本发明涉及生产酵母提取物的方法。
背景技术：
酵母提取物通常用在食品工业中，以改善或增加所有种类的美味食品应用，比如汤、松脆物、土豆片、（加工的）肉类等等的香味。食品化学法典（FoodChemicalCodex）如下定义“酵母提取物”：“酵母提取物包含酵母细胞的水溶性组分，其组成主要是氨基酸、肽、碳水化合物和盐。酵母提取物通过可食用的酵母中天然存在的酶或者添加食品级别的酶来对肽键水解而产生”。相比之下，该食品化学法典将“自溶的酵母”定义为：“从食品级酵母获得的浓缩的、非提取的、部分可溶的消化物。溶解通过酵母细胞的酶促水解或自溶完成。可添加食品级盐和酶。自溶酵母含有得自全酵母细胞的可溶和不可溶组分二者。其主要含有氨基酸、肽、碳水化合物、脂肪和盐”。酵母自溶产物因此不同于“酵母提取物”，因为除了在酵母提取物中存在的所有感兴趣的组分外，酵母自溶产物还含有未与可溶性组分分开的感兴趣的细胞壁组分。酵母提取物通常如下生产：a）使酵母自溶；和b）对自溶产物进行固/液分离并回收液体组分。通常这种方法用膏状酵母开始，所述膏状酵母是通过在发酵结束时收获酵母细胞后去除废液，即通过去除酒糟来获得的。接下来，对膏状酵母中的酵母细胞进行处理，使得细胞破裂并释放内含物。这通常通过两个不同的过程来实现，或者产生自溶的酵母提取物或者产生水解的酵母提取物。自溶的酵母提取物是在细胞破裂以及聚合酵母材料消化（裂解）之后得自酵母可溶性物质的浓缩物。细胞破裂之后在培养基中释放的活性酵母酶是裂解的主要原因。这些类型的酵母提取物通常不包含5’-核糖核苷酸，因为在自溶过程期间，天然RNA被分解或修饰为不可降解或几乎不可降解为5’-核糖核苷酸的形式。富含氨基酸的这些类型的酵母提取物在食品工业中用作基本味感提供剂。酵母提取物中存在的氨基酸给食品添加了肉汤样的肉汤味。另一方面，水解的酵母提取物是下述处理之后获得自酵母的可溶性物质的浓缩物，所述处理为细胞破裂、消化（裂解）以及在裂解期间将蛋白酶和/或肽酶特别是核酸酶添加至酵母悬浮液。使天然的酵母酶在裂解之前失活，这通常通过热冲击来实现。通过本领域已知的方法获得酵母提取物的问题在于，当所述酵母提取物溶解时，它们是混浊的，这在澄清的应用，比如澄清的汤等等中是不利的。对于这种混浊的可能的解决方案是应用额外的过滤步骤，比如超滤或微滤。然而，这由于需要额外的处理步骤不仅是不经济的，而且由于引起混浊的材料留下来并被丢弃而导致损失。本发明的一个目的是提供生产低浊度的酵母提取物的方法，所述方法简单且具有基于干物质的高的产率。发明详述本发明的第一方面提供了生产酵母提取物的方法，所述方法包括：a）使酵母自溶；并b）对自溶产物进行固/液分离并回收可溶性组分，其中步骤b）中的固/液分离在低于5.1且高于1.0的pH下进行。在本发明上下文中，在步骤b）中获得的“回收的可溶性组分”是酵母提取物。因此，本说明书通篇中，术语“在步骤b）中获得的回收的可溶性组分”与“在步骤b）中获得的酵母提取物”具有相同的含义。在本发明上下文中，酵母“自溶”被定义为下述过程，其中酵母细胞和聚合酵母材料的降解至少部分地受酵母细胞壁被（部分）破坏和/或破裂之后释放到培养基中的活性天然酵母酶影响。优选的酵母的例子是Saccharomyces、Kluyveromyces和Candida。属于Saccharomyces属，特别是属于Saccharomycescerevisiae种的菌株是最优选的。在本发明方法中使用的酵母可通过本领域中已知的任何合适的发酵方法来制备。酵母生物质在用于本发明的方法之前可被浓缩，例如通过离心或过滤来进行。例如，可使用膏状酵母（已被浓缩至干物质含量为15-27%w/w的面包酵母）。任选地，可使用包含Brewer’s酵母或得自啤酒工厂的残留物酵母（废Brewer’s酵母）的发酵液。本发明提供了下述方法，其特别适于大规模生产酵母提取物。大规模表示发酵在超过10m3的发酵罐中进行。通过使酵母细胞壁破坏和/或部分地破裂来开始自溶过程。以这种方式，细胞被部分地打开，且释放至少一些细胞内含物。为了使酵母细胞壁破坏和/或部分破裂，使用本领域技术人员已知的方法，对细胞进行化学、机械或酶促处理。机械处理包括均质（homogenisation）技术。为此目的，使用高压均质机是可行的。其它的均质技术可以包括用颗粒例如沙和/或玻璃珠来混合，或者使用研磨装置（例如珠粒研磨机）。化学处理包括使用盐、碱和/或一种或多种表面活性剂或去垢剂。化学处理是较不优选的，因为它们可能导致RNA的部分降解，尤其是用到碱的时候，以及导致随后2’-核糖核苷酸和3’-核糖核苷酸的形成。本发明人已意识到，当步骤b）中回收期间的pH低于5.1且高于1.0时，可生产具有非常低的浊度的酵母提取物（即，非常澄清的酵母提取物）。“浊度”也称为“混浊度（cloudiness）”或“浑浊度（haziness）”，其通常由液体中悬浮的颗粒引起。技术人员知道如何测量浊度。测量浊度的合适的方法在实施例1中描述。本发明通篇中，术语“澄清的酵母提取物”和“具有低浊度的酵母提取物”被理解为具有相同的含义。在一种实施方式中，步骤b）中的固/液分离期间的pH低于5.1，优选地低于4.5或更低，更优选地低于4.2或更低，甚至更优选地低于4.0或更低，最优选地低于3.5或更低且高于1.0。优选的pH范围是从1.0-5.0或从1.0-4.5或从1.0-4.2或从1.0-3.5和从2.0-5.1或从2.0-4.5或从2.0-4.2。最优选的是2.0-3.5的pH范围。步骤b）中的固-液分离优选地通过常用的固-液分离方法，优选地通过离心或过滤来进行。当使用离心时，可溶性组分可作为上清液回收。在一种优选的实施方式中，步骤b）中的固-液分离通过离心进行。使用离心在经济上是有优势的，特别是当所述方法大规模进行时。在本发明方法中，在自溶方法中使用的条件是优选地使得相当大的一部分RNA以可降解为5’-核糖核苷酸的形式保留的条件。在此用术语“5’-核糖核苷酸”来指5’-GMP、5’-CMP、5’-UMP和进一步的5’-AMP和/或5’-IMP的混合物，其中所述5’-AMP可被部分或完全转化成5’-IMP。术语“5’-核糖核苷酸”包括游离的5’-核糖核苷酸或其盐。在上下文中，用“相当大的一部分RNA”表示优选地至少50%、更优选地至少60%、70%、75%，甚至更优选地至少80%，最优选地至少83%（都基于在步骤b之前的总RNA量）。高量的可降解为5’-核糖核苷酸的RNA可有利地导致酵母提取物具有非常低的浊度。在自溶过程期间，不需要RNA全部完整地保留，但是至少相当大的一部分RNA应以可降解为5’-核糖核苷酸的形式保留。通常，最多100%的RNA可以以可降解为5’-核糖核苷酸的形式保留。“以可降解为5’-核糖核苷酸的形式”表示，RNA应该是允许通过合适的酶转化为5’-核糖核苷酸的形式。优选地，合适的酶是5’-磷酸二酯酶（5’-Fdase）。可降解为5’-核糖核苷酸的RNA的形式包括含有至少两个核糖核苷酸单元的寡核苷酸。因而，可降解为5’-核糖核苷酸的形式的RNA可由包含完整RNA和不同长度的寡核苷酸或多核苷酸的混合物组成。在本发明的上下文中，寡核苷酸包含2-10个核糖核苷酸单元，而多核苷酸包含多于10个核糖核苷酸单元。在自溶过程期间以可降解为5’-核糖核苷酸的形式保留的RNA的百分比被定义为，a）参与自溶以及RNA向5’-核糖核苷酸转化的酶失活之后在自溶产物中测量的5’-GMP重量百分比（计算为其七水合物二钠盐，且基于无氯化钠的干物质）和b）在RNA完全碱性水解之后在起始材料中测量的GMP重量百分比（计算为其七水合物二钠盐，且基于无氯化钠的干物质）之间的比率（×100）。在碱性水解之后在起始材料中测量的GMP重量百分比（计算为其七水合物二钠盐，且基于无氯化钠的干物质）可通过将对应的游离GMP的重量百分比（基于无氯化钠的干物质）乘以系数1.47来确定。实施例1中描述了测定自溶产物中5’-GMP的量和碱水解之后GMP的量的方法。用来测定5’-GMP的量的方法也可用来测定5’-IMP、5’-AMP、5’-CMP和5’-UMP的量，如果必要的话，所述方法具有本领域技术人员知识范围内的一些适当修改。优选地，酶促地进行使酵母细胞壁破坏和/或部分地破裂，因为可因此实现对方法的更好的控制，并且该方法特别合适于大规模使用。可使用若干种酶制剂，比如纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和/或果胶酶。优选地使用蛋白酶，更优选地使用内切蛋白酶。用来起始自溶方法的条件取决于使用的酶的类型并且可由本领域技术人员容易地确定。通常，用来酶促地使酵母细胞壁破坏和/或破裂的条件对应于在酵母自溶期间应用的那些条件。酵母自溶至少部分地受使酵母细胞壁（部分地）破坏和/或破裂之后在溶液中释放的天然活性酵母酶作用，其中添加的使酵母细胞壁破坏和/或破裂的化学品或更优选的酶可有助于酵母细胞和聚合酵母材料降解。特别地，自溶的第一阶段在与特定的温度组合的特定的pH范围内进行。例如，Saccharomycescerevisiae的自溶中应用的确保相当大的一部分RNA以可降解为5’-核糖核苷酸的形式保留并减少步骤b）中回收的可溶性组分的浊度的条件是使得自溶的第一阶段的pH在4.5-9之间和/或温度在50-65℃之间的条件。优选地，自溶的头8个小时，更优选地自溶的头4个小时在4.5-5.5的pH和57-65℃的温度或5.5-9的pH和50-65℃的温度下进行。第一阶段之后要保持的自溶条件较不关键。第一阶段之后pH通常保持在4和10之间，且温度通常保持在40℃和70℃之间。然而，优选地，第一阶段之后的pH小于5.1，优选地，第一阶段之后的pH是4.5或更小，更优选地4.2或更小，甚至更优选地4.1或更小，最优选地3.5或更小。一般而言，包括第一阶段的自溶过程的持续时间为至多24小时。本发明也可包括下述方法，其中在步骤a）中，使酵母在相当大的一部分RNA以可降解为5’-核糖核苷酸的形式保留的条件下进行水解。在本发明的上下文中，“酵母水解”可定义为下述过程，其中已使天然的酵母酶失活，且其中合适的外源酶添加至酵母生物质，以实现酵母细胞和聚合酵母材料的降解。自溶之后，获得了下述悬浮液（自溶产物），其包含酵母细胞壁组分、相当大的一部分是可降解为5’-核糖核苷酸的形式的RNA和可溶性细胞组分（例如蛋白质、肽、氨基酸、碳水化合物等等）。细胞壁组分包含不可溶的细胞残留物，特别是细胞壁或其片段。自溶过程结束时并且在步骤b）之前，用于使酵母细胞壁破坏和/或部分地破裂的化学品和/或参与自溶过程的酶应优选地被中和和/或失活。参与自溶的酶是天然的酵母酶和任选地添加的用来起始自溶过程的任何外源酶。化学品和/或酶的中和和/或失活应在相当大的一部分RNA以可降解为5’-核糖核苷酸的形式保留的条件下发生。参与自溶的酶的失活可通过pH处理或优选地通过热处理来进行，由此使酶失活。酶可通过热处理失活，例如通过在从65℃至95℃的温度下将混合物加热从5分钟至1小时的时间，更优选地通过在从65℃至75℃的温度下将混合物加热从30分钟至1小时的时间，其中典型地可在更高的反应温度下使用更短的反应时间。例如，在65℃下将混合物加热1小时或在75℃下将混合物加热30分钟对使酶失活而言是足够的。在本发明方法的步骤b）中，对自溶产物进行固/液分离且回收含有RNA的细胞壁组分，其中在这期间的pH低于5.1，优选地4.5或更低，更优选地4.2或更低，甚至更优选地4.0或更低，最优选地3.5或更低且高于1.0。优选的pH范围是从1.0-5.0或从1.0-4.5或从1.0-4.2或从1.0-3.5和从2.0-5.1或从2.0-4.5或从2.0-4.2。最优选的是pH范围2.0-3.5。在该固/液分离中，主要含有细胞壁的固体组分与可溶性组分分离开。在一种实施方式中，在步骤b）中，总RNA的至少55%，更优选地至少75%，最优选地至少90%与细胞壁组分结合在一起。实施例2表明，自溶产物中总RNA的高达94.7%与细胞壁组分结合在一起。实施例2还表明，与酵母细胞壁结合的RNA百分比和酵母提取物的浊度是固/液分离期间pH的函数：pH值越低，更多与细胞壁结合的RNA保留，且酵母提取物的浊度逐渐减小。总RNA量（即步骤b之前）可通过分析步骤a）中获得的自溶产物来测定。实施例1中描述了分析RNA的方法。高量的与细胞壁组分结合的RNA可导致酵母提取物具有低的浊度。与细胞壁组分结合在一起的RNA百分比被定义为a）源自固定量的起始材料的自溶产物的细胞壁组分中的RNA的克数与b）在相同固定量的起始材料中存在的RNA的克数之间的比率（×100）。实施例1描述了测定细胞壁组分和起始材料中的RNA量的方法。为了减少步骤b）中的回收的可溶性组分的浊度，可对自溶产物进行超滤（UF），来代替通常的固-液分离方法比如离心或过滤。一般而言，截留分子量越大允许通过膜的流量越高，但可能导致更大的损失和/或更少的纯的产物。除了其他因素以外，使用的固-液分离类型和所述固-液分离的效率可影响在本发明方法的步骤b）中回收的可溶性组分中的盐、碳水化合物、氨基酸和蛋白的量。在一种实施方式中，本发明的方法包括在步骤b）之后的：步骤c）将RNA转化为5’-核糖核苷酸。优选地使用5’-磷酸二酯酶（5’-Fdase）来将RNA转化成为5’-核糖核苷酸。5’-磷酸二酯酶可获得自微生物或植物来源（例如，麦芽根提取物）。商购微生物5’-Fdase的例子是由Amano（日本）生产的酶RP-1。任选地，通过脱氨酶，例如腺嘌呤脱氨酶，将5’-AMP转化为5’-IMP。商购脱氨酶的例子是由Amano（日本）生产的脱氨酶500。通过5’-Fdase和脱氨酶处理RNA可在两步过程或在一个单独的步骤过程中进行。在另一种优选的实施方式中，本发明方法包括步骤c）之后的d）：将5’-核糖核苷酸与其他可溶性材料分离，优选地通过离心或过滤来进行。这允许获得具有非常低的浊度的酵母提取物以及高量的5’-核糖核苷酸，例如高至90%w/w，95%w/w或甚至98%w/w或99%w/w的5’-核糖核苷酸，所有的量基于总干物质。本发明方法具有若干益处。其允许生产具有低的浊度的酵母提取物，并且因为其可仅包括2个步骤，所以非常简单。此外，其还可允许生产富含RNA的细胞壁组分，所述RNA可随后被转化为5’-核糖核苷酸，并且5’-核糖核苷酸可从细胞壁组分中提纯，导致非常纯的5’-核糖核苷酸组分。以这种方式，除了生产富含RNA的细胞壁组分和/或富含5’-核糖核苷酸的细胞壁组分和/或非常纯的含5’-核糖核苷酸的组分之外，还可生产非常澄清的酵母提取物。在第二个方面中，本发明提供酵母提取物，其特征在于，在5%的干物质含量下测量的酵母提取物的浊度低于30NTU。优选地，酵母提取物可通过本发明的方法获得。本发明现通过一些实施例来阐释，但所述实施例不意图是限制性的。实施例实施例1具有低浊度的酵母提取物的制备将两升来自Saccharomycescerevisiae的膏状酵母加热至60℃。随后添加0.5mlAlcalase（从丹麦Novozymes商购的丝氨酸蛋白酶），并将混合物在pH6.0和60℃下孵育4小时。将条件调整至pH5.1和51.5℃，并将另外的2mlAlcalase添加至反应混合物。将混合物在pH5.1，51.5℃下孵育20小时。接着，将混合物或自溶产物在65℃下加热1小时以使所有的酶活性失活。基于总干物质，自溶产物的RNA含量为8.7%w/w。将自溶产物的一部分用5’-磷酸二酯酶处理，这导致5’-GMP的量为2.65%w/w，所述量表示为七水合物二钠盐，并基于无氯化钠的干物质。可推断出，可降解为5’-核糖核苷酸的RNA组分为83%（w/w）。通过在5.1（比较实验）、4.2（实验1）或3.5（实验2）的pH下离心，使自溶产物的另一部分经历第一次固/液分离。收集细胞壁组分，而不用进一步的pH调整，用水洗涤两次，并分析RNA含量。通过添加水，将澄清提取物（作为上清液）调整至干物质含量为13%或2.5%，并随后分析浊度。在65℃的温度和5.3的pH下，用5’-磷酸二酯酶进一步处理细胞壁组分。接着，在55℃的温度和pH5.1下，通过脱氨酶，将5’-AMP转化为5’-IMP。在5’-磷酸二酯酶和脱氨酶二者处理之后，通过离心手段，使细胞壁组分经历第二次固/液分离，并对澄清组分分析5’-核糖核苷酸含量。将一些样品也用5’-Fdase孵育，以确定样品中存在的RNA是否可被转化为5’-核糖核苷酸（即，通过例如5’-Fdase，RNA是否是可降解为5’-核糖核苷酸的形式），并且将这些样品中的一些也用脱氨酶处理，以将5’-AMP转化为5’-IMP。随后，根据下述方法，通过HPLC手段，测定样品中5’-GMP、5’-AMP和5’-IMP的量（表示为其七水合物二钠盐的重量百分比，并基于无氯化钠的干物质）。使用WhatmanPartisil10-SAX柱，pH3.35的磷酸缓冲液作为洗脱液以及UV检测，通过HPLC确定酵母提取物中的5’-GMP、5’-AMP和5’-IMP的量。基于5’-GMP、5’-IMP和5’-AMP标准物，计算浓度。通过用Jenway氯化物计PCLM3（Jenway，Essex，英国）测量样品中的氯离子来测定氯化钠，并计算对应的氯化钠的量。表1.实施例1的结果如下分析RNA：在碱性处理期间水解RNA。使用5’-GMP作为标准物、使用WhatmanPartisil10-SAX柱、pH3.35的磷酸缓冲液作为洗脱液和UV检测，通过HPLC手段确定GMP（即，得自RNA水解的2’-GMP和3’-GMP）的量。基于无氯化钠干物质的RNA含量的重量百分比相当于基于无氯化钠干物质的游离GMP的重量百分比的约4倍。在20℃的温度下，用装有钨灯（400-600nm）的HACH2100N浊度计（Hach-Lange，Düsseldorf，德国）通过比浊法测定浊度。实施例2作为pH的函数的RNA在细胞壁和上清液间的分配范围从2.0至5.01的pH值下重复实施例1的实验。除了在分析浊度之前通过添加水，将澄清提取物（上清液）调整至干物质含量为5%之外，所有的条件是相同的。还有，细胞壁组分中的RNA不经5’-Fdase消化。表2.实施例2结果*细胞壁和上清液中的RNA之和定义为100%。