质谱法鉴别肉制品中动物源性成份的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测肉制品中动物源性的引物系统。该引物系统包括一对扩增引物和6条延伸引物，其中，扩增引物对序列选自SEQ?ID?No：1-2，延伸引物序列分别选自SEQ?ID?No：3-8。基于该引物系统所制备的产品，能鉴别肉制品中猪、牛、羊、鸡、鸭、兔源性成分。使用该产品，可以实现对肉制品来源进行鉴定，在打击食品掺假伪造、审核食品标签、保障消费者知情权等方面有重要作用。
【专利说明】质谱法鉴别肉制品中动物源性成份
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种用于鉴定肉制品中动物源性成分的检测方法及产品，具体而言是利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对猪、牛、羊、鸡、鸭、兔源性成分进行检测的方法及相应的试剂盒。
【背景技术】
[0002]肉制品是人类饮食中的重要食品，其含有优质蛋白和多种必须氨基酸，具有很高的营养价值。随着人们饮食结构的不断改变，增加了对肉类食品的需求，市场上出现了很多以次充好、假冒牛肉和羊肉的现象，例如，常见的使用鸡鸭猪肉充当羊肉，选用猪兔肉冒充牛肉，这严重损害了消费者的财务和健康状况。
[0003]另外，由于疯牛病、猪牛口蹄疫、禽流感等疾病的发病与流行，导致在特定时期内猪牛羊肉以及鸡鸭肉滞销。在该特定时期内，如果食品监管不力，容易发生不法商贩将滞销肉充当其它肉制品的事件。因此，需要严格限制食品中的动物源性成分。
[0004]此外，我国是一个多民族组成的国家，宗教习惯使人们的饮食有一定差异，对肉制品的选择具有一定的倾向性。例如:回族不吃猪肉。如果清真食品中掺有猪肉，会影响回族消费者的宗教信仰。同时，一些患病人群如高血压、脂肪肝等患者对肉类的选择具有一定特殊性。因此，食品中动物源性成分的鉴别已成为人们特别关注的问题。对肉制品中生物种属的鉴定在打击食品掺假伪造、审核食品标签、保障消费者知情权等方面有重要作用。
[0005]为了保护消费者的利益和进出口贸易的公平，对肉制品进行检测也具有一定的社会和经济意义。传统的肉制品检测采用形态学、免疫学方法，仅对生鲜肉具有一定的鉴别作用。但对经过加工处理的熟肉制品，由于其感官性状、蛋白质成分和其它免疫源性物质被破坏，使得传统的方法很难进行`准确的肉类品种鉴定，给肉制品的交易和进口带来了极大的不便。
[0006]中国专利申请200710175520.6、“鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂
盒及其应用”，该方法能够快速鉴别动物源性成分，但难以对肉制品中微量成分进行准确鉴定，且需要进行电泳凝胶判断结果，导致不够经济实用。
[0007]中国专利申请2012101870313、“特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法”公开了一种特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，其包括五组相互独立的A1-A5型反应液，该五组反应液可分别检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉和羊肉。然而，该方法需要对每组反应液设置2个梯度的扩增引物体系，同时每组涉及一组外引物和内引物以及一组环引物对，共计6种引物，且没有各组体系之间没有通用引物，因此导致整个过程设计繁琐、且引物之间相互干扰，从而从一定程度上影响了检测准确性。另外，该申请的实施例中只能同时检测两种肉制品，并不能同时检测两种以上的肉源。
[0008]中国专利申请200810243974.7、“一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中源性成分的方法”，涉及PCR法，通过设计特异性引物，进行PCR，根据扩增产物的大小及有无鉴定肉制品中动物源性成分。该方法过程需要进行大量的凝胶电泳，分析其凝胶图谱，整个过程较为繁琐，仍然停留在传统PCR检测技术。
【发明内容】
[0009]本发明原理在于:提供了一种联合PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，鉴定肉制品中动物源性成分的检测方案。其中:使用一对通用引物进行PCR扩增；在单碱基延伸过程中，对PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物延伸一个核苷酸；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测,通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质。
[0010]因此，本发明第一个目的是提供一种鉴定肉制品中动物源性成分的引物系统或引物组，其序列如表1所示。
[0011]
【权利要求】
1.一种检测肉制品中动物源性的引物系统，其特征在于该引物系统包括一对扩增引物和6条延伸引物，其中，扩增引物对序列选自SEQ ID No:1-2，延伸引物序列分别选自SEQID No:3-8，并且所述延伸引物分别对应于羊、牛、猪、鸡、鸭、兔。
2.权利要求1的引物系统，其中扩增引物序列为核心序列，其在5’端可包括保护5-15个碱基序列，优选为IObp的tag:ACGTTGGATG。
3.权利要求1的引物系统，其中延伸引物5’端可增加作为接头的碱基序列，其中优选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。
4.由权利要求1至3的引物系统所制备的用于鉴定肉制品中动物源性成分的检测产品，其中所述动物源性成分为羊、牛、猪、鸡、鸭、兔。
5.权利要求4的检测产品，其中产品为检测试剂盒，包括: (1)用于PCR的反应试剂，包括:上述扩增引物对，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs,PCR反应缓冲液； (2)用于PCR产物纯化的试剂； (3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括:延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
6.权利要求5的检测产品，其中试剂盒还可包括:阴性质控品，阳性质控品，纯化用树月旨，点样及质谱检测用靶片，外切酶，基因组DNA提取试剂等试剂；和/或 用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。
7.使用权利要求1-3的引物系统，或权利要求4-6的产品来检测肉制品中动物源性成分的方法，包括: (1)PCR扩增:使用通用PCR引物进行扩增，得到PCR产物； (2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰； (3)单碱基延伸:使用6条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物延伸一个核苷酸； (4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响； (5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。
8.权利要求7的方法，其中步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。
9.权利要求1-3的引物系统，或权利要求4-6的产品，在鉴定肉制品中动物源性成分的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述动物源性成分为羊、牛、猪、鸡、鸭、兔。
【文档编号】C12Q1/68GK103805703SQ201410050178
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2014年2月13日
【发明者】马庆伟, 张海燕, 钟逾, 黎大洪, 向华, 林燕, 刘杰 申请人:向华