Mc1r基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种MC1R基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对C451T位点的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8，针对C478T位点的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，和/或针对G565T位点的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【专利说明】MC1R基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种MClR基因突变检测特异性引物和液相芯片。
【背景技术】[0002]黑素皮质素I 型受体(melanocortin lreceptor,MC1R)位于 16 号染色体 16q24.3长臂上，具体位于16号染色体89984286到89987384碱基对之间。MClR是黑素皮质素受体(melanocortin receptor, MCR)家族中最小的一个(297~317个氨基酸)，该家族都是G蛋白耦合受体，有7个跨膜功能域，其天然配体为黑素皮质素激素肽。现已明确黑素皮质素系统(MC)广泛参与了多种生理通路的调控，包括色素沉着、摄食行为、体重和能量代谢平衡、抗感染、性功能和疼痛等功能。MClR主要在黑色素细胞中表达，MClR基因变异能增加黑肤色个体罹患肿瘤的风险，另外MClR基因还是一个主要的雀斑基因。
[0003]目前，MClR基因突变检测方法主要有=Illumina光纤微珠芯片技术、基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALD1-T0F-MS)和荧光定量PCR技术，虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的需要。基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供MClR基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测MClR基因三种常见基因型C451T、C478T和G565T的野生型和突变型。
[0005]实现上述目的的技术方案如下。
[0006]一种MClR基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对MClR基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对C451T位点的SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8，针对C478T位点的SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和 / 或针对 G565T 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.6 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.13~SEQ IDN0.18,且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对C451T、C478T位点的SEQ ID N0.19及 SEQID N0.20，和 / 或针对 G565T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE引物为:针对C451T位点的由SEQ ID N0.1和SEQID N0.7组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8组成的序列，针对C478T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.10组成的序列，和/或针对G565T位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.12组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于MClR基因突变检测的特异性引物。
[0013]实现上述目的技术方案如下。
[0014]用于MClR基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为:针对C451T位点的 SEQID N0.7 及 SEQ ID N0.8，针对 C478T 位点的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和 / 或针对 G565T 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的MClR基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的MClR基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，3种突变位点检测可通过一步PCR即可完成2条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方 式
[0020]实施例1MClR基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]针对MClR基因三种常见基因型C451T、C478T和G565T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“ tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE弓丨物序列如下表所示:
[0023]表1MClR基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序列)
【权利要求】
1.一种MClR基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对MClR基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对C451T位点的SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8，针对C478T位点的SEQID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和 / 或针对 G565T 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12 ;所述tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.6 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.13~SEQ ID N0.18，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的MClR基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为:针对 C451T、C478T 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，和 / 或针对 G565T 位点的 SEQID N0.21 及 SEQ ID N0.22。
3.根据权利要求1或2所述的MClR基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对C451T位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8组成的序列，针对C478T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.10组成的序列，和/或针对G565T位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.12组成的序列。
4.根据权利要求1或2所述的MClR基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述间隔臂为5-10个T。
5.用于MClR基因突变检测的特异 性引物，其特征在于，所述特异性引物序列为:针对 C451T 位点的 SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8，针对 C478T 位点的 SEQ ID N0.9 及 SEQ IDN0.10，和 / 或针对 G565T 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12。
【文档编号】C12Q1/68GK103849943SQ201210513237
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2012年12月4日
【发明者】吴诗扬, 陈昌华 申请人:益善生物技术股份有限公司