构示意图。
【具体实施方式】[0022]为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合图示的实施方式，详述如下:
[0023]实施例1 pcDNA3.1 (+)-1TRs载体的制备
[0024]pcDNA3.1 (+)-1TRs表达载体的构建如图1所示，以pc DNA3.1 (+)为载体，按照DNA序列正确的方向(见图1)将ITRs序列插入到载体上，得到含ITRs序列的真核表达载体pcDNA3.1 (+) -1TRs。该表达载体pcDNA3.1 (+) -1TRs在转座时能够携带着哺乳动物启动子(CMV)、多克隆位点(MCS)处的目的基因以及筛选基因(Neomycin) —起整合到宿主细胞的基因组中。
[0025]具体制备方法如下:
[0026](I)从商品化的pXL-BacII质粒载体中，找出其5’ ITR和3’ ITR的具体序列；从已报道的文献(Nucleic Acids Research, 2007, 35, e87)中找到经过密码子优化的能在小鼠中高效表达的转录酶(Transposase)基因序列(GeneBank序列号:EF587698)。其中，
[0027]5，ITR 序列(SEQ ID No:1)为:
【权利要求】
1.一种高效克隆筛选表达载体，其特征在于，该载体由piggyBac转座系统的ITRs序列插入到哺乳动物表达载体中得到。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述哺乳动物表达载体为PCDNA3.1 (+)。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，该载体具有如SEQID No:3所示的序列。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述哺乳动物表达载体为PCDNA4/T0。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，该载体具有如SEQID No:4所示的序列。
6.权利要求1至5任一项所述载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)以PGH为克隆载体，全基因合成5’ITR和3’ ITR DNA片段，片段的两头加入EcoRV的酶切位点，得到载体PGH-1TR5和pGH-1TR3 ； 2)以pGH为克隆载体，全基因合成GeneBank序列号为EF587698的转录酶基因片段，且片段的两头分别加入EcoRI和HindIII的酶切位点,得到载体pGH_Transposase ； 3)用EcoRV 酶切载体 pGH-1TR5 和 pGH_ITR3，EcoRI 和 HindIII 酶切载体pGH—Transposase ；4)NruI酶切哺乳动物表达载体，同时EcoRI和HindIII酶切表达载体pTriEx2 ； 5)将片段ITR5连接到经过NruI酶切的哺乳动物表达载体，得到含ITR5片段的表达载体； 6)同时将片段Transposase连接到经过EcoRI和HindIII酶切的表达载体pTriEx2，得到新表达载体pTriEx2_Transposase ； 7)Bstz 171酶切步骤5)得到的含ITR5片段的表达载体； 8)将片段ITR3连接到步骤7)得到的表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物表达载体包括pcDNA3.1 (+)或 pcDNA4/T0。
8.权利要求1至5任一项所述载体在筛选表达目的蛋白克隆中的应用。
9.权利要求1至5任一项所述载体在转染哺乳动物细胞中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括人胚肾细胞HEK293或人宫颈癌细胞Hela。
【文档编号】C12N15/85GK103834686SQ201210483844
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月23日 优先权日:2012年11月23日
【发明者】楼庄伟, 孔云华, 梅佳, 贾园, 陈侃, 宋云鹏, 吕强 申请人:上海药明康德新药开发有限公司, 苏州药明康德新药开发有限公司, 无锡药明康德生物技术有限公司