辅助鉴定h9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的引物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的引物组合物及其应用。本发明提供的特异引物对，由序列表的序列3所示单链DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA分子组成。本发明还保护一种引物组合物，由引物对甲和所述特异引物对组成；所述引物对甲由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成。本发明提供的特异引物对可鉴定鸡传染性支气管炎病毒，本发明提供的引物组合物结合双重RT-PCR可同时鉴定鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒，均具有灵敏度高、特异性强、普适性强、所需时间短、成本低等优点，可以对多种临床样本进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用。
【专利说明】辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的 引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的引物组 合物及其应用。
【背景技术】
[0002] H9亚型禽流感和鸡传染性支气管炎是目前危害我国养禽业的主要疫病。H9亚型 禽流感病毒可以感染多种禽和哺乳动物，并可导致禽类发病死亡，严重影响养禽业的健康 发展。鸡传染性支气管炎也是一种危害我国养禽业的重要传染病，病鸡主要表现呼吸道症 状。临床上两病症状相似，两种病毒感染均导致肉鸡生长缓慢和蛋鸡产蛋率下降，给养禽业 造成严重的经济损失。此外，H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒抗原特性的变异， 导致常规血清学方法无法检出流行毒株。因此，建立一种快速有效的鉴别两种病毒流行毒 株的诊断方法，对于及时采取有效控制措施和防止疫情扩散具有重要的意义。
[0003] 对于传统的检测方法，如病毒分离、气管环培养试验、血凝抑制试验、神经氨酸酶 试验等，费时、费力，不能做出快速而及时的诊断；而且不能在同一检测反应中检测不同的 对象，即无法同时进行鉴别诊断。由于变异株的出现，常常导致这些方法无法检出病毒，出 现漏检的情况。因此，建立一种能够快速鉴别诊断H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎 病毒，而且很好的覆盖当前流行毒株的检测方法非常重要。
[0004] 传统的流感病毒检测方法为采用鸡胚进行病毒分离培养(需时2-3天)，然后采用 血凝抑制试验进行流感病毒亚型的鉴定(需时1天)。鸡传染性支气管炎病毒检测方法通常 采用鸡胚进行病毒分离培养或者气管环组织培养这种传统的检测方法，其中利用鸡胚进行 病毒分离培养需要10天时间，而气管环组织培养技术难度比较大，操作不易。总之，传统的 检测方法具有费时、费力的弊端，难以做出快速而及时的诊断；而且不能在同一检测反应中 检测不同的对象，即无法同时进行鉴别诊断。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒 的引物组合物及其应用。
[0006] 本发明提供的特异引物对，由序列表的序列3所示单链DNA分子和序列表的序列 4所示单链DNA分子组成。
[0007] 本发明还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下 (a)或（b) : (a)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传 染性支气管炎病毒。所述待测样本可为鸡的肝、脑、肺等组织，也可为鸡的口腔拭子、泄殖腔 拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）或鸡 的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0008] 本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对；所述试剂盒的用途为如下（a) 或（b) : (a)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传染性 支气管炎病毒。所述待测样本可为鸡的肝、脑、肺等组织，也可为鸡的口腔拭子、泄殖腔拭子 等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）或鸡的内 脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0009] 本发明还保护一种辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括如下步骤：以待 测病毒的cDNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测病毒 为候选的鸡传染性支气管炎病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待测病毒为候选的非 鸡传染性支气管炎病毒。所述PCR扩增产物的大小为600-700bp，具体可为655bp。所述待 测病毒可为H9N2亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H4N6亚型禽流感病毒、H3N8亚 型禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒或新城疫病毒。所述方法为非疾病治 疗和诊断方法。
[0010] 本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传染性支气管炎病毒的方法， 包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR 扩增产物、待测样本疑似含有鸡传染性支气管炎病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待 测样本疑似不含有鸡传染性支气管炎病毒。所述PCR扩增产物的大小为600-700bp，具体 可为655bp。所述待测样本可为死亡的鸡的肝、脑、肺等组织，也可为死亡的鸡的口腔拭子、 泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺 等）或鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。所述方法为非疾病治疗和 诊断方法。
[0011] 本发明还保护一种引物组合物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序 列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成；所述引物对乙 由序列表的序列3所示单链DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA分子组成。
[0012] 本发明还保护所述引物组合物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下 (c)或（d) : (c)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒；（d)辅助鉴定待测 样本中是否含有鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒。所述H9亚型禽流感病毒具 体可为H9N2亚型禽流感病毒。所述待测样本可为鸡的肝、脑、肺等组织，也可为鸡的口腔拭 子、泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、 肺等）或鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0013] 本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组合物；所述试剂盒的用途为如下（c) 或（d): (c)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒；（d)辅助鉴定待测样本 中是否含有鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒。所述H9亚型禽流感病毒具体可 为H9N2亚型禽流感病毒。所述待测样本可为鸡的肝、脑、肺等组织，也可为鸡的口腔拭子、 泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺 等）或鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0014] 本发明还保护所述引物组合物对在辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽 流感病毒中的应用。应用所述引物对进行所述辅助鉴定时的方法如下：以待测病毒的cDNA 为模板，用所述引物组合物进行PCR扩增，如果得到600-700bp PCR扩增产物、待测病毒为 候选的鸡传染性支气管炎病毒，如果得到400-500bp PCR扩增产物、待测病毒为候选的H9 亚型禽流感病毒，如果均没有得到上述两种PCR扩增产物、待测病毒为候选的非鸡传染性 支气管炎病毒且非H9亚型禽流感病毒。所述600-700bp PCR扩增产物具体可为655bp。所 述400-500bp PCR扩增产物具体可为473bp。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2亚型 禽流感病毒。所述待测病毒可为H9N2亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H4N6亚型 禽流感病毒、H3N8亚型禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒或新城疫病毒。 所述应用中不包括疾病治疗和诊断方法。
[0015] 本发明还保护所述引物组合物对在辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传染性支气 管炎病毒和H9亚型禽流感病毒中的应用。应用所述引物对进行所述辅助鉴定时的方法如 下：以待测样本的cDNA为模板，用所述引物组合物进行PCR扩增，如果得到600-700bp PCR 扩增产物、待测样本疑似含有鸡传染性支气管炎病毒，如果得到400-500bp PCR扩增产物、 待测样本疑似含有H9亚型禽流感病毒，如果均没有得到上述两种PCR扩增产物、待测样本 疑似均不含有鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒。所述600-700bp PCR扩增产 物具体可为655bp。所述400-500bp PCR扩增产物具体可为473bp。所述H9亚型禽流感病 毒具体可为H9N2亚型禽流感病毒。所述待测样本可为死亡的鸡的肝、脑、肺等组织，也可为 死亡的鸡的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的 内脏组织(肝、脑、肺等）或鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。所述 应用中不包括疾病治疗和诊断方法。
[0016] 本发明提供的特异引物对可鉴定鸡传染性支气管炎病毒，具有灵敏度高、特异性 强、普适性强、所需时间短、成本低等优点，可以对多种临床样本(如临床采集的样品如口腔 拭子、泄殖腔拭子，病毒尿囊液等）进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用。
[0017] 本发明提供的引物组合物结合双重RT-PCR可同时鉴定鸡传染性支气管炎病毒和 H9亚型禽流感病毒，具有灵敏度高、特异性强、普适性强、所需时间短、成本低等优点，可以 对多种临床样本(如临床采集的样品如口腔拭子、泄殖腔拭子，病毒尿囊液等）进行检测，操 作简单、容易推广，便于基层操作和应用。
[0018] 本发明对于鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒的临床诊断和流行病控 制具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为引物对乙的特异性结果。
[0020] 图2为引物对甲和引物对乙的组合物的特异性结果。
[0021] 图3为引物对乙的灵敏度结果。
[0022] 图4为引物对甲和引物对乙的组合物的灵敏度结果。
[0023] 图5为引物对乙的普适性结果。
[0024] 图6为引物对甲和引物对乙的普适性结果。
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。以下实施例中，用于提取总RNA的试剂盒为Viral genome RNA rapid extraction Kit (名称：QIAamp Viral RNA Mini Kit)，厂家QIAGEN，货号52904。以下实施例中，用于 将总 RNA 反转录为 cDNA 的试剂盒为 The reverse transcription(RT)reaction (名称： RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)，厂家 Fermentas，货号 K1622。
[0026] H9N2 亚型禽流感病毒（H9N2influenza viruses):参考文献：Yipeng Sun，Juan Pu, Zhanlei Jiang，Tao Guan, Yingju Xia，Qi Xu，Linqing Liu, Bo Ma, Fulin Tian, E. G. Brown, Jinhua Liu. Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2influenza viruses in China froml994to2008, Veterinary Microbiologyl46(2010)215 - 225〇
[0027] H4N6亚型禽流感病毒：参考文献：李昀海，赵焕云，张文东，吕粵，岳亮，宋建领，范 泉水，张应国，张富强.云南2株H4N6亚型禽流感病毒株的分离与鉴定畜牧与兽医2011 年第43卷第6期。
[0028] H3N8 亚型禽流感病毒（H3N8influenza viruses):参考文献：Juan Pu，Qin-Fang Liu,Ying-Ju Xia, Yu-Lei Fan, Earl G.Brown, Fu-Lin Tian,Jin-Hua Liu.Genetic analysis of H3subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern China during2004 - 2005Virus Genes (2009)38:136 - 142〇
[0029] 传染性喉气管炎病毒：参考文献：谢菲，郝满良，王蔚宇，路卫星，王慎行，鸡传染 性喉气管炎人工模拟自然感染模型的建立，黑龙江畜牧兽医，2008年第5期。
[0030] 减蛋综合症病毒：参考文献：刘吉山，沈志强，王艳，李书光，肖跃强，乔建光， 减蛋综合症在樱桃鸭父母代中的流行病学调查.山东畜牧兽医.2010年第31期（总第166 期）。
[0031] 新城疫病毒：参考文献：张鹤晓，赖平安，高志强，刘环，刘继红，郭晋优，谷 强，张利峰，杨伟，李宁，荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究， 中国兽医杂志，2006年（第42卷）第3期。
[0032] 实施例1、特异引物对的设计
[0033] 设计一对用于鉴定H9亚型禽流感病毒的HA基因的引物对如下(将其命名为引物 对甲）：
[0034] H9-HA99F (序列表的序列 1) :5'-CATCGGCTACCAATCAACAAAC-3' ；
[0035] H9-HA571R (序列表的序列 2) :5' -GATTATTTGTGTATTGGGCGTC-3'。
[0036] 设计一对用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒的N基因的引物对如下(将其命名为引 物对乙）：
[0037] IB621F (序列表的序列 3) :5' -CAGGTAAAGGCGGAAGAAAAC-3 ;
[0038] IB1275R (序列表的序列 4) :5' -TGAAGCCCATCTGGTTGAAG-3'。
[0039] 实施例2、引物对的特异性检测
[0040] 一、引物对乙的特异性检测
[0041] 实验样本分别为：H4N6亚型禽流感病毒、H3N8亚型禽流感病毒、传染性喉气管炎 病毒、减蛋综合症病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒H120株和H9N2亚型禽流感病 毒。
[0042] 1、提取各个待测样本（即病毒浓度为106EID5Q/100y L的病毒液）的总RNA并反转 录为cDNA。
[0043] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0044] PCR 扩增的反应体系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、IB621F0. 5μ 1、 IB1275R0. 5 μ 1、cDNA2 μ 1，加双蒸水至 25 μ 1。
[0045] PCR 扩增的反应程序：94 °C 5min ;94 °C 45s、59 °C 45s、72 °C 2min，30 个循环； 72〇C lOmin ；4°C 10h〇
[0046] 3、将步骤1的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图1。图1中，1为 H4N6亚型禽流感病毒，2为H3N8亚型禽流感病毒，3为传染性喉气管炎病毒，4为减蛋综合 症病毒，5为新城疫病毒，6为鸡传染性支气管炎病毒H120株，7为H9N2亚型禽流感病毒， Μ 为 TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、 lOObp)。结果表明，鸡传染性支气管炎病毒样本在600-700bp之间显示特异条带，其他病毒 则无相应条带。回收所述特异条带并进行测序，为655bp。
[0047] 二、引物对甲和引物对乙的特异性检测
[0048] 实验样本分别为：鸡传染性支气管炎病毒H120株和H9N2亚型禽流感病毒的混合 物、H4N6亚型禽流感病毒、H3N8亚型禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒和 新城疫病毒。
[0049] 1、提取各个待测样本(待测样本为所述混合物或各个病毒的病毒液；对于所述 混合物来说，两种病毒的浓度均为106EID5(l/100yL;对于其他病毒液来说，病毒浓度为 106EID5Q/100 μ L的病毒液）的总RNA并反转录为cDNA。
[0050] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0051] PCR 扩增的反应体系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、IB621F0. 5μ 1、 IB1275R0. 5μ 1、H9-HA99F0. 5μ 1、H9-HA571R0. 5μ l、cDNA2y 1，加双蒸水至 25μ 1。
[0052] PCR扩增的反应程序同步骤一的2。
[0053] 3、将步骤1的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图2。图2中，1 为H4N6亚型禽流感病毒，2为H3N8亚型禽流感病毒，3为传染性喉气管炎病毒，4为减蛋综 合症病毒，5为新城疫病毒，6为鸡传染性支气管炎病毒H120株和H9N2亚型禽流感病毒的 混合物，Μ 为 TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp、100bp)。鸡传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒的混合物在600-700bp和 400-500bp之间各显示一条特异条带，其他病毒无该两条特异条带相应的条带。分别回收所 述两条特异条带并进行测序，分别为655bp和473bp。
[0054] 实施例3、引物对的灵敏度检测
[0055] 一、引物对乙的灵敏度
[0056] 1、分别提取病毒浓度为 105EID5Q/100 μ L、104EID5Q/100 μ L、103EID5Q/100 μ L、 102EID5(I/100 μ L或10EID5(I/100 μ L的鸡传染性支气管炎病毒Η120株的病毒液(按照病毒浓 度由高至低依次命名为病毒液A1、病毒液B1、病毒液C1、病毒液D1和病毒液E1)的总RNA 并反转录为cDNA。
[0057] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0058] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤一的2。
[0059] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤一的2。
[0060] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图3。图3中， 1至5依次代表病毒液A1、病毒液B1、病毒液Cl、病毒液D1和病毒液El，Μ为TransDNA Marker I (自上至下依次代表 70(^口、60(^口、50(^口、40(^口、30(^口、20(^口、10(^口）。结果表 明，102EID 5(l/100yL及以上的鸡传染性支气管炎病毒的病毒液进行以上步骤后均可在电泳 图中观察到600-700bp之间的特异条带。回收所述特异条带并进行测序，为655bp。
[0061] 二、引物对甲和引物对乙的灵敏度
[0062] 1、分别提取各个病毒液的总RNA并反转录为cDNA。
[0063] 病毒液B2 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒H120株和H9N2亚型禽流感病毒的病 毒液，鸡传染性支气管炎病毒H120株和H9N2亚型禽流感病毒的浓度均为10 4EID5(I/100 μ L。
[0064] 病毒液C2 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒Η120株和Η9Ν2亚型禽流感病毒的病 毒液，鸡传染性支气管炎病毒H120株和H9N2亚型禽流感病毒的浓度均为10 3EID5(I/100 μ L。
[0065] 病毒液D2 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒Η120株和Η9Ν2亚型禽流感病毒的病 毒液，鸡传染性支气管炎病毒Η120株和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 2EID5(I/100 μ L。
[0066] 病毒液Ε2 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒Η120株和Η9Ν2亚型禽流感病毒的病 毒液，鸡传染性支气管炎病毒Η120株和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10EID 5(I/100 μ L。
[0067] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0068] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0069] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤一的2。
[0070] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图4。图4中，1至4 依次代表病毒液B2、病毒液C2、病毒液D2和病毒液E2,Μ为TransDNA Marker I (自上至下 依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。结果表明，含 102EID5(I/100 μ L 及以上的鸡传染性支气管炎病毒Η120株和Η9Ν2亚型禽流感病毒的病毒液进行以上步骤后 均可在电泳图中观察到600-700bp和400-500bp之间的两条特异条带。分别回收所述两条 特异条带并进行测序，分别为655bp和473bp。
[0071] 实施例4、引物对的普适性
[0072] 鸡传染性支气管炎病毒Gray株、鸡传染性支气管炎病毒H120株、鸡传染性支气 管炎病毒H52株、鸡传染性支气管炎病毒M41株、鸡传染性支气管炎病毒Holte株、鸡传染 性支气管炎病毒LX4株、鸡传染性支气管炎病毒C 〇nn46/1996株均在如下文献中有记载： Jinling Feng, Yanxin Hu，Zhijun Ma，Qi Yu,Jixun Zhao, Xiaodong Liu,and Guozhong Zhang. Virulent Avian Infectious Bronchitis Virus，People' s Republic of China. Emerging Infectious Diseases. Vol. 18,No. 12,December2012〇
[0073] 鸡传染性支气管炎病毒毒株1 :鸡传染性支气管炎病毒Gray株。鸡传染性支气管 炎病毒毒株2 :鸡传染性支气管炎病毒H120株。鸡传染性支气管炎病毒毒株3 :鸡传染性支 气管炎病毒H52株。鸡传染性支气管炎病毒毒株4:鸡传染性支气管炎病毒Holte株。鸡 传染性支气管炎病毒毒株5 :鸡传染性支气管炎病毒M41株。鸡传染性支气管炎病毒毒株 6 :鸡传染性支气管炎病毒LX4株。鸡传染性支气管炎病毒毒株7 :鸡传染性支气管炎病毒 Conn46/1996株。鸡传染性支气管炎病毒毒株8 :2010年，从中国辽宁省具有发病表型的病 鸡体内分离得到。鸡传染性支气管炎病毒毒株9 :2010年，从中国山东省具有发病表型的病 鸡体内分尚得到的毒株。鸡传染性支气管炎病毒感染的病鸡的发病表型为呼吸困难、发出 罗音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏。
[0074] H9N2亚型禽流感病毒毒株1 :1997年，从中国香港具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株2 :1999年，从中国北京市具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株3 :2007年，从中国山东省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株4 :2007年，从中国河北省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。感染H9N2亚型禽流感病毒的病鸡的发病表型为：精神不振，或闭眼沉郁；采食和饮水 减少或废绝；张口呼吸，呼吸困难；拉黄白色稀便，较少的极绿色粪便，有时肛门处粘附淡 绿色或白色粪便。
[0075] -、引物对乙的普适性
[0076] 1、提取各个鸡传染性支气管炎病毒毒株的病毒液(病毒浓度为106EID 5(l/100y L) 的总RNA并反转录为cDNA。
[0077] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0078] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤一的1。
[0079] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤一的2。
[0080] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图5。图5中，泳道1 至9依次代表毒株1至9，M为TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、500bp、 400bp、300bp、200bp、100bp)。9株毒株经上述检测均可在电泳图中观察到600-700bp之间 的特异条带。回收所述特异条带并进行测序，均为655bp。结果表明，引物对乙的普适性很 好。
[0081] 二、引物对甲和引物对乙的普适性
[0082] 1、分别提取各个病毒液的总RNA并反转录为cDNA。
[0083] 病毒液A3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株1和H9N2亚型禽流感病毒毒株1 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0084] 病毒液Β3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株1和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株2 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0085] 病毒液C3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株1和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株3 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0086] 病毒液D3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株1和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株4 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0087] 病毒液Ε3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株2和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株1 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0088] 病毒液F3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株2和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株2 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0089] 病毒液G3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株2和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株3 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0090] 病毒液Η3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株2和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株4 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0091] 病毒液13 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株3和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株1 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0092] 病毒液J3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株3和H9N2亚型禽流感病毒毒株2 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0093] 病毒液Κ3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株3和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株3 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0094] 病毒液L3 :同时含有鸡传染性支气管炎病毒毒株3和Η9Ν2亚型禽流感病毒毒株4 的病毒液，鸡传染性支气管炎病毒和Η9Ν2亚型禽流感病毒的浓度均为10 6EID5(I/100 μ L。
[0095] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0096] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0097] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤一的2。
[0098] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图6。图6中，泳 道1至12依次代表病毒液A3至L3，Μ为TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp )。各个病毒液进行以上步骤后均可在电泳图中观 察到600-700bp和400-500bp之间的两条特异条带。分别回收所述两条特异条带并进行测 序，600-700bp之间的条带均为655bp，400-500bp之间的条带均为473bp。结果表明，两对 引物组成的引物组合物的普适性很好。
[0099] 实施例5、应用引物对检测临床样本的方法
[0100] -、样品的采集
[0101] 组织样品：病死或扑灭病禽，取肝、脑、肺等组织；
[0102] 棉拭子：口腔拭子、泄殖腔拭子。
[0103] 2-8°C保存，要求送检病料新鲜。
[0104] 二、样品处理
[0105] 1、组织样品处理
[0106] 称取待检病料100mg置研磨器中，加入0. 8ml裂解液(含硫氰酸胍0. 8M、硫氰酸铵 0. 4M、甘油5%、苯酚38%的0. 1M醋酸钠缓冲液）研磨，把研磨好的病料移至1. 5ml离心管 中，4°C、8000rpm离心5min，取250 μ 1上清，置于1. 5ml灭菌离心管中，加入750 μ 1裂解液， 剧烈振荡混匀，室温放置5min。
[0107] 2、棉拭子处理
[0108] 将棉拭子置于1. 5ml灭菌离心管中，加入0. 3ml PBS缓冲液，静置2小时以上，将 浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4°C、8000rpm离心5min，取250 μ 1上清液，置 于1. 5ml灭菌离心管中，加入750 μ 1裂解液，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
[0109] 3、阴性对照（RNase free 水）
[0110] 取灭菌双蒸水250μ 1，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μ 1裂解液，剧烈振荡混 勻，室温放置5min。
[0111] 三、应用引物对乙检测
[0112] 1、取步骤二得到的各个样本，分别提取总RNA并反转录为cDNA。
[0113] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用实施例1的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0114] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0115] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的1。
[0116] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行判定，如 出现600-700bp (具体为655bp)扩增带，表明样品中含有鸡传染性支气管炎病毒。
[0117] 四、应用引物对甲和引物对乙检测
[0118] 1、取步骤二得到的各个样本，分别提取总RNA并反转录为cDNA。
[0119] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对甲和引 物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0120] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0121] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤一的2。
[0122] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行判定，如 出现600-700bp和400-500bp (具体为473bp或655bp)的扩增带，表明样品中含有鸡传染 性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒。
【权利要求】
1. 特异引物对，由序列表的序列3所示单链DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA 分子组成。
2. 权利要求1所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下（a) 或（b) : (a)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传染性 支气管炎病毒。
3. -种试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对；所述试剂盒的用途为如下（a)或（b): (a)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传染性支气管 炎病毒。
4. 一种辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为 模板，用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测病毒为候 选的鸡传染性支气管炎病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待测病毒为候选的非鸡传 染性支气管炎病毒。
5. -种辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括如下步骤： 以待测样本的cDNA为模板，用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩 增产物、待测样本疑似含有鸡传染性支气管炎病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待测 样本疑似不含有鸡传染性支气管炎病毒。
6. 引物组合物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列表的序列1所示单 链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列表的序列3所 不单链DNA分子和序列表的序列4所不单链DNA分子组成。
7. 权利要求6所述引物组合物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下（c) 或（d): (c)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒；（d)辅助鉴定待测样本 中是否含有鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒。
8. -种试剂盒，包括权利要求6所述引物组合物；所述试剂盒的用途为如下（c)或（d): (c)辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒；（d)辅助鉴定待测样本中是否 含有鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒。
9. 权利要求6所述引物组合物对在辅助鉴定鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感 病毒中的应用。
10. 权利要求6所述引物组合物对在辅助鉴定待测样本中是否含有鸡传染性支气管炎 病毒和H9亚型禽流感病毒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104232624SQ201310230937
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】蒲娟, 刘金华, 魏延迪, 俞晨芳, 裴星瑶, 齐鲁, 张谞霄 申请人:中国农业大学