专利名称：一种高转化效率的大肠杆菌表达菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种高转化效率的大肠杆菌表达菌株。
背景技术：
酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。高催化活性以及高催化专一性的酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率的蛋白突变体库的基础之一。突变体库也是研究基因或蛋白的结构和功能的关键手段。常规的得到蛋白突变体的实验步骤是将通过特定方法(如DNA shuffling和易错PCR)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌如DHlOB或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源异源蛋白表达宿主菌。其中大肠杆菌BL2KDE3)是最为常用的宿主菌，其他的菌株一般为此菌株的衍生菌株。采用提取质粒再转化BL21(DE3)的两步法而非直接转化BL21(DE3)的原因在于后者的转化效率较低，一般低十倍以上。低效率使得获得目的突变的几率大大降低而不被采用。两步转化法不仅增加了实验步骤，更为关键的是造成了一定量的(也可能是非常关键的)突变体库的损失。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株，该菌株是将大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)基因组中的hsdR基因敲除而获得。本发明所述的大肠杆菌表达菌株，是埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCCN0.7123或其变异体。埃希氏大肠杆菌CGMCC N0.7123是通过以下方法获得:首先将hsdR基因上下游各500bp的同源片段以及两侧含有18bp 1-SceI酶切位点的氯霉素抗性基因通过重叠延伸PCR融合在一起，此线性融合片段还包含下游500bp的同源片段之后的50bp的序列。将此线性融合片段电转化至表达重组酶的BL21 (DE3)，由重组酶催化同源片段之间的同源重组而将线性融合片段取代BL21(DE3)基因组上的hsdR基因部分，hsdR基因被敲除。随后经诱导表达的1-SceI作用于所得菌株基因组中的1-SceI酶切位点，引起基因组双链的断裂。此时菌株利用自身的同源重组系统如recA和recBCD催化线性整合片段和500bp的同源片段下游的两个50bp片段之间发生同源重组，即将两个片段之间的序列以及其中的一个片段去除，经过此步骤，修复了基因组双链的断裂，菌株恢复生长。最终得到hsdR基因敲除、且不含有任何的外源碱基序列的基因工程菌株。重组工程的基本原理是利用重组酶催化同源片段之间发生重组，而将基因组上的基因进行敲除。由于可以直接采用PCR扩增的中间含有抗性基因的线性同源片段(而无需将片段克隆至载体)进行转化，因此重组工程方法高效简便和快捷。本专利申请所使用的重组酶基因是指来源于λ噬菌体的red a，red^和red Y基因，重组酶基因是由IPTG诱导的受LacI基因所调节pLac启动子所驱动；1-SceI基因是由L-阿拉伯糖诱导的受araC基因所调节的PBAD启动子所驱动。LacI基因和araC基因的调节系统均为严谨调节系统，即不加诱导剂时，启动子下游的基因几乎不表达，这就保证了重组酶表达的严格时空性，不会过量表达而引起异常重组。BL21(DE3)基因组上不含有1-SceI酶切位点，故以1-SceI酶切可表现出良好的专一性。hsdR基因编码I型限制性内切酶，其功能可能是降解外源DNA。本专利将之敲除发现hsdR基因敲除变株较原株BL21 (DE3)转化效率提高14.5倍，达到4.5χ107/ μ g，原理上任何突变体可通过此高转化效率的菌株获得。从变株中提取的质粒酶切和蛋白表达实验确证了菌株的高转化效率，也证明了质粒在其中的正确复制和表达。高转化效率突变株将减少一个实验步骤，有利于简便快捷地获得突变体蛋白库。所获的菌株埃希氏大肠杆菌CGMCC N0.7123菌株的优点在于:转化效率较原株高14.5倍，不仅可以作为常规的蛋白表达菌株来使用，其优点在于可直接将连接液转化至此菌株来筛选重组克隆。而更显著的优点是可以将突变的基因库和载体的连接液转化至此菌株，来筛选得到突变体蛋白库。高转化效率的蛋白表达菌株将在蛋白质工程等研究领域有着重要的应用，如连接产物的转化效率一般为质粒的1/100，此时十余倍的转化效率将有助于获得更多的转化克隆，即覆盖更多的突变体，有利于迅速地筛选得到目的突变。作为获得高催化效率的催化用酶等工业化研究中的一个关键材料，本高转化效率的菌株将有着广泛的应用空间，也可能获得良好的经济效益。
图1是BL21(DE3)基因组中hsdR基因敲除实验各菌株基因型验证的凝胶电泳结
果O1.A-EcoT14- 1 DNA 分子量标准:10329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp,74bp ；2.BL21 (DE3)原株以R1742和R1736为引物进行菌落PCR的结果，得到4330bp的片段；3.BL21 (DE3)的氯霉素抗性基因取代hsdR基因所得变株LS1926以R1742-R1736为引物进行菌落PCR的结果，得到2500bp的片段；4.氯霉素抗性基因去除的、hsdR基因敲除的变株LS1928(基因型:BL21(DE3)AhsdR)以R1742-R1736为引物进行菌落PCR的结果，得到822bp的片段；5.DL2000DNA 分子量:2.0, 1.0, 0.75，0.5，0.25，0.lkb。图2是各菌株中所提取的pLS1942质粒DNA酶切验证结果。1.从 DHlOB 中提取的 pLS1942 以 NcoI 和 XhoI 双酶切，得到 1.0kb 和 5.4kb ；2和3.从BL21 (DE3)中提取的pLS1942以NcoI和XhoI双酶切，得到1.0kb和
5.4kb ；4.λ -EcoT14-1 DNA 分子量标准:10329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp,74bp ；5.DL2000DNA 分子量标准:2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb ；
6和7.从LS1928中提取的pLS1942以NcoI和XhoI双酶切，得到1.0kb和5.4kb。图3是BL21 (DE3)和LS1928两个菌株蛋白表达的结果。I 和 3.BL21 (DE3)/pLS1942 表达的总蛋白；2和4.BL21 (DE3)/pLS1942表达的可溶性蛋白；5.蛋白质分子量标准:116，66，45，35，25，18，14KDa ;6 和 8.LS1928/pLS1942 表达的总蛋白；7和9.LS1928/pLS1942表达的可溶性蛋白。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒:1.Escherichia c oli DH10B。 基因型 FlncrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ 80 Δ IacZ Δ M15 Δ lacX74deoRrecAl araD139A (ara, leu) 7697 galU galK rpsL endAlnupG.。文献:Life Technologies, Inc.Focus, 1990，12:19。购自美国 Invitrogen 公司。2.Escherichia coli BW25141。含Pir基因的大肠杆菌菌株，为含R6K复制子的质粒的宿主菌。文献:Datsenko KA, Wanner BL.0ne-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci USA.2000，97(12):6640-5。来自美国 Purdue 大学 Barry Wanner 教授。3.Escherichia coli BL21(DE3)。基因型 B F dcm ompT hsdS(rB mB )gal λ (DE3) o 购自美国 Invitrogen 公司。4.pACYC184。文献:Chang AC., Cohen SN.Construction and characterizationof amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A crypticminiplasmid.J Bacteriol 1978，134(3): 1141-56。购自美国 NEB 公司。5.pKD4o文献:Datsenko KA, Wanner BL.0ne-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K_12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U SA.2000，97(12):6640-5。来自美国 Purdue 大学 Barry Wanner 教授。6.pTKRecL 文献:Kuhlman TE, Cox EC.Site-specific chromosomal integrationof large synthetic constructs.Nucleic Acids Research, 2010, 38 (6), e920 来自美国Princeton 大学 Thomas Kuhlman 教授。7.实施例中所得到的菌株LS1928于2013年I月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC N0.7123。实施例1模板载体和表达载体的构建
扩增两侧两个带有1-SceI酶切位点的氯霉素抗性基因的模板载体以及检测原株和变株转化效率和蛋白表达的载体的构建过程如下。1.大肠杆菌电转化感受态细胞的制备和DNA转化自平板上接种新鲜划线培养的单菌落至2mlLB液体培养基中37° C振荡过夜，以1/50体积转至50ml LB,振荡培养至菌体0D_约为0.6。将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟后，4° C，5000rpm离心5分钟，弃上清。以10%的冷甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于200 μ I的10%的冷甘油中，每管50 μ I分装。将溶解于双蒸水的DNA加至50 μ I冰上融化的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的Imm电转杯中，电击转化。电转化条件:200 Ω，1800V, Bio-Rad公司Gene Pulser IIk电转化仪。电击后，加Iml LB液体培养基至电转杯，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5ml eppendorf管中，37° C振荡培养60分钟后,转化液涂布在相应抗生素的抗性平板上，37° C培养过亿。挑取单菌落在含相应抗生素的LB液体培养基中培养，提取质粒，酶切和测序鉴定。2.两侧含1-SceI酶切位点和氯霉素抗性基因的模板载体的构建设计引物R443: 5' -GGAATCGATTAGGGATAACAGGGTAATTGAAATAAGATCACTACCGGG-3’，(SEQ I D N0.1) ；R444:5’ -CATACGGAATTCCGGATGAGCATTC-3’，(SEQ ID N0.2) ；R445:5’-GAATGCTCATCCGGAATTCCGTATG-3’，(SEQ ID N0.3)；R446:5’-GGGTCTAGAATTACCCTGTTATCCCTATTACGCCCCGCCCTGCCACTC-3’，(SEQ ID N0.4)。R443 所引入的 ClaI 酶切位点和 R446 所引入的XbaI位点以下划线表示；斜为18bp的1-SceI酶切位点；R444和R445的序列位于氯霉素抗性基因中，二者为反向互补，其中的EcoRI酶切位点以带下划线表示。以pACYC184为模板，R443-R444为引物PCR扩增得到0.3kb，R445-R446为引物PCR扩增得到0.5kb。将
0.3kb以ClaI和EcoRI双酶切，0.5kb以/EcoRI和XbaI双酶切，两个片段自凝胶纯化后，和以ClaI和XbaI双酶切pKD4所得的载体片段相连接，连接产物转化BW25141的感受态细胞，在含50 μ g/ml氨苄青霉素和25 μ g/ml氯霉素的LB固体平板上进行筛选。抗性克隆经培养、提质粒酶切和测序验证得到重组质粒PLS1934，此质粒用做大肠杆菌基因敲除实验中扩增两侧带有1-SceI酶切位点的氯霉素抗性基因的模板。pLS1934使用R6K复制子，以含有Pir基因的BW25141为宿主菌，而表达宿主菌BL21 (DE3)的基因组不含有Pir基因，因此以pLS1934做模板所得到的PCR产物可以直接沉淀回收，残余的pLS1934不会有转化的抗性克隆化背景的干扰，就简化了实验流程。3.yihS基因表达载体的构建yihS基因异构酶编码可能的N-乙酰_D_葡萄糖胺2_异构酶基因。N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶是酶法催化合成神经氨酸的第一步用酶，蛋白表达以及对其进行改造的蛋白质工程是充分利用酶活的必须步骤。为实现yihS基因的表达，设计引物 Η1:5’-GAACCATGGGGCTGCTGGGTGCCGCCAGCGCC-3，，(SEQ ID N0.5)；YIH2:5’-GAACTCGAGTTATTTCGCATTAATATCCAGC-3’，(SEQ ID N0.6)，所分别引入的NcoI和XhoI酶切位点以下划线表示。以克隆宿主菌DHlOB的基因组DNA为模板，YIHl和 Η2扩增得到1.0kb的yihS基因，经NcoI和XhoI酶切后与表达载体pET30a(+)相同酶切的载体相连，转化DHlOB的电转化感受态细胞，在含30 μ g/ml卡那霉素的LB固体平板上进行筛选，经过酶切和测序验证得到yihS表达载体PLS1942。
实施例2BL21 (DE3)菌株基因组中hsdR基因的敲除BL21 (DE3)菌株基因组中hsdR基因敲除的实验过程如下所述。1.表达重组酶菌株的感受态细胞的制备和DNA转化将含pTKRed质粒的菌株于含100 μ g/ml大观霉素的LB固体培养基划线后于30° C培养,单菌落接种于相同的培养基于30° C振荡培养过夜。以1/50体积比转至相同的培养基，振荡培养至菌体0D_约为0.2时，加入终浓度为2mM IPTG来诱导重组酶的表达，继续培养至菌体0D_约为0.6。后续的感受态细胞的制备和DNA转化的同实施例1中的实验步骤。培养温度均为30° C以维持pTKRed质粒的复制。2.BL21 (DE3)菌株基因组中hsdR基因的敲除设计引物R1738:5’-CAGATGGTTCGTCTCCTGCTC-3’，(SEQ ID N0.7) ；R1739:5’-GAAGGATGAAGTGTATACGTGTCACATTGTTATTAATCCATTGCTGTGTGG-3’，(SEQ ID N0.8)；Pl:5，-GTGACACGTATACACTTCATCCTTCAGGCTGCCTCTGCGTTGGCTGCGCTCAACAAATAGGGGTTCCGCGC-3’，(SEQ ID N0.9)；P2:TCCTTAGTTCCTATTCCGAAG_3’，(SEQ ID N0.10) ；R1740:5’-CTTCGGAATAGGAACTAAGGAGCCGCAGGATTTCCTCGAAGC-3’，(SEQ ID N0.11) ；R1741:5’ -GGCCAGCTCGTCCCAAATGTAATC-3’，(SEQ ID N0.12)。R1739 和 Pl 的前 25bp 为反向互补；R1740的下划线21bp与P2为反向互补。Pl中的50bp下划线序列与hsdR基因开放阅读框下游500bp片段之后的50bp序列一致。
以BL21 (DE3)的基因组DNA为模板，R1738和R1739为引物PCR扩增得到hsdR基因开放阅读框上游的500bp片段；R1740和R1741为引物PCR扩增得到开放阅读框下游的500bp片段；以pLS1934为模板，Pl和P2为引物PCR扩增得到1.1kb的氯霉素抗性基因。纯化三个PCR产物，合并作为模板，以R1738-R1741为引物PCR扩增得到2.1kb的融合片段。将此2.1kb电转化至由IPTG诱导表达重组酶的BL21 (DE3) /pTKRed电转化感受态细胞，重组酶催化2.1kb中的两个500bp片段和基因组中的同源片段进行同源重组，在氯霉素的筛选作用下，得到hsdR基因敲除、氯霉素抗性基因以及两侧1-SceI作用位点整合的抗性变株。设计引物R1742:5’-ATCTAACCGATCGTCCGGGC-3’，(SEQ ID N0.13) ；R1746:5’-GTTCCGTAAATTAAGCAGCGG-3’ ,(SEQ ID N0.14)。随机挑取 5个氯霉素抗性克隆，，以 R1742和R1746进行菌落PCR来抗性变株的基因型，5个抗性变株均得到目的大小2.5kb ;酶切也都正确，表明得到了 hsdR基因被两侧含有1-SceI作用位点的氯霉素抗性基因所取代的菌株，其基因型为 BL21 (DE3) Δ hsdR:: cat, pTKRed。随机挑取两个克隆，在含100 μ g/ml大观霉素的LB培养基中于30° C培养，加入
1.5%的L-阿拉伯糖诱导20小时。将培养液稀释IO6后涂布LB平板，随机挑选150个克隆影印至LB平板和含25 μ g/ml氯霉素的LB平板，发现所有的克隆均表现为氯霉素敏感性，表明L-阿拉伯糖诱导表达的1-SceI催化了双链断裂修复。随机挑取5个克隆，以R1742和R1746进行菌落PCR，发现菌株均得到0.8kb的目的条带。纯化两个片段，以R1742和R1746为引物进行测序，发现与预期完全一致，即氯霉素抗性基因以及两侧1-SceI作用位点一个一段50bp同源片段得以去除，此时表明获得了 hsdR基因敲除的、无任何冗余片段的变株，其基因型为 BL21 (DE3) Δ hsdR, pTKRed。随后进行pTKRed的消除实验。将菌株所得菌株在无抗LB培养基中于37° C培养过夜后，稀释IO6后涂布LB平板，随后置于42° C培养箱进行高温处理。随机挑取25个克隆进行抗性验证，发现其中20个均失去了大观霉素抗性，表明pTKRed得以消除，将此菌株命名为LS1928，其基因型为BL21(DE3) Λ hsdR。BL21(DE3)基因组中hsdR基因敲除实验各菌株基因型验证的凝胶电泳结果如附图1所示。实施例3BL21 (DE3)和LS1928电转化效率的比较，质粒验证1.电转化效率的比较为验证BL21(DE3)及其hsdR基因敲除变株LS1928的电转化效率，分别将50ng的PLS1942质粒DNA转化这两个菌株，在含30 μ g/ml卡那霉素的LB固体平板上进行筛选，计算总的抗性菌落数。以每μ g的质粒DNA来计算转化效率，即转化效率=菌落数/ y gDNA。四次平行实验发现，hsdR基因敲除变株LS1928的平均转化效率为4.5χ107/μ g，而BL21 (DE3)原株的平均转化效率为3.1xlO6/Ug,即变株的转化效率提高了 14.5倍。2.质粒的酶切验证为验证转化质粒的正确性，自含pLS1942的克隆宿主菌DHlOB以及表达宿主菌BL21 (DE3)及其hsdR基因敲除变株LS1928分别提取pLS1942质粒进行酶切验证，结果见附图2所示。可见不同菌株来源所提取的质粒酶切后的带型一致，表明LS1928变株有着与原株一致的质粒扩增环境，hsdR基因敲除不产生影响。3.蛋白表达验证为验证pLS19 42可在hsdR基因敲除变株LS1928中表达，分别将pLS1942转化BL21 (DE3)和LS1928所得的单菌落接至2ml含30 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养过夜，以1/50比例转接至IOml相同的培养基振荡培养至0D600约0.6时，分别加入ImM IPTG于37° C诱导蛋白3小时。取Iml离心得到菌体，以300 μ I双蒸水进行悬浮，悬浮液组份即为总蛋白。取150μ I悬浮液超声破碎后，离心所得上清为可溶性蛋白。将各蛋白组份分别于100° C处理5分钟后，以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮色染色观察蛋白表达的情况。图3为BL21 (DE3)原株和hsdR基因敲除变株LS1928分别表达YihS蛋白的结果。由图可见，两个菌株中蛋白表达情形一致，表明hsdR基因敲除变株LS1928有着与原株BL21(DE3)相同的蛋白表达环境，hsdR基因敲除无影响。综上所述，hsdR基因敲除变株LS1928的转化效率较BL21 (DE3)提高14.5倍，而质粒酶切和蛋白表达的实验证明LS1928的其他功能与BL21 (DE3)保持一致，表明了 LS1928的适用性。
权利要求
1.一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株，其特征在于，是将大肠杆菌异源蛋白表达菌株BL21 (DE3)基因组中编码I型限制性内切酶的hsdR基因通过重组工程法敲除后而获得。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，是大肠埃希氏菌(Escherchiacoli)CGMCCN0.7123。
3.权利要求1所述高转化效率的大肠杆菌表达菌株的构建方法，是指通过重组酶催化PCR所获得的线性片段和基因组上的同源片段进行同源重组而敲除hsdR基因，随后由1-SceI催化的基因组双链断裂修复而去除抗性基因和1-SceI酶切位点。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述重组酶是指reda，red β和red Y这三个基因，重组酶基因是由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的受LacI基因所调节pLac启动子所驱动； 1-SceI基因是由L-阿拉伯糖诱导的受araC基因所调节的pBAD启动子所驱动。
全文摘要
本发明涉及一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株CGMCCNo.7123。该菌株是将大肠杆菌异源蛋白表达菌株BL21(DE3)基因组中编码I型限制性内切酶的hsdR基因通过重组工程法敲除后而获得。hsdR基因敲除后不携带任何外源碱基序列。该菌株的转化效率是BL21(DE3)原株的14.5倍。CGMCCNo.7123可成为通用的异源蛋白表达菌株以及直接用于筛选表达突变体库蛋白的菌株。
文档编号C12N15/70GK103215215SQ20131011953
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者尚广东, 石牡丹, 王瑞青, 李玲 申请人:南京师范大学