用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒的制作方法

专利名称：用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒的制作方法
用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒本申请是申请日为2006年9月29日、申请号为“200680043159.5”、题为“用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒”的中国专利申请的分案申请。领域本发明一般涉及用于扩增核酸同时减少非特异性荧光和不需要的扩增产物的组合物、方法和试剂盒。介绍尽管聚合酶链式反应(PCR)及相关的技术对于各种应用是高度有用的，但是由于不理想的副反应而引起的非靶核酸的扩增可能存在显著的问题。这样的副反应可以作为非靶核酸的错误引发和/或引物寡聚化(有时也叫作引物二聚体形成)，以及这些引发的假体(artifacts)的后续扩增的结果而发生。在使用具有显著的背景核酸而靶核酸以低拷贝数存在的核酸混合物进行PCR的应用中，这是特别实际的(参见，例如，Chou等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)20:1717-1723(1992))。非特异性扩增产物的产生已经至少部分归因于延长非特异性退火的引物 的环境温度下的DNA聚合酶活性(参见，例如，id.；Li等，Proc.Natl.Acad.Sc1.(美国国家科学院学报)87:4580 (1990))。因此，在环境温度下抑制DNA聚合酶的活性有利于控制次级扩增子的产生。已经描述了一些技术，据说其减少不需要的次级扩增产物的形成。按照某些“手工热启动”技术，直到混合物的温度足够高足以防止非特异性引物退火时才加入对DNA聚合酶活性重要的成分(例如，二价离子和/或DNA聚合酶本身)到反应混合物中(参见，例如，Chou 等,Nucl.Acids Res.(核酸研究)20:1717-1723 (1992);和 D’Aquila 等,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)19:3749 (1991))。较少劳动力-密集型技术应用扩增反应的至少一种成分的物理分离或可逆失活。例如，镁或DNA聚合酶可以隔离在蜡珠中，当反应温度升高时蜡珠熔化，只在升高的温度释放所隔离的成分。按照其它的技术，对DNA聚合酶进行可逆地失活或修饰，例如，通过DNA聚合酶的可逆的化学修饰或与抗体的结合(参见，例如，Birch等，美国专利号5，677，152)。在升高的反应温度，所述化学修饰被逆转，或者所述抗体分子变性，释放出功能性DNA聚合酶。然而，一些这样的技术似乎是有漏洞的，原因在于在更低的反应温度，一些DNA聚合酶活性是可检测到的，或者它们需要将反应混合物延长暴露于高温才能完全使得DNA聚合酶失活。某些目前所用的核酸扩增技术包括检测和/或定量扩增产物的步骤，其包括核酸染料，例如但不限于，SYBR Green I (分子探针(Molecular Probes), Eugene, OR),包括某些实时和/或终点检测技术(参见，例如，Ririe等，Analyt.Biochem.(分析生物化学)245 =154-60 (1997))。典型地，所述核酸染料与扩增产物的双链片段和/或引物_模板双链体缔合，并且在特别的核酸染料所特有的波长发射可检测的荧光信号。某些扩增方法包括评估扩增产物的纯度的检测步骤，其包括核酸染料，例如但不限于，PCR后解离曲线分析，其也叫作解链曲线分析。由于扩增子的解链曲线特别取决于它的长度和序列，所以扩增子通常可以通过它们的解链曲线而区分(参见，例如，Zhang等，Ifepatology(肝脏病学)36:723-28(2002))。解离或解链曲线可以在特定的扩增反应过程中当反应温度经过所述扩增子的解链温度时通过检测核酸染料的荧光而获得。双链扩增子的解离观察为在所述核酸染料特征性发射波长的荧光的突然减少。按照某些解离曲线分析技术，当解链曲线表现出单一的、一致的解链温度时，有时在荧光强度的负导数相对温度(-dF/dt相对T)的图上绘图性表示为一个峰，那么将扩增产物分类为“纯的”。例如，在来自单丛扩增的这样的解离曲线中出现多个峰典型地表明存在不需要的副反应产物。当应用这样的基于核酸染料的扩增产物检测技术时，通常理想地:1)至少减少并且优选地消除不需要的副反应产物的形成，和2)至少减少并且优选地消除由其它核酸，即非扩增产物的双链片段的变性导致的荧光峰。除此之外，由于引物、连接探针、裂解探针、启动子-引物等的非特异性退火，以及随后在亚最佳温度的酶活，某些其它扩增技术也可以产生不需要的扩增产物。例如，尽管反应成分通常是室温下结合，或者尽管反应组合物被加热到需要的反应温度。这些技术中至少有一些可以受益于背景荧光的减少。发明概述本发明涉及用于扩增靶核酸同时减少非特异性荧光和不需要的扩增产物的组合物、方法和试剂盒，所述不需要的扩增产物在本领域中有时叫作次级扩增子或假性副产物。本发明公开了包括核苷酸序列和猝灭剂的酶抑制剂。所述公开的抑制剂设计成抑制酶的至少一种酶活性。在某些实施方案中，所述酶抑制剂的核苷酸序列包括适体。在一些实施方案中，酶抑制剂包括能够形成至少一个双链片段的适体(参见，例如，Yakimovich 等,Biochem.(Mosc.)(生物化学(莫斯科))68(2):228-35(2003) ;Nickens 等,RNA9:1029-33(2003) ;Nishikawa 等，Oligonucleotides (寡核苷酸)14:114-29(2004);和Umehara等，J.Biochem.(生物化学杂志)137:339-74 (2005))。在一些实施方案中，酶抑制剂包括多样的不同的猝灭剂。在某些实施方案中，所述酶抑制剂可以呈现出一种构象，所述构象在第一温度包括至少一个双链片段，但是当加热到第二温度时，是单链的或基本上单链的。按照某些实施方案，包括至少一个双链片段的酶抑制剂可以与下列各项中的至少一种形成复合体=DNA聚合酶 ，包括但不限于反转录酶；RNA聚合酶；裂解酶，包括但不限于，结构-特异的核酸酶；解旋酶；和连接酶。在某些实施方案中，酶抑制剂是相对应的酶的无效底物，原因在于所述抑制剂包括封闭基团、核苷酸类似物、不可裂解的核苷酸间连接或它们的组合。本发明公开了包括核苷酸序列和猝灭剂的DNA聚合酶抑制剂。一些DNA聚合酶抑制剂包括两种或多种猝灭剂，其可以是相同的猝灭剂或不同的猝灭剂。在某些实施方案中，DNA聚合酶抑制剂还包括小沟结合物，其在一些实施方案中包括猝灭剂。在一些实施方案中，DNA聚合酶抑制剂的核苷酸序列的3’-端不能被DNA聚合酶延伸，这典型地是由于封闭基团或非延伸核苷酸的存在。在一些实施方案中，DNA聚合酶抑制剂的核苷酸序列包括能够形成至少一个双链片段的适体(参见,例如,Yakimovich等,Biochem.(Mosc.)(生物化学(莫斯科))68(2):228-35(2003))。本发明提供包含酶和酶抑制剂的复合物。某些复合物包含:DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制剂；连接酶和连接酶抑制剂；RNA聚合酶和RNA聚合酶抑制剂；裂解酶和裂解酶抑制剂；或解旋酶和解旋酶抑制剂。某些复合物还包含脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，核苷酸类似物，辅助蛋白，例如但不限于单链结合蛋白(SSB)或增殖细胞核抗原(PCNA)，或它们的组合。典型地，所述酶-酶抑制剂复合物可以在第一温度形成，并且当与在所述复合物中的抑制剂缔合时，所述酶的至少一种催化活性被抑制。当将所述复合物加热到第二温度时，所述复合物解离，释放所述酶。在某些实施方案中，酶-酶抑制剂复合物包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制剂。在某些实施方案中，DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制剂复合物还包括核苷酸三磷酸(NTP)和/或核苷酸类似物。某些复合物实施方案包括与DNA聚合酶缔合的以茎-环构象存在的DNA聚合酶抑制剂，并且任选地，NTP和/或核苷酸类似物。某些复合物实施方案包括与DNA聚合酶抑制剂缔合的DNA聚合酶，并且任选地，NTP和/或核苷酸类似物，所述DNA聚合酶抑制剂包括退火形成包含至少一个双链片段的双链体的至少两个寡核苷酸。典型地，当它与本发明的DNA聚合酶抑制剂，并且任选地，NTP和/或核苷酸类似物复合时，所述DNA聚合酶的DNA合成活性被抑制。本发明公开减少非特异性荧光的方法，其包括本发明的酶抑制剂。按照某些方法，在适合形成酶-酶抑制剂复合物的条件下，将酶与酶抑制剂接触。当所述酶存在于所述复合物中时，所述酶的至少一种酶促活性被抑制。当将所述酶-酶抑制剂复合物加热到适当的第二温度时，所述复合物解离，将所述酶释放。一些减少非特异性荧光的方法包括本发明的DNA聚合酶抑制剂。按照某些这样的方法，反应组合物在第一温度形成，其包括:DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝灭剂的DNA聚合酶抑制剂，NTP和/或核苷酸类似物，靶核酸，引物和核酸染料。在某些实施方案中，所述引物包括引物对。在第一温度，所述DNA聚合酶抑制剂包括至少一个双链片段，并且可以与所述DNA聚合酶形成复合物。DNA聚合酶抑制剂的猝灭剂可以吸收与所述DNA聚合酶抑制剂的双链片段缔合的核酸染料的至少一些荧光信号。将所述反应组合物加热到第二反应温度，所述第二反应温度典型地接近、处于或者高于所述DNA聚合酶抑制剂的解链温度，这引起至少一些所述DNA聚 合酶抑制剂-DNA聚合酶复合物的解离。将所述反应组合物进行至少一个扩增循环，并且产生扩增子的多样性。由于与所述扩增子缔合的核酸染料的荧光，在“实时”或在扩增反应完成后，可以检测到双链扩增子，但是与所述DNA聚合酶抑制剂的双链片段缔合的核酸染料的荧光至少被猝灭剂减少。本发明还公开了扩增靶核酸的方法，其使用本发明的酶抑制剂。按照某些这样的方法，反应组合物在第一温度形成，其包括:DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝灭剂的DNA聚合酶抑制剂，NTP，靶核酸，引物，和核酸染料。在某些实施方案中，所述引物包括引物对。在第一温度，所述DNA聚合酶抑制剂包含至少一个双链片段，并且可以与DNA聚合酶形成形成复合物。所述DNA聚合酶抑制剂的猝灭剂可以吸收由与所述DNA聚合酶抑制剂的双链片段缔合的核酸染料发射的至少一些荧光。将所述反应组合物加热到第二反应温度，所述第二反应温度典型地接近、处于或者高于所述DNA聚合酶抑制剂的解链温度，这引起至少一些所述DNA聚合酶抑制剂-DNA聚合酶复合物的解离。将所述反应组合物进行至少一个扩增循环，并且产生扩增子的多样性。在某些实施方案中，由于在所述反应组合物中存在DNA聚合酶抑制剂，所产生的扩增子的量增加。按照某些方法，反应组合物包括靶核酸，酶，酶抑制剂，核酸染料和下列各项中的至少一种:NTP，核苷酸类似物，引物，连接探针对，裂解探针对，启动子-引物，辅因子，例如但不限于包含NAD+的物质，和辅助蛋白，其包括但不限于PCNA和/或SSB。按照某些方法，将连接酶与连接酶抑制剂接触，并且在适当的条件下，形成连接酶-连接酶抑制剂复合物。按照某些方法，将裂解酶与裂解酶抑制剂接触，并且在适当的条件下，形成裂解酶-裂解酶抑制剂复合物。按照某些方法，将解旋酶与解旋酶抑制剂接触，并且在适当的条件下，形成解旋酶-解旋酶抑制剂复合物。按照一些方法，将RNA聚合酶与RNA聚合酶抑制剂接触，并且在适当的条件下，形成RNA聚合酶-RNA聚合酶抑制剂复合物。本发明还公开用于进行某些本发明方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括包含核苷酸序列和猝灭剂的酶抑制剂。在某些实施方案中，试剂盒包括两种或多种不同的酶抑制剂。在一些实施方案中，酶抑制剂可以与RNA聚合酶、解旋酶、裂解酶或连接酶形成复合物。某些试剂盒实施方案还包括裂解探针组、连接探针组、引物、启动子-引物或它们的组合。某些试剂盒实施方案包括包含核苷酸序列和猝灭剂的至少一种DNA聚合酶抑制齐U。在一些实施方案中，试剂盒包括两种或多种DNA聚合酶抑制剂。在某些实施方案中，DNA聚合酶抑制剂包括小沟结合物。某些试剂盒实施方案还包括下列各项中的至少一种:引物，引物对，核酸染料，DNA聚合酶，和报道探针。在一些实施方案中，试剂盒包括DNA-依赖型DNA聚合酶和反转录酶。在本文中描述了本发明的这些和其它特征。附图 熟练的技术人员应该理解下文所述的附图只是举例说明的目的。这些附图并不意欲以任何方式限制本发明的范围。凰丄^示意性描述包含单一寡核苷酸的某些代表性酶抑制剂的示例实施方案。示意性描述包含多样性寡核苷酸的某些代表性酶抑制剂的示例实施方案。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制剂获得的解离曲线，其作为荧光的负导数(-dF/dt)相对于温度。C绘图。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制剂获得的解离曲线，其作为荧光的负导数相对于温度。C绘图。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制剂获得的解离曲线，其作为荧光的负导数相对于温度。C绘图。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制剂获得的解离曲线，其作为荧光的负导数相对于温度。C绘图。描述琼脂糖凝胶的照片。将包含在不同浓度的代表性酶抑制剂中产生的扩增子的系列热循环反应组合物的等分试样在非变性琼脂糖凝胶的分开泳道中进行电泳，并且用溴化乙锭显现，如在实施例2中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200碱基对，800碱基对，400碱基对，200碱基对，和100碱基对大小标准物；泳道B-G:分别为包含5，10，25，50，75或IOOnM DNA聚合酶抑制剂E的热循环反应组合物的等分试样；泳道H:包含50nMDNA聚合酶抑制剂E的无模板对照反应组合物；泳道1:空白。描述琼脂糖凝胶的照片。将包含在不同浓度的代表性DNA聚合酶抑制剂中产生的扩增子的系列热循环反应组合物的等分试样在非变性琼脂糖凝胶的分开泳道中进行电泳，并且用溴化乙锭显现，如在实施例3中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200碱基对，800碱基对，400碱基对，200碱基对，和100碱基对大小标准物；泳道B-H:分别为包含0,5,10，25，50，75或IOOnM DNA聚合酶抑制剂E的热循环反应组合物的等分试样；泳道1:包含50nM DNA聚合酶抑制剂E的无模板对照反应组合物。描述非变性琼脂糖凝胶的照片，表现出由干存在代表性的DNA聚合酶抑制剂而导致的次级扩增子的减少，如在实施例4中所述。

图10:描述按照本发明的代表性方法产生的代表性解离曲线，如在实施例5中所述。示例性实施方案的描述应该理解，前文的概括描述和下述详细描述都只是示例性的和解释性的，并不是意欲限制本发明的范围。当用于本说明书中时，词语“a(—个)”或“an(—种)”意指至少一个，除非特别另外阐明。在本说明书中，单数的应用包括复数，除非特别另外阐明。例如但不是作为限制，“一种靶核酸”意指可存在不止一种靶核酸；例如，一个或多个拷贝的特别的靶核酸种类，以及两种或多种不同种类的靶核酸。此外，使用“comprise (包括)”，“comprises (包括)”, “comprising (包括)”, “contain (含有)”, “contains (含有)”，“containing (含有)，，,“ include (包含)，，,“ includes (包含)”,和“ including (包含)，，并不意欲限制。术语“和/或”意指前和后的术语可以一起或分开采用。出于举例说明的目的，而不是作为限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或者“X和Y”。本文所用的部分标题只是出于组织的目的，并不是解释为以任何方式限制所述的主题。在本说明书中引用的所有文献，包括但不限于专利、专利申请、论文、书和论述都通过引用完全清楚地结合用于任何目的。在任何所结合的文献与本说明书中定义的任何术语相抵触的事件中，由本说明书控制。尽管本发明与许多实施方案结合进行描述，但是并不倾向于本发明应该被所述的实施方案所限制。相反，本发明包括各种备选方案、修改和等价物，这是本领域的技术人员应该理解的。John ff.Brandis 的美国专利申请系列号 10/762, 222,题目为 “CompetitiveKinetic Nucleic Acid DN A polymerase inhibitors (竞争性动力学核酸 DNA 聚合酶抑制齐U)”，其与2004年I月11日提交，通过引用完全清楚地结合于此用于任何目的。一些定义当参考从核酸染料发射的荧光信号应用时，术语“吸收至少一些”是指由于酶抑制剂的一种或多种猝灭剂的存在而导致的可检测的荧光的减少。吸收由与酶抑制剂的双链片段缔合的核酸染料发射的荧光中的至少一些，意指相对于在除了所述酶抑制剂不包括猝灭剂之外包括相同的成分的反应组合物中的可检测的荧光，在所述核酸染料特有的发射波长处的可检测的荧光中存在可测量的减少。在一些实施方案中，在可检测的荧光中的可测量的减少意指在荧光中的 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，97 %，98 %，99 % 或大于99 %的相对减少。在某些实施方案中，其中所述至少一种猝灭剂包括荧光猝灭剂，在所述核酸染料特有的波长处的可检测的荧光中可存在可测量的减少，并且在所述酶抑制剂的至少一种荧光猝灭剂的特征发射波长处的可检测的荧光中可存在可测量的减少。当用于本文时，术语“扩增子”和“扩增产物”通常是指扩增反应的产物。扩增子可以是双链的或单链的，并且可以包括通过将双链的扩增产物变性而获得的分开的组成链。在一些实施方案中，扩增子包括连接产物(例如但不限于连接的探针)，连接产物的至少部分的补体，或二者。在某些实施方案中，一个扩增循环的扩增子可以作为后续扩增循环的模板。
术语“退火(annealing) ”和“杂交(hybridizing) ”,包括但不限于源单词杂交(hybridize)和退火(anneal)的变化,是可以互换地使用的，并且意指一种核酸与另一种核酸的核苷酸碱基-配对的相互作用，其导致形成双链体、三链体或其它更高级的结构。在本发明的一些实施方案中，退火或杂交是指在相同的酶抑制剂的至少两个区域中的至少一些核苷酸之间的相互作用，以形成发夹或茎-环结构，有时称为自我退火。一级相互作用典型地是核苷酸碱基特异性的，例如，A:T, A:U，和G:C，通过沃森-克里克和Hoogsteen-型氢键作用。在某些实施方案中，碱基-堆积和疏水相互作用还可以有助于双链体稳定性。引物和探针退火成为互补序列的条件是本领域公知的，例如，如在Nucleic AcidHybridization, A Practical Approach (核酸杂交，实用方法)，Hames 和 Higgins,编，IRL出版，Washington, D.C.(1985)和 Wetmur 和 Davidson, Mol.Biol.(分子生物学)31:349,1968中所述。通常，这样的退火是否发生特别受下列各项的影响:某些酶抑制剂的相对应的第一和第三区域和/或第四和第六区域的互补部分的长度，引物与它们在靶旁侧序列和/或扩增子中的相对应的结合位点的互补部分的长度，裂解探针或连接探针和靶核酸或扩增子的相对应的结合部分的互补部分的长度，或者报道探针与其结合位点的相对应的互补部分的长度；pH ;温度；单价和二价阳离子的存在；在杂交区域的G和C核苷酸的比例；介质的粘度；以及变性剂的存在。这样的变量影响杂交所需要的时间。在某些酶抑制剂实施方案中，在所述抑制剂、探针和/或引物中存在特定的核苷酸类似物或小沟结合物还可以影响杂交条件。因此，优选的退火条件将取决于具体的应用。然而，这样的反应条件可以由本领域的普通技术人员常规确定，无需过度实验。优选地，选择退火条件，以在第二反应温度允许所述引物和/或探针选择性地与反应组合物中相对应的靶旁侧序列或扩增子中的互补序列杂交，而不以任何显著的程度与反应组合物中的不同的靶核酸或非靶序列杂交。术语“选择性杂交”及其变化意指，在适当的严格条件下，给定的序列(例如但不限于引物)与包含核苷酸的互补片段(string)(例如但不限于，靶旁侧序列或扩增子的引物-结合位点)的第二种序列退火，但是不与不需要的序列如非靶核酸、探针或其它引物退火。典型地，当反应温度升高到特别的双链序列的解链温度时，选择性杂交的相对量通常增力口，并且错位引发(mispriming)通常减少。在本说明书中，一种序列与另一种序列杂交或选择性杂交的叙述包括两种所述序列完全彼此杂交或选择性杂交的情形，以及只有所述序列中的一种或两种的部分与完 整的另一种序列或其它序列的部分杂交或选择性杂交的情形。当用于本文时，术语“严格性”用来定义在将形成包括两个互补核苷酸序列的杂合体的杂交和后续处理步骤中存在的温度和溶剂组成。严格性还定义同源性的量，需要的条件，和在两种核苷酸序列之间形成的杂合体的稳定性。当严格性条件升高时，对选择性杂交是有利的，并且对非特异性交叉杂交是不利的。相对于更低的严格性条件，其中更可能发生错误的引发，包括但不限于，连接探针和/或裂解探针的错误退火，增加的严格性条件典型地对应更高的温育温度，更低的盐浓度，和/或更高的pH。本领域的那些技术人员理解，能够使得引物或引物对、连接探针对和/或裂解探针对与相对应的靶旁侧序列和/或扩增子选择性杂交的适当的严格性条件可以使用已知的技术无需不必要的实验而常规确定(参见，例如，PCR:The Basics from background to bench(PCR:从后台到工作台的基础)，McPherson 和 Moller, Bios Scientific Publishers (生物科学出版社)(2000 ；以下为 “McPherson” ))。在本说明书中，一种核酸序列与另一种核苷酸序列相同或基本上相同的叙述包括两种核苷酸序列与另一种序列完全相同或者基本上相同的情形，以及所述核苷酸序列中的一种只有部分与完整的另一种序列的部分相同或基本上相同的情形。同样地，一种核酸序列与另一种核苷酸序列互补或基本上互补的叙述包括两种核苷酸序列彼此完全互补或基本上互补的情形，以及所述序列中的一种只有部分与完整的另一种序列的部分互补或基本上互补的情形。当用于本文时，术语“适体”是指DNA或RNA寡核苷酸，其:1)使用体外选择方法，例如但不限于“通过指数富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment) (SELEX) ”方法或其变化,典型地首先得到鉴定,并且2)以高特异性、构象-依赖性方式识别并且结合配偶体，例如但不限于酶。当用于本文时，术语“或它们的组合”是指在先术语所列条目的所有排列和组合。例如，“A，B，C或它们的组合”意欲包括下述的至少一种:A，B，C，AB, AC，BC,或ABC，并且如果在特别的情形中顺序是重要的，还包括BA，CA，CB,ACB, CBA, BCA, BAC,或CAB。继续使用这一实例，清楚地包括包含一个或多个条目或项目的重复，诸如BB，AAA, AAB, BBC, AAABCCCC,CBBAAA, CABABB等的组合。熟练的技术人员应该理解，典型地，在任何组合中对条目或项目的数目没有限制，除非另外从上下文中显而易见。当用于本文时，术语“互补(complementary) ”和“互补性(complementarity) ”参考通过碱基-配对法则而相关的至少两种核酸而应用。例如但不限于，序列“A-C-T”与序列“T-G-A”互补。互补可以是部分的，在这种情形中只有一些核苷酸按照碱基-配对法则而匹配。或者，在核酸之间可以存在完全的或全部的互补性。核酸链之间的互补性的程度对所述核酸链之间的杂交的效率和强度有显著的影响。对于稳定的双链体的形成，互补性不必是全部的，即，稳定的双链体可以包含错配的碱基对或不匹配的碱基。根据经验考虑许多变量，包括但不限于，核酸的长度、碱基组成和核酸的序列、离子强度和错配碱基对的发生率，本领域的技术人员可以确定双链体的稳定性。核酸双链体的稳定性典型地通过其解链温度而测量。当用于本文时，术语“复合物”和“酶抑制剂-酶复合物”是指在本发明的酶抑制剂和相对应的酶之间的缔合。在一些实施方案中，酶抑制剂-酶复合物包括DNA聚合酶，RNA聚合酶,连接酶,裂解酶,或解旋酶。术语抑制(inhibit),抑制(inhibits)或其变化，当参考酶应用时，是相对的术语，并且是指与所述酶在相同的扩增条件但是不存在酶抑制剂时的活性相比，酶活性的可测量的减少。在某些实施方案中，当与酶抑制剂复合时，通过在存在和不存在酶抑制剂的平行的扩增反应中产生的需要的扩增子的量而确定，所述酶的酶活性减少约40%，约50%，约60%，约70%，约80%，约85%，约90%，约95%，约96%，约97 %，约98 %，约99 %，或大于99 %。在某些实施方案中，当所述复合物还包含辅助蛋白、NTP、核苷酸类似物、包含NAD+的物质、或它们的组合时，获得最佳抑制。当用于本文时，术语“相对应”是指在所述术语涉及的要素之间的至少一种具体的关系。出于举例说明的目的而不是作为限制，特定引物对的至少一种正向引物对应同一引物对的至少一种反向引物；将至少一种引物设计成与相对应的靶核酸的旁侧区域和/或至少一种相对应的扩增子的引物 -结合部分退火；连接探针组的第一探针与靶核酸和/或连接位点上游、以及典型地邻近连接位点的扩增子退火，并且相对应的第二连接探针与靶核酸和/或连接位点的下游、以及典型地邻近连接位点的扩增子退火；在特定的酶抑制剂实施方案中，第一寡核苷酸与相对应的第二寡核苷酸退火，形成包含至少一个双链片段的双链体；等等。当用于本文时，术语“使变性(denaturing) ”和“变性(denaturation) ”是指这样的任何过程，其中适当地将双链多核苷酸转化成两个单链多核苷酸或者单链的或基本上单链的多核苷酸，所述双链多核苷酸包括但不限于，包括至少一种靶核酸的gDNA片段，双链扩增子，或包括至少一个双链片段的多核苷酸，例如但不限于在第一温度的酶抑制剂。使双链多核苷酸或酶抑制剂的双链片段变性包括但不限于，各种热和化学技术，其使得双链核酸或酶抑制剂的双链片段成为单链的或基本上单链的，例如但不限于，释放双链多核苷酸或者包含两个寡核苷酸的双链体的两个个体单链成分。本领域的技术人员应该理解，所用的变性技术通常没有限制，除非它显著妨碍后续的扩增反应的退火或酶促步骤，或者在某些方法中，干扰荧光信号的检测。当用于本文时，术语“双链的”是指沿着至少它们的长度的部分杂交的一个或两个核酸链。因此，在某些情形中，“双链的”可以指这样的单一寡核苷酸的部分，即，其可以折叠，以致所述寡核苷酸的第一区域的至少一个片段与同一寡核苷酸的第三区域的至少一个片段杂交，所述寡核苷酸的第四区域的至少一个片段与所述寡核苷酸的第六区域的至少一个片段杂交，或者二者，由此形成一个或多个双链片段和一个或多个单链的部分。因此，单一的核酸链可以形成具有双链和单链片段的发夹或茎-环构象(参见，例如，图1)。类似地，两个互补的寡核苷酸可以彼此杂交，以形成双链体(参见，例如，图2)。因此，“双链的”并不意味着核酸必须是完全双链的。相反，双链的核酸可以具有一个或多个单链片段和一个或多个双链片段。术语“第一温度”是指可以形成酶-酶抑制剂复合物的温度，通常是温度范围。术语“第二温度”是指酶-酶抑制剂复合物解离或不形成的温度，通常是温度范围。本领域的技术人员应该理解，第二温度典型地处于或者接近所述酶抑制剂的Tm，而第一温度典型地低于所述酶抑 制剂的Tm，以允许所述酶抑制剂呈现包括至少一个双链片段的构象。一种示例性的第一温度可以是环境温度或“室温”。当用于本文时，术语“Tm”参考解链温度应用。解链温度是大量的双链核酸分子半解离成单链的温度。“微观流体装置”是一种反应容器，其包括至少一个微通道，所述微通道通常包括I毫米或更小的内部尺寸。微观流体装置典型地应用非常小的反应体积，通常在一个或几个微升(UL)、毫微升(nanoliter)或兆分之一升(picoliter)的数量级。本领域的技术人员应该理解，微观流体装置的大小、形成和组成通常不限于本发明。相反，可以应用任何适当的微观流体装置进行所公开的方法的一个或多个步骤。除其它地方之外，示例性的微观流体装置及其应用的描述可以特别见于在Fiorini和Chiu, BioTechniques (生物技术)38:429-46(2005) ；Kelly 和 Woolley, Analyt.Chem.(分析化学)77(5):96A_102A(2005)；Cheuk-Wai Kan 等，Electrophoresis (电泳)25:3564-88 (2004);和 Yeun 等，Genome Res.(基因组研究)11:405-12 (2001)。当用于本文时，术语“小沟结合物”是指匹配双链DNA中的小沟的小分子，有时以序列特异的方式匹配。通常，小沟结合物是长的、平的分子，其可以采用月牙样的形状，并且因此贴切地匹配到双螺旋的小沟中，通常替代水。小沟结合分子典型地包括通过具有扭转自由度的键连接的一些芳香环，例如但不限于，呋喃、苯或吡咯环。“错误引发”或“错误引发的”，当用于本文时，是指引物或探针与非靶核酸的杂交。如本领域内已知的，引物(不包括随机引物)通常设计成与侧连靶核酸的选择序列杂交或与扩增子的引物-结合位点杂交，并且设计成引导DNA合成或在所述位点的引物延伸起始。当引物或探针与非靶核酸杂交，这通常在低或减少的严格性条件下发生，并且然后作为引物从所述非靶位点延伸的起始点时，可以发生错误-引发，产生某些不需要的次级扩增产物的合成。连接探针对和裂解探针对还可以与非靶核酸错误退火，这通常在低或减少的严格性条件下发生，这还可以导致不需要的扩增产物的形成。术语“不可延伸的核苷酸”，当用于本文时，是指基本上没有其它核苷酸可以通过聚合酶添加到其上的核苷酸。在一些实施方案中，所述不可延伸的核苷酸是不具有与另一个核苷酸形成磷酸二酯连接的最适官能团的核苷酸类似物。在某些实施方案中，所述不可延伸的核苷酸是本质上不允许引物延伸的链-终止核苷酸，例如二脱氧核苷酸(ddNs)，诸如ddA，ddC，ddG，ddl，ddT，和ddU。在一些实施方案中，聚合酶可以将其它核苷酸连接到不可延伸的核苷酸上，但是以缓慢的速率进行。术语“非特异性的”或“背景”，当参考荧光应用时，是指从与双链核酸缔合的核酸染料分子而不是需要的扩增子发射的可检测的信号。需要的扩增子包括靶核酸的扩增产物，在一些实施方案中包括内标或对照序列，所述内标或对照序列可以包含在本发明的特定反应组合物中，特别用于标准化和/或定量目的。因此，由核酸染料分子与假的、次级扩增子的缔合产生的荧光信号是非特异性荧光的一个来源，所述假的、次级扩增子通常是错误引发、错误连接和/或引物二聚体形成的结果。本领域的技术人员应该理解，当本发明的酶抑制剂在第一温度包括核酸染料分子可以缔合的至少一种双链片段时，所述抑制剂的猝灭剂部分可以吸收来自 缔合的核酸染料，背景的次级来源的可检测的荧光信号中的至少一些，由此减少所述反应组合物的非特异性荧光。术语“核苷酸碱基”，有时叫作含氮碱基或氮杂环碱基，是指可以作为核苷酸成分的取代的或未取代的一个或多个芳香环。在某些实施方案中，所述一个或多个芳香环包含氮原子。在某些实施方案中，所述核苷酸碱基能够与互补的核苷酸碱基形成沃森-克里克或Hoogsteen-型氢键。示例性的核苷酸碱基及其类似物包括天然存在的核苷酸碱基:腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5甲基胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，以及天然存在的核苷酸碱基的类似物，其包括7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、N6- A 2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6- A 2-异戊烯基_2_甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N2_ 二甲基鸟嘌呤(dmG)、7_甲基鸟嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6- 二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-硫嘧啶、6-硫鸟嘌呤、4-硫胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氢胸腺嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、吡唑并[3，4-D]嘧啶(参见，例如，美国专利号6，143，877和6，127，121和PCT公布申请WO 01/38584)、亚乙烯腺嘌呤、吲哚如硝基吲哚和4-甲基吲哚，和吡咯如硝基吡咯。例如，核苷酸碱基的非限制性实例可以在Fasman,Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物学实践手册)，第385-394页，CRC出版社，Boca Raton,Fla.(1989)及其中引用的参考文献中找到。术语“核苷酸”，当用于本文时，是指核苷的磷酸酯，例如，三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是附着在戊糖C-5位置的羟基。术语“核苷酸”还通常用来指一组包括核苷和核苷酸的化合物，除非另外从上下文显而易见。术语“核苷”，当用于本文时，是指包括连接到糖如核糖、阿拉伯糖、木糖、和吡喃糖以及它们的糖类似物的c-r碳上的核苷酸碱基的化合物。所述糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖糖包括，但不限于，其中的一个或多个碳原子，例如，2 ’ -碳原子，被一个或多个相同的或不同的，-R, -OR, -NR2叠氮化物，氰化物或卤素基团取代的那些核糖，其中每个R独立地是H，C1-C6烷基，C2-C7酰基，或C5-C14芳基。示例性的核糖包括，但不限于，2’ -(C1-C6)烷氧基核糖，2’ -(C5-C14)芳氧基核糖，2’，3’ - 二脱氢核糖，2’ -脱氧-3’ -齒核糖，2’ -脱氧-3’ -氟核糖，2’ -脱氧-3’ -氯核糖，2’ -脱氧_3’ -氨基核糖，2’ -脱氧-3’ - (C1-C6)烧基核糖，2’ -脱氧-3’ - (C1-C6)烧氧基核糖和2’ -脱氧-3’ - (C5-C14)芳氧基核糖，核糖，2’ -脱氧核糖，2’，3’ -双脱氧核糖，2’ -齒核糖，2’ -氟核糖，2’ -氯核糖，和2’ -烷基核糖，例如，2’ -0-甲基，4’ -a-异头核苷酸，I’ -a-异头核苷酸，2’ -4’ -和3’ -4’ -连接的以及其它“锁定的(locked)”或“LNA”，二环糖修饰(参见，例如，PC T公布申请号WO 98/22489，WO 98/39352，和WO 99/14226 ;和Braasch 和 Corey，Chem.Biol.(化学生物)8:1_7，2001 ;和美国专利号 6，268，490)。“LNA”或“锁定核酸”是这样的核苷酸类似物，即，其构象被锁定，以致所述核糖环受到例如但不限于2’ -氧和3’ -或4’ -碳或具有2’ -5’主链的3’ -4’ LNA之间的亚甲基连接的限制(参见，例如，Imanishi和Obika,美国专利号6, 268, 490 ;和Wengel和Nielsen,美国专利号6，670，461)。由所述连接施加的构象限制通常提高互补序列的结合亲和性，并且提高这样的双链体的热稳定性。在多核苷酸内的示例性LNA糖类似物包括下述结构:
权利要求
1.一种酶抑制剂，所述酶抑制剂包含核苷酸序列和至少两种不同的猝灭剂，其中所述核苷酸序列包含至少一个双链片段。
2.一种包含酶和权利要求1的酶抑制剂的复合物。
3.权利要求2的复合物，其中所述酶包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，解旋酶，裂解酶，或它们的组合。
4.权利要求3的复合物，其中所述酶是聚合酶并且所述酶抑制剂是聚合酶抑制剂。
5.权利要求4的复合物，所述复合物还包含NTP，核苷酸类似物，或NTP和核苷酸类似物。
6.权利要求5的复合物，其中所述聚合酶抑制剂不可通过所述聚合酶延伸。
7.权利要求4的复合物，其中所述聚合酶抑制剂的核苷酸序列包括适体。
8.权利要求1或2的酶抑制剂或复合物，其中所述酶抑制剂的核苷酸序列包含核苷酸类似物。
9.权利要求1或2的酶抑制剂或复合物，其中所述酶抑制剂的核苷酸序列包含第一区域、第二区域、第三区域和任选第四区域；并且其中所述第一区域与所述第三区域互补。
10.权利要求9的酶抑制剂或复合物，其中所述第一区域、所述第三区域或所述第一区域和第三区域包含至少一个核苷酸类似物；并且其中所述第一区域包含第一猝灭剂而所述第二区域包含第二猝灭剂，并且任选地，所述第一猝灭剂和第二猝灭剂是不同的。
11.权利要求1或2的酶抑制剂或复合物，其还包括小沟结合物。
12.权利要求8的酶抑制剂或复合物，其中所述核苷酸类似物包括脱氮-dA、脱氮-dG、ddN、PNA, LNA或它们的组合。
13.权利要求1或2的酶抑制剂或复合物，其中所述核苷酸序列包括5’-TCTGGGATA(脱氮-dA) TT (脱氮-dA) TGGTA (脱氮-dA) ATATG (Tn) C (脱氮-dA) TATTTATT (脱氮-dA) TA (脱氮-dA) TTATC-3’，并且其中所述 Tn 包括 TT、ITT、TTTT, TTTTT 或 TmTT。
14.权利要求11的酶抑制剂或复合物，其中所述第一猝灭剂包括DABCYL、DABSYL、TAMRA, TET和ROX中的至少一种；并且所述小沟结合物还包括第二猝灭剂。
15.一种减少非特异性荧光的方法，该方法包括: (a)在第一温度，形成包含权利要求1的酶抑制剂、酶、靶核酸、引物和核酸染料的反应组合物，其中所述酶抑制剂和所述酶缔合形成复合物，并且其中所述至少两种不同的猝灭剂抑制与所述酶抑制剂的双链片段缔合的核酸染料的荧光； (b)将所述反应组合物加热到第二温度，以使所述复合物解离； (c)将所述反应组合物进行至少一个扩增循环，以产生多种扩增子；和 (d)在反应组合物中检测与所述多种扩增子缔合的核酸染料的荧光，其中所述猝灭剂抑制与所述酶抑制剂的核苷酸序列的双链片段缔合的核酸染料的荧光。
全文摘要
本发明涉及用于扩增靶核酸同时减少非特异性荧光和不需要的扩增产物，有时叫作次级扩增产物或假的副产物，的组合物、方法和试剂盒。本发明公开的酶抑制剂包括核苷酸序列和至少一种猝灭剂。本发明还提供包括与酶缔合的酶抑制剂的复合物，其中所述酶的至少一种酶促活性被抑制。本发明公开了用于扩增靶核酸同时减少不需要的扩增产物的方法，其是减少非特异性荧光的方法。本发明还提供了迅速进行某些公开的方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/48GK103215248SQ20131007645
公开日2013年7月24日 申请日期2006年9月29日 优先权日2005年10月3日
发明者董守连, 琼科·史蒂文斯, 丹尼·H·李 申请人:应用生物系统有限责任公司